TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
Zellsuspension, 120 µl des jeweiligen Kulturmediums und 40 µl Trypanblau
verwendet wurden. Trypanblau hat die Eigenschaft, tote Zellen aufgrund nicht mehr
intakter Zellmembranen blau zu färben und macht es somit möglich, lebende und
tote Zellen voneinander zu unterscheiden. Pro Probe wurden 6 Großquadrate (vier
diagonale und 2 an den gegenüber liegenden Ecken) ausgezählt, dabei wurden
ausschließlich vitale Zellen gezählt. Die Zellzahl/ml wurde mit nachfolgender
Gleichung bestimmt:
gezählte Zellzahl
Zellzahl/ml = x Verdünnungsfaktor (5) x Kammerfaktor (5000)
Anzahl ausgezählter Quadrate
Die Aussaat der hCMEC/D3-Zellen erfolgte mit einer Zellzahl von 50.000
Zellen/cm 2 in einem Volumen von 0,5 ml bzw. 1,5 ml (12Well- bzw. 6Well-Format).
Bei den Primärzellen war die Anzahl der Wells und damit der Umfang des Versuchs
von der Zahl der präparierten Tiere abhängig. Die Zellen, die aus fünf bis sechs
Tieren gewonnen wurden, reichten für 18-24 12Well-Inserts. Die Volumina zur
Aussaat waren die gleichen. Die Zellen bildeten i.d.R. 1–2 Tage nach der Aussaat
konfluente Monolayer und wurden 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz für
Transport-Assays eingesetzt.
Am folgenden Tag wurde die Konfluenz der Zellmonolayer auf den
transparenten Inserts beurteilt und die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen, wobei
nicht angeheftete Zellen entfernt wurden. Alle 2-3 Tage fand ein Mediumswechsel
statt. Um das Ablösen der Zellen durch den Druck der Flüssigkeiten zu vermeiden,
wurde dazu zunächst das Medium der basolateralen Kammer abgesaugt,
anschließend in der apikalen Kammer. Die Zugabe frischen Mediums erfolgte in
derselben Reihenfolge.
Für Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode
wurden die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen auch mit Astrozyten der Ratte kokultiviert.
Dazu wurden zunächst die Astrozyten für die Kontakt-Kokultur auf den Unterseiten
der Membraneinlagen kultiviert. Nach Anheftung dieser Zellen wurden diese noch für
2-3 Tage allein kultiviert. Anschließend erfolgte die Aussaat der
Hirnkapillarendothelien auf der apikalen Seite der Membran. Die Endothelzellen und
Astrozyten wurden mit ihrem jeweiligen Medium kultiviert, auch wenn durch die
Membran eine Vermischung bzw. Verdünnung des jeweiligen Kulturmediums und
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