TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
Bestimmung der Proteinkonzentration
Der Proteingehalt der Zellen wurde mit Hilfe des Bicinchonsäure-Assays
(Bicinchonicic Acid BCA, Thermo Scientific, Rockford, USA) ermittelt. Dieser beruht
ähnlich wie der Bradford-Assay auf der kolorimetrischen und quantitativen Messung
der Proteinmenge. Dazu wird sich ebenfalls die Biuret-Reaktion zunutze gemacht,
die auf der Reduktion von Kupfer-Ionen in alkalischer Lösung beruht (Cu 2+ Cu + ).
BCA ist ein Chelatbildner. Bei der Bindung von zwei BCA-Molekülen um ein Cu + -Ion
kommt es zu einer Violettfärbung. Dies ist ein wasserlöslicher Komplex, der die
stärkste Absorption bei 562 nm aufweist.
Als Standard für die Ermittlung der Proteinkonzentration der Proben wurde
BSA verwendet. Aus verschiedenen Konzentrationen an BSA-Lösungen wurde eine
Eichkurve erstellt. Standardmäßig wurden alle Proben einmal unverdünnt und 1:2
verdünnt mit einem Volumen von 10 µl auf eine 96Well-Platte aufgetragen. Die
Reaktionslösung aus Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung wurde auf jede
Standardkonzentration und jede Probe aufgetragen (à 200 µl) und für 30 min bei
37 °C dunkel inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte.
Nach Ermittlung der Eichkurve wurden die Konzentrationen der Proben anhand der
Kurve berechnet und in mg/ml angegeben.
Berechnung des Substratgehalts der Proben
Nach der Berechnung der Proteinkonzentration wurde der Substratgehalt auf
diese bezogen. Der Zellinhalt wurde analysiert und die erhaltenen Werte für das
Substrat 3 H-Digoxin als DPM/mg Protein (decays per minute; Zerfallsrate, bezogen
auf den Proteingehalt) und für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als
Fluoreszenz/mg Protein angegeben.
4.3.2 Transport-Assay
Aussaat der Zellen
Die Zellen wurden für Transportversuche auf Polyester- oder Polycarbonat-
Membranen der Hersteller Corning Costar Corporation (Transwell ® ) und Greiner Bio-
One GmbH (ThinCerts ® ) kultiviert. Eine Übersicht einzelner Parameter wie
Porengröße und dergleichen sind der Tabelle 4.2 zu entnehmen. Die Membran-
Inserts der Multiwell-Platten unterteilen die Zellkulturschalen in eine apikale und eine
basolaterale Kammer (siehe Abschnitt 2.8.2, Abbildung 2.5, S. 33) und erlauben so
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