TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ERGEBNISSE Rhodamin 123 aus den Zellen transportiert. Ausnahme bildeten die GPNT-Zellen, in denen keine induzierende Wirkung nach Dexamethason nachgewiesen werden konnte. 5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität Zu Beginn der Versuche wurden zunächst Pgp-Induktoren in den hCMEC/D3- Zellen getestet. Dies diente dazu, geeignete Substanzen zu finden, die für den Kumulations-Assay sensitiv genug sind und zusammen mit dem spezifischen Pgp- Inhibitor Tariquidar zur Überprüfung der Sensitivität des Kumulations-Assays eingesetzt werden können. Nachdem die Auswahl eines Pgp-Substrats erfolgt war, wurden hCMEC/D3-Zellen hinsichtlich der Auswirkungen bekannter Pgp-Induktoren untersucht. Zunächst wurde der Pgp-Induktor Dexamethason (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a) in verschiedenen Konzentrationen getestet. Die nachfolgenden Graphen zeigen exemplarisch die Effekte in den Kumulations-Assays. Tariquidar ist als Kontrolle zur Überprüfung des Assays angezeigt. Da die Ergebnisse für Dexamethason nicht eindeutig waren, wurden weitere Konzentrationen sowie andere bekannte Pgp-Induktoren wie die Zytostatika Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin getestet. 68
Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protein) ERGEBNISSE A 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC/D3 P:30 n=4 Dex 1 µM * TQD 0,5 µM B 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC/D3 P:31 n=3 * Dex 1 µM * TQD 0,5 µM C 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC/D3 P:36 n=3 Dex 20 µM * TQD 0,5 µM D Kontrolle hCMEC/D3 P:35 n=3 150000 * 100000 70000 60000 50000 40000 p=0,0881 30000 20000 10000 0 Dex 5 µM Dex 10 µM Puro 0,5 µM TQD 0,5 µM E 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC P:32 n=3 Puro 0,5 µM * TQD 0,5 µM F 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC P:31 n=6 Puro 1 µM * * Vin 20 nM * TQD 0,5 µM G 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle Dex 1 µM hCMEC/D3 P:32 n=3 * * * Dex 5 µM Dex 10 µM Rif 20 µM * Puro 1 µM * TQD 0,5 µM H 150000 100000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Kontrolle hCMEC/D3 P:39 n=3 Dox 0,23 µM Rif 2,5 µM Abbildung 5.5: Kumulation des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 nach Behandlung mit den Pgp-Induktoren Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin, Vincristin und dem Pgp- Inhibitor Tariquidar in acht unabhängigen Versuchen in hCMEC/D3-Zellen. Tariquidar führte in allen Versuchen zur signifikanten Erhöhung der Kumulation. Dexamethason und Rifampicin zeigten inkonsistente Effekte. Doxorubicin führte in der gewählten Konzentration nicht zu einer Induktion des Efflux. Puromycin (1 µM) und Vincristin induzierten den Efflux, der Rhodamin- Gehalt war im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen reduziert. Die Zellen wurden ab dem 3. Tag der Konfluenz über 72 h mit den Induktoren behandelt. Tariquidar wurde erst zu Beginn des Versuchs einer Gruppe von unbehandelten Zellen zugefügt. Die Versuche wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Versuche 69
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Rhodamin 123 aus den Zellen transportiert. Ausnahme bildeten die GPNT-Zellen, in<br />
denen keine induzierende Wirkung nach Dexamethason nachgewiesen werden<br />
konnte.<br />
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Zu Beginn der Versuche wurden zunächst Pgp-Induktoren in den hCMEC/D3-<br />
Zellen getestet. Dies diente dazu, geeignete Substanzen zu finden, die für den<br />
Kumulations-Assay sensitiv genug sind und zusammen mit dem spezifischen Pgp-<br />
Inhibitor Tariquidar zur Überprüfung der Sensitivität des Kumulations-Assays<br />
eingesetzt werden können. Nachdem die Auswahl eines Pgp-Substrats erfolgt war,<br />
wurden hCMEC/D3-Zellen hinsichtlich der Auswirkungen bekannter Pgp-Induktoren<br />
untersucht. Zunächst wurde der Pgp-Induktor Dexamethason (LÖSCHER &<br />
POTSCHKA 2005a) in verschiedenen Konzentrationen getestet. Die nachfolgenden<br />
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Da die Ergebnisse für Dexamethason nicht eindeutig waren, wurden weitere<br />
Konzentrationen sowie andere bekannte Pgp-Induktoren wie die Zytostatika<br />
Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin getestet.<br />
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