TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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MATERIAL UND METHODEN Die Dauer der Behandlung betrug 3 Tage. Dabei wurde täglich immer zum gleichen Zeitpunkt das Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem Medium, welches die für die jeweilige Behandlungsgruppe bestimmte Substanz enthielt, versorgt. Die Kontrollgruppen wurden stets nur mit Medium ohne weitere Zusätze behandelt. Ausnahmen bildeten Versuche, bei denen im Kontrollmedium die Vehikel (z.B. Ethanol) der zu testenden Antiepileptika oder auch Induktoren mitgeführt wurden. Wenn zwischen den Kontrollen keine Unterschiede nachweisbar waren, wurden diese Kontrollgruppen in der Statistik zusammen ausgewertet. DMSO wurde als Lösungsmittel für die einzelnen Substanzen vermieden, da es ab einem längeren Behandlungszeitraum induzierend auf die Pgp-Expression wirkt (AMBROZIAK et al. 2010). Durchführung des Kumulations-Assays Im Anschluss an die Behandlungsdauer der Zellen (i.d.R. 6 Tage nach Erreichen der Konfluenz) und nach mikroskopischer Kontrolle der Zellen wurden diese für den Kumulationsversuch auf ein serumfreies Medium umgestellt (Opti- MEM ® ), um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verhindern. Dazu wurde das Behandlungsmedium entfernt und die Zellen für eine Stunde mit Opti- MEM ® mit und ohne den spezifischen Pgp-Inhibitor Tariquidar (0,5 µM) auf einem Schüttler inkubiert. Tariquidar sollte in Zellen, die funktionelles Pgp exprimieren, zur Inhibition dieses Transporters und somit zu einem erhöhten Gehalt des eingesetzten Substrats in den Zellen führen. Nach Ablauf dieser Vorinkubation wurde das Medium abgesaugt und durch Medium mit dem Pgp-Substrat ( 3 H-Digoxin oder Rhodamin 123) ersetzt und für weitere 2 Stunden inkubiert. In dieser Zeit konnte das Substrat in Abhängigkeit von der Pgp-Funktionalität unter Behandlung in die Zellen gelangen und dort verbleiben. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde der Versuch durch Absaugen des Mediums und Waschen mit eiskaltem PBS zügig abgestoppt. Die Zellen wurden dann von den Wells geschabt, mit Lysispuffer (Zusammensetzung siehe Anhang S. 213) aufgeschlossen und nach Zentrifugation der Messung zugeführt. Abhängig vom Substrat wurde der Zellinhalt mit einem Szintillationszähler (Liquid Scintillator System LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) oder Fluoreszenzmessgerät (BMG Labtech GmbH, Offenburg) gemessen. 52
MATERIAL UND METHODEN Bestimmung der Proteinkonzentration Der Proteingehalt der Zellen wurde mit Hilfe des Bicinchonsäure-Assays (Bicinchonicic Acid BCA, Thermo Scientific, Rockford, USA) ermittelt. Dieser beruht ähnlich wie der Bradford-Assay auf der kolorimetrischen und quantitativen Messung der Proteinmenge. Dazu wird sich ebenfalls die Biuret-Reaktion zunutze gemacht, die auf der Reduktion von Kupfer-Ionen in alkalischer Lösung beruht (Cu 2+ Cu + ). BCA ist ein Chelatbildner. Bei der Bindung von zwei BCA-Molekülen um ein Cu + -Ion kommt es zu einer Violettfärbung. Dies ist ein wasserlöslicher Komplex, der die stärkste Absorption bei 562 nm aufweist. Als Standard für die Ermittlung der Proteinkonzentration der Proben wurde BSA verwendet. Aus verschiedenen Konzentrationen an BSA-Lösungen wurde eine Eichkurve erstellt. Standardmäßig wurden alle Proben einmal unverdünnt und 1:2 verdünnt mit einem Volumen von 10 µl auf eine 96Well-Platte aufgetragen. Die Reaktionslösung aus Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung wurde auf jede Standardkonzentration und jede Probe aufgetragen (à 200 µl) und für 30 min bei 37 °C dunkel inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte. Nach Ermittlung der Eichkurve wurden die Konzentrationen der Proben anhand der Kurve berechnet und in mg/ml angegeben. Berechnung des Substratgehalts der Proben Nach der Berechnung der Proteinkonzentration wurde der Substratgehalt auf diese bezogen. Der Zellinhalt wurde analysiert und die erhaltenen Werte für das Substrat 3 H-Digoxin als DPM/mg Protein (decays per minute; Zerfallsrate, bezogen auf den Proteingehalt) und für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als Fluoreszenz/mg Protein angegeben. 