TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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MATERIAL UND METHODEN getesteten Substanzen wurde nach ARTURSSON (1990) berechnet und in nm/s angegeben. Gleichung nach ARTURSSON: P app [nm/s] = dQr/dt A x C 0 x 60 dQr/dt (DPM/min): Steigung der Konzentration über die Zeit in der beprobten Kammer A: die Wachstumsfläche der Monolayer C 0 : Initialkonzentration der Substanz zum Zeitpunkt t=0 Der Quotient der Koeffizienten Papp (b-A) und Papp (a-B) entsprach der Transportratio (TR) einer Substanz. Man spricht von Transport, wenn TR > 1,5 ist. Ein spezifischer Inhibitor sollte eine deutliche Verminderung der TR im Vergleich zu den Zellen ohne Inhibitor zeigen. Durchführung des Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assays Mit den Pgp-Substraten Digoxin, Rhodamin 123 und Verapamil wurden ebenfalls Konzentrationsgleichgewichts-Assays (CETA) durchgeführt, um die Eignung der Zelllinie hCMEC/D3 und der primären rBCEC für Transportversuche festzustellen. Die Aussaat und Kultivierung erfolgte wie bereits beschrieben. Der CETA wurde 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Vorinkubation und Messung der TEER-Werte erfolgte genauso wie für den bidirektionalen Transport-Assay. Im Unterschied zum bidirektionalen Transport-Assay, wurden die Testsubstanzen in die apikale sowie in die basolaterale Kammer gegeben. Die Initialkonzentrationen der beiden Kammern waren gleich. Die Proben wurden zunächst der basolateralen Kammer entnommen (100 µl), anschließend der apikalen Kammer mit einem Volumen von 130 μl. Die Versuchsdauer betrug auch hier maximal 360 min. Abhängig von der Quantifizierungs-Methode des Substrats wurden die Proben entweder direkt auf schwarze 96Well-Platten pipettiert oder in 1,5 ml- Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bis zur Aufbereitung bei +4 °C gelagert. Die Daten wurden sowohl für die apikale als auch die basolaterale Kammer in Prozent der Initialkonzentration über die Zeit dargestellt (LUNA-TORTÓS et al. 2008). Für die Bestimmung des Transports wurden die Mengen der Substanz in der apikalen mit der in der basolateralen Kammer verglichen. Es wurde von Transport 58
MATERIAL UND METHODEN einer Substanz ausgegangen, wenn der Gehalt dieser in den beiden Kammern zu den einzelnen Zeitpunkten signifikant verschieden war. Für die Überprüfung des Transports wurden spezifische Inhibitoren eingesetzt, die den Transport hemmen sollten. Für die Beschreibung des Transports bzw. der Inhibition wurde die Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) des Konzentrationsanstiegs in der apikalen Kammer in Prozent gegen die Zeit über der Initialkonzentration berechnet. Die AUC des nachgewiesenen Transports wurde mit der AUC der Zellen mit spezifischem Inhibitor verglichen. Ein Transport wurde als spezifisch bewertet, wenn die AUC/h nach Zugabe des Inhibitors um > 50 % abnahm. 4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot Diese Methode dient der Detektion einzelner Proteine aus einem Proteingemisch aus Zellen oder Geweben. Bei Western Blot-Analysen werden elektrophoretisch aufgetrennte Proteine aus dem Trenngel auf einen geeigneten Träger übertragen. Die Bindung der Proteine an eine Membran, i.d.R. Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF), erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken. Dabei bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten und einzelne Proteine können über das Prinzip der Antigen-Antikörper- Bindung detektiert werden. Mit Hilfe des Western Blots ist es möglich, Aussagen über die Expression gesuchter Proteine zu treffen. Mit dem Western Blot wurde die Expression von Pgp in den genannten Zelllinien und Primärkulturen nachgewiesen. Neben dem gesuchten Protein Pgp wurde in allen Proben die Expression von ß-Aktin bestimmt. Das Strukturprotein ß- Aktin gehört zu den häufigsten Proteinen und kommt in allen eukaryotischen Zellen vor. Das Protein ß-Aktin diente als Housekeeper für die Normierung der Pgp- Expression. Housekeeper sind Proteine, die an den grundlegenden Zellprozessen beteiligt sind und in gleichem Ausmaß in allen Zellen der Kultur exprimiert werden. So können Aussagen darüber getroffen werden, ob der Gesamtproteingehalt einer Probe oder allein der Pgp-Gehalt in den Zellen verändert ist. Für den Western Blot wurden 15-40 µg Proteinlysat pro Probe eingesetzt. Die Herstellung der Proteinlysate, die Vorbereitung der Proben sowie die weitere Beschreibung und Durchführung sind im Anhang (siehe S. 218 ff.) einzusehen. 59
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MATERIAL UND METHODEN<br />
getesteten Substanzen wurde nach ARTURSSON (1990) berechnet und in nm/s<br />
angegeben.<br />
Gleichung nach ARTURSSON:<br />
P app [nm/s]<br />
=<br />
dQr/dt<br />
A x C 0 x 60<br />
dQr/dt (DPM/min): Steigung der Konzentration über die Zeit in der beprobten Kammer<br />
A: die Wachstumsfläche der Monolayer<br />
C 0 : Initialkonzentration der Substanz zum Zeitpunkt t=0<br />
Der Quotient der Koeffizienten Papp (b-A) und Papp (a-B) entsprach der<br />
Transportratio (TR) einer Substanz. Man spricht von Transport, wenn TR > 1,5 ist.<br />
Ein spezifischer Inhibitor sollte eine deutliche Verminderung der TR im Vergleich zu<br />
den Zellen ohne Inhibitor zeigen.<br />
Durchführung des Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assays<br />
Mit den Pgp-Substraten Digoxin, Rhodamin 123 und Verapamil wurden<br />
ebenfalls Konzentrationsgleichgewichts-Assays (CETA) durchgeführt, um die<br />
Eignung der Zelllinie hCMEC/D3 und der primären rBCEC für Transportversuche<br />
festzustellen. Die Aussaat und Kultivierung erfolgte wie bereits beschrieben. Der<br />
CETA wurde 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Vorinkubation<br />
und Messung der TEER-Werte erfolgte genauso wie für den bidirektionalen<br />
Transport-Assay. Im Unterschied zum bidirektionalen Transport-Assay, wurden die<br />
Testsubstanzen in die apikale sowie in die basolaterale Kammer gegeben. Die<br />
Initialkonzentrationen der beiden Kammern waren gleich. Die Proben wurden<br />
zunächst der basolateralen Kammer entnommen (100 µl), anschließend der apikalen<br />
Kammer mit einem Volumen von 130 μl. Die Versuchsdauer betrug auch hier<br />
maximal 360 min. Abhängig von der Quantifizierungs-Methode des Substrats wurden<br />
die Proben entweder direkt auf schwarze 96Well-Platten pipettiert oder in 1,5 ml-<br />
Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bis zur Aufbereitung bei +4 °C gelagert.<br />
Die Daten wurden sowohl für die apikale als auch die basolaterale Kammer in<br />
Prozent der Initialkonzentration über die Zeit dargestellt (LUNA-TORTÓS et al.<br />
2008). Für die Bestimmung des Transports wurden die Mengen der Substanz in der<br />
apikalen mit der in der basolateralen Kammer verglichen. Es wurde von Transport<br />
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