TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ERGEBNISSE 5 ERGEBNISSE 5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen Für die Charakterisierung der humanen Zellen wurden u.a. die Zellgröße und die Zellzahl bestimmt. Dazu wurden die ebenfalls immortalisierten Rattenhirnendothelzelllinien GPNT und RBE4 kultiviert. Diese wurden in früheren Versuchen der hiesigen Arbeitsgruppe bereits charakterisiert und wurden für vergleichende Untersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen herangezogen. Dazu wurden alle drei Zelllinien über 3 Passagen kultiviert, auf 6Well-Platten ausgesät und am 5. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die Bilder und die anschließende Zellzählung verwendet. Die Zellzählung wurde dabei wie in Abschnitt 4.3.2 (S. 54 f.) beschrieben durchgeführt. Abbildung 5.1: Bilder der humanen hCMEC/D3-Zellen (A) im Vergleich mit den Rattenhirnkapillarendothelzelllinien GPNT (B) und RBE4 (C). Die Bilder wurden mit einer 200x Vergrößerung aufgenommen. Die GPNT- und RBE4-Zellen sind kleiner und weisen auf der gleichen Fläche eine etwa 2,5-mal höhere Zellzahl/ml auf als die humanen Zellen (A). Die humanen Zellen waren nach diesen Bildern durchschnittlich etwa 40-50 µm groß und damit etwa doppelt so groß wie die Zellen der Rattenzelllinie GPNT. Die GPNT-Zellen zeigten eine rundere Form als die anderen beiden Zelllinien. Beide Rattenzelllinien (GPNT und RBE4-Zellen) zeigten im Gegensatz zu den hCMEC/D3- Zellen auf der gleichen Fläche (A = 9,6 cm 2 ) dichter gepackte Zellen. Dies wurde zusammen mit den Unterschieden in der Zellgröße mit Hilfe der Zellzahlbestimmung 62
ERGEBNISSE bestätigt. Die kleineren Rattenzellen zeigten auf der gleichen Fläche eine ca. 2,5-mal höhere Zellzahl als die humanen Zellen. 5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen Die Bestimmung der Expression des MDTs Pgp in hCMEC/D3-Zellen erfolgte mit der Methode des Western Blots. Der Nachweis wurde mittels eines Protokolls durchgeführt, das in der hiesigen Arbeitsgruppe für Pgp etabliert wurde und im Detail im Anhang (siehe S. 218 ff.) nachzulesen ist. Für die Untersuchung der Pgp- Expression wurden vergleichende Western Blots mit den immortalisierten Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 durchgeführt. Bei allen drei verwendeten Zelllinien hCMEC/D3, GPNT und RBE4 wurden die Pgp-Signale, die sich bei etwa 170 kDa befanden, und Signale für ß-Aktin bei ca. 42 kDa gemeinsam ausgewertet. Für die statistische Auswertung der Expression von Pgp wurden die Signale, die mittels Antigen-Antikörperbindung detektiert werden konnten, auf ß-Aktin normiert. RBE4- und GPNT-Zellen wurden in den Western Blots mitgeführt, um zu überprüfen, ob in den Kumulations-Assays ein unterschiedliches Ausmaß des Rhodamin-Efflux durch Pgp (siehe Abschnitt 5.1.3.1, Abbildung 5.4) auf die Expression dieses MDTs zurückgeführt werden kann. Mit Hilfe der Western Blots konnte gezeigt werden, dass die GPNT-Zellen die stärkste Pgp-Expression aufwiesen. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen exprimierten signifikant weniger Pgp im Vergleich zu GPNT-Zellen. 63
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ERGEBNISSE<br />
bestätigt. Die kleineren Rattenzellen zeigten auf der gleichen Fläche eine ca. 2,5-mal<br />
höhere Zellzahl als die humanen Zellen.<br />
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen<br />
Die Bestimmung der Expression des MDTs Pgp in hCMEC/D3-Zellen erfolgte<br />
mit der Methode des Western Blots. Der Nachweis wurde mittels eines Protokolls<br />
durchgeführt, das in der hiesigen Arbeitsgruppe für Pgp etabliert wurde und im Detail<br />
im Anhang (siehe S. 218 ff.) nachzulesen ist. Für die Untersuchung der Pgp-<br />
Expression wurden vergleichende Western Blots mit den immortalisierten<br />
Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 durchgeführt. Bei allen drei<br />
verwendeten Zelllinien hCMEC/D3, GPNT und RBE4 wurden die Pgp-Signale, die<br />
sich bei etwa 170 kDa befanden, und Signale für ß-Aktin bei ca. 42 kDa gemeinsam<br />
ausgewertet. Für die statistische Auswertung der Expression von Pgp wurden die<br />
Signale, die mittels Antigen-Antikörperbindung detektiert werden konnten, auf ß-Aktin<br />
normiert.<br />
RBE4- und GPNT-Zellen wurden in den Western Blots mitgeführt, um zu<br />
überprüfen, ob in den Kumulations-Assays ein unterschiedliches Ausmaß des<br />
Rhodamin-Efflux durch Pgp (siehe Abschnitt 5.1.3.1, Abbildung 5.4) auf die<br />
Expression dieses MDTs zurückgeführt werden kann. Mit Hilfe der Western Blots<br />
konnte gezeigt werden, dass die GPNT-Zellen die stärkste Pgp-Expression<br />
aufwiesen. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen exprimierten signifikant weniger Pgp im<br />
Vergleich zu GPNT-Zellen.<br />
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