4.3.2 Transport-Assay Aussaat der Zellen Die Zellen wurden für Transportversuche auf Polyester- oder Polycarbonat- Membranen der Hersteller Corning Costar Corporation (Transwell ® ) und Greiner Bio- One GmbH (ThinCerts ® ) kultiviert. Eine Übersicht einzelner Parameter wie Porengröße und dergleichen sind der Tabelle 4.2 zu entnehmen. Die Membran- Inserts der Multiwell-Platten unterteilen die Zellkulturschalen in eine apikale und eine basolaterale Kammer (siehe Abschnitt 2.8.2, Abbildung 2.5, S. 33) und erlauben so 53
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Die Dauer der Behandlung betrug 3 Tage. Dabei wurde täglich immer zum<br />
gleichen Zeitpunkt das Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem Medium,<br />
welches die für die jeweilige Behandlungsgruppe bestimmte Substanz enthielt,<br />
versorgt. Die Kontrollgruppen wurden stets nur mit Medium ohne weitere Zusätze<br />
behandelt. Ausnahmen bildeten Versuche, bei denen im Kontrollmedium die Vehikel<br />
(z.B. Ethanol) der zu testenden Antiepileptika oder auch Induktoren mitgeführt<br />
wurden. Wenn zwischen den Kontrollen keine Unterschiede nachweisbar waren,<br />
wurden diese Kontrollgruppen in der Statistik zusammen ausgewertet. DMSO wurde<br />
als Lösungsmittel für die einzelnen Substanzen vermieden, da es ab einem längeren<br />
Behandlungszeitraum induzierend auf die Pgp-Expression wirkt (AMBROZIAK et al.<br />
2010).<br />
Durchführung des Kumulations-Assays<br />
Im Anschluss an die Behandlungsdauer der Zellen (i.d.R. 6 Tage nach<br />
Erreichen der Konfluenz) und nach mikroskopischer Kontrolle der Zellen wurden<br />
diese für den Kumulationsversuch auf ein serumfreies Medium umgestellt (Opti-<br />
MEM ® ), um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verhindern. Dazu<br />
wurde das Behandlungsmedium entfernt und die Zellen für eine Stunde mit Opti-<br />
MEM ® mit und ohne den spezifischen Pgp-Inhibitor Tariquidar (0,5 µM) auf einem<br />
Schüttler inkubiert. Tariquidar sollte in Zellen, die funktionelles Pgp exprimieren, zur<br />
Inhibition dieses Transporters und somit zu einem erhöhten Gehalt des eingesetzten<br />
Substrats in den Zellen führen.<br />
Nach Ablauf dieser Vorinkubation wurde das Medium abgesaugt und durch<br />
Medium mit dem Pgp-Substrat ( 3 H-Digoxin oder Rhodamin 123) ersetzt und für<br />
weitere 2 Stunden inkubiert. In dieser Zeit konnte das Substrat in Abhängigkeit von<br />
der Pgp-Funktionalität unter Behandlung in die Zellen gelangen und dort verbleiben.<br />
Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde der Versuch durch Absaugen des<br />
Mediums und Waschen mit eiskaltem PBS zügig abgestoppt. Die Zellen wurden<br />
dann von den Wells geschabt, mit Lysispuffer (Zusammensetzung siehe Anhang S.<br />
213) aufgeschlossen und nach Zentrifugation der Messung zugeführt. Abhängig vom<br />
Substrat wurde der Zellinhalt mit einem Szintillationszähler (Liquid Scintillator System<br />
LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) oder Fluoreszenzmessgerät (BMG<br />
Labtech GmbH, Offenburg) gemessen.<br />
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