TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
Radioaktiv markiertes 3 H-Digoxin wurde mit unmarkiertem Digoxin, welches
zuvor in DMSO gelöst wurde, gemischt und in serumfreiem Medium (Opti-MEM ® )
aufgenommen. Die Endkonzentration betrug 0,1 % DMSO. Verapamil wurde
ebenfalls mit unmarkiertem Verapamil gemischt. Dieses wurde vorher in Ethanol
gelöst und in Opti-MEM ® aufgenommen. Die Endkonzentration des Ethanols betrug <
0,1 %. Sofern Ethanol als Lösungsmittel für einige Antiepileptika eingesetzt wurde,
betrug die Endkonzentration ≤ 0,5 %.
4.3.1 Kumulations-Assay
Der Kumulations-Assay, auch Uptake-Assay genannt, diente in dieser Arbeit
der Überprüfung der Funktionalität von Pgp. Das Prinzip dieser Methode besteht in
der Messung bestimmter markierter Substrate in den Zellen. Bei diesen Stoffen, die
Substrate für Pgp sind, kann es sich um Fluoreszenzfarbstoffe oder auch um
radioaktiv markierte Substrate handeln. Man macht sich hier Fähigkeit des Pgps
zunutze, Substanzen aktiv aus den Zellen zu pumpen. Aus diesem Grund kann
immer nur eine gewisse Menge Substrat von den Zellen aufgenommen werden.
Aussaat der Zellen
Die Zellen wurden für alle Kumulationsversuche so ausgesät, dass sich nach
2-3 Tagen konfluente Monolayer gebildet haben. Die Ablösung der Zellen erfolgte
wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben. Die Kultivierung der Zellen für Kumulations-
Assays erfolgte auf 6Well-Platten mit einem Volumen von 3ml/Well. In zwei
Kumulationsversuchen erfolgte die Aussaat der rBCEC-Zellen auf 12Well-Platten mit
einem Volumen von 1,5 ml Zellsuspension pro Well.
Substanzbehandlung der Zellen
Die Behandlung der Zellen begann am 3. Tag der Konfluenz. Bei jedem
Behandlungszyklus wurden neben den zu testenden Antiepileptika immer eine
Kontrollgruppe und bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren mitgeführt, um
Aussagen zur Sensitivität des Assays machen zu können. Dazu wurden zu Beginn
dieser Versuche verschiedene Induktoren für Pgp in den einzelnen Zelllinien
ausgetestet und die Substanz, die eine reproduzierbare Induktion der Pgp-
Funktionalität erzielte, für weitere Versuche verwendet. Angaben zu den
verwendeten Substanzen und Konzentrationen sind Tabelle 4.1 zu entnehmen.
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