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MATERIAL UND METHODEN
apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (P app ) für Mannitol von der
basolateralen in die apikale Kammer (b-A) von 12 nm/s (nach LUNA-TORTÓS et al.
2008) nicht überschreiten, wobei sich die Einheit aus dem Bezug zur
Wachstumsfläche der Monolayer ergibt. In einigen Transportversuchen wurde die
Permeabilität für Mannitol nicht über die gesamte Versuchsdauer untersucht. Die
Zellen wurden stattdessen am Ende des Versuchs für 60 min mit Mannitol inkubiert.
Anschließend wurde eine Probe entnommen. Eine Berechnung der Steigung ist aus
diesem Grund nicht möglich, weshalb die Angabe für Mannitol dann in %/h erfolgte.
Bei dieser Variante des Transport-Assays wird die Testsubstanz lediglich in
eine der beiden Kammern appliziert. Wurden Inhibitoren mitgeführt, wurden diese in
beide Kammern eingefüllt, dementsprechend wurde das gleiche Volumen des
jeweiligen Lösungsmittels in die Kammern ohne Inhibitor gegeben. Die Entnahmen
der Proben erfolgten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und sind in den Ergebnissen
widergegeben. Die Versuchsdauer betrug aber für die meisten Transport-Assays
entweder 240 oder 360 min, mindestens aber 120 min. Das Probenvolumen für das
6Well-Format betrug immer 100 µl, wobei aus den jeweils kontralateralen Kammern
Ausgleichsvolumina entnommen wurden (apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl). Auf diese
Weise wurden die Flüssigkeitsstände der beiden Kammern gleichgehalten, um den
Druck auf die Zellen zu vermindern. Mannitol hingegen wurde lediglich in die
basolaterale Kammer gegeben, Proben wurden der apikalen Kammer entnommen.
Wenn die Testsubstanzen fluoreszenz-markiert waren, wurde diese direkt zur
Probenentnahme auf eine schwarze 96Well-Platte pipettiert. Handelte es sich um
radioaktiv-markierte Substanzen wurden die Proben in 1,5 ml Eppendorf-Gefäße
pipettiert und bis zur Vorbereitung für die Messung im Szintillationscounter (Liquid
Scintillator System LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) bei +4 °C
gelagert.
Nach Entnahme der letzten Proben wurden die Monolayer erneut
mikroskopisch untersucht und der TEER bestimmt. Sofern radioaktiv markierte
Substanzen eingesetzt wurden, wurde das Medium in entsprechende Behältnisse
umgefüllt und entsorgt.
Die Darstellung der Substanz-Konzentrationen in beiden Kammern erfolgte in
Prozent. Die initiale Konzentration entspricht dabei 100 %. Die Permeabilitäten (P app )
von der basolateralen in die apikale Kammer (b-A) und umgekehrt (a-B) für die
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