TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
4.5 Quantifizierung der Substanzen
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader
Bei der Substanz Rhodamin 123 handelt es sich um einen
Fluoreszenzfarbstoff. Die Quantifizierung des Farbstoffs erfolgte mittels
Fluoreszenzmessgerät und der OPTIMA Control Software (BMG Labtech GmbH,
Offenburg). Die Proben der Zelllysate und des Mediums wurden mit einem Volumen
von 50 bzw. 100 µl pipettiert und bis zur Messung abgedeckt bei RT gelagert. Die
Messung erfolgte nach einer Anregung des Rhodamins 123 bei 485 nm und einer
Emission bei 520 nm. Die Daten für die Kumulations-Assays wurden zusätzlich auf
den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe Abschnitt 4.3.1).
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter
Die Substanzen Digoxin und Verapamil waren [ 3 H]-markiert, Mannitol [ 14 C]-
markiert. Auf diese Weise konnten die Substanzen mittels der Messung des
radioaktiven Zerfalls im β-Szintillations-Counter (Liquid Scintillator System LS 5000
TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) quantifiziert werden. Dazu wurden 40 μl der
Medium- oder Zelllysat-Proben der Kumulations- und Transport-Assays in
Szintillationsröhrchen pipettiert und mit 4,5 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt. Die
Proben wurden bis zur Messung etwa eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In
Abhängigkeit vom radioaktiven Isotop erfolgte die Messung der Zerfallsraten mit dem
entsprechenden Programm im β-Counter. Die Daten für die Kumulations-Assays
wurden zusätzlich auf den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe
Abschnitt 4.3.1).
4.6 Auswertung der Daten und Statistik
Sofern nicht anders angezeigt, wurden alle Einzelversuche mit einer
Mindestgruppengröße von n=3 durchgeführt. Sämtliche Berechnungen der
Substratkonzentrationen in den Zellen, der Transportraten und des Proteingehalts
erfolgten mit dem Programm Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim).
Die Daten der Kumulations-Assays sind für alle verwendeten Zelllinien neben
bespielhaften Einzelversuchen auch in einer Zusammenfassung aller Versuche
dargestellt. Die Ergebnisse der Einzelversuche wurden als DPM/mg Protein bzw. als
Fluoreszenz/mg Protein angegeben. Für die zusammenfassende Gesamtdarstellung
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