TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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MATERIAL UND METHODEN Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet Einfluss auf Pgp Carbamazepin K Ethanol 10 µM 30 µM 50 µM Antiepileptikum ? 100 µM Levetiracetam K A. bidest. 100 µM 300 µM Antiepileptikum Substrat Phenobarbital K Medium 100 µM 300 µM Antiepileptikum Substrat Phenytoin K Ethanol 10 µM 30 µM 50 µM Antiepileptikum Substrat 100 µM Topiramat K A. bidest. 30 µM 100 µM Antiepileptikum Substrat 300 µM Valproat K A. bidest. 50 µM 100 µM Antiepileptikum ? 300 µM Tariquidar K, T DMSO 0,5 µM Inhibitor Inhibitor Valspodar Ethanol/Tween (PSC833) T 80 (9:1) 10 µM Inhibitor Inhibitor K T Substanzen, die im Kumulations-Assay eingesetzt wurden Substanzen, die im Transport-Assay eingesetzt wurden Die Substrate Digoxin und Rhodamin 123, die Pgp-Induktoren Dexamethason, Puromycin und Rifampicin und die Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und Valproat wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim bezogen, das radioaktiv markierte Digoxin von Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim, Valspodar von Novartis Pharma (Nürnberg), Doxorubicin von ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach, Phenobarbital von Serva, Heidelberg. Tariquidar wurde freundlicherweise von Xenova Ltd. (Berkshire, UK), Levetiracetam von UCB Pharma (Brüssel, Belgien) und Topiramat vom R. W. Johnson Research Institute (Pennsylvania, USA) zur Verfügung gestellt. 50
MATERIAL UND METHODEN Radioaktiv markiertes 3 H-Digoxin wurde mit unmarkiertem Digoxin, welches zuvor in DMSO gelöst wurde, gemischt und in serumfreiem Medium (Opti-MEM ® ) aufgenommen. Die Endkonzentration betrug 0,1 % DMSO. Verapamil wurde ebenfalls mit unmarkiertem Verapamil gemischt. Dieses wurde vorher in Ethanol gelöst und in Opti-MEM ® aufgenommen. Die Endkonzentration des Ethanols betrug < 0,1 %. Sofern Ethanol als Lösungsmittel für einige Antiepileptika eingesetzt wurde, betrug die Endkonzentration ≤ 0,5 %. 4.3.1 Kumulations-Assay Der Kumulations-Assay, auch Uptake-Assay genannt, diente in dieser Arbeit der Überprüfung der Funktionalität von Pgp. Das Prinzip dieser Methode besteht in der Messung bestimmter markierter Substrate in den Zellen. Bei diesen Stoffen, die Substrate für Pgp sind, kann es sich um Fluoreszenzfarbstoffe oder auch um radioaktiv markierte Substrate handeln. Man macht sich hier Fähigkeit des Pgps zunutze, Substanzen aktiv aus den Zellen zu pumpen. Aus diesem Grund kann immer nur eine gewisse Menge Substrat von den Zellen aufgenommen werden. Aussaat der Zellen Die Zellen wurden für alle Kumulationsversuche so ausgesät, dass sich nach 2-3 Tagen konfluente Monolayer gebildet haben. Die Ablösung der Zellen erfolgte wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben. Die Kultivierung der Zellen für Kumulations- Assays erfolgte auf 6Well-Platten mit einem Volumen von 3ml/Well. In zwei Kumulationsversuchen erfolgte die Aussaat der rBCEC-Zellen auf 12Well-Platten mit einem Volumen von 1,5 ml Zellsuspension pro Well. Substanzbehandlung der Zellen Die Behandlung der Zellen begann am 3. Tag der Konfluenz. Bei jedem Behandlungszyklus wurden neben den zu testenden Antiepileptika immer eine Kontrollgruppe und bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren mitgeführt, um Aussagen zur Sensitivität des Assays machen zu können. Dazu wurden zu Beginn dieser Versuche verschiedene Induktoren für Pgp in den einzelnen Zelllinien ausgetestet und die Substanz, die eine reproduzierbare Induktion der Pgp- Funktionalität erzielte, für weitere Versuche verwendet. Angaben zu den verwendeten Substanzen und Konzentrationen sind Tabelle 4.1 zu entnehmen. 51
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MATERIAL UND METHODEN<br />
Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet<br />
Einfluss<br />
auf Pgp<br />
Carbamazepin K Ethanol<br />
10 µM<br />
30 µM<br />
50 µM<br />
Antiepileptikum ?<br />
100 µM<br />
Levetiracetam K A. bidest.<br />
100 µM<br />
300 µM<br />
Antiepileptikum Substrat<br />
Phenobarbital K Medium<br />
100 µM<br />
300 µM<br />
Antiepileptikum Substrat<br />
Phenytoin K Ethanol<br />
10 µM<br />
30 µM<br />
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Antiepileptikum Substrat<br />
100 µM<br />
Topiramat K A. bidest.<br />
30 µM<br />
100 µM Antiepileptikum Substrat<br />
300 µM<br />
Valproat K A. bidest.<br />
50 µM<br />
100 µM Antiepileptikum ?<br />
300 µM<br />
Tariquidar K, T DMSO 0,5 µM Inhibitor Inhibitor<br />
Valspodar Ethanol/Tween<br />
(PSC833) T 80 (9:1)<br />
10 µM Inhibitor Inhibitor<br />
K<br />
T<br />
Substanzen, die im Kumulations-Assay eingesetzt wurden<br />
Substanzen, die im Transport-Assay eingesetzt wurden<br />
Die Substrate Digoxin und Rhodamin 123, die Pgp-Induktoren Dexamethason,<br />
Puromycin und Rifampicin und die Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und<br />
Valproat wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim bezogen, das radioaktiv markierte<br />
Digoxin von Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim, Valspodar von Novartis<br />
Pharma (Nürnberg), Doxorubicin von ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach, Phenobarbital<br />
von Serva, Heidelberg. Tariquidar wurde freundlicherweise von Xenova Ltd.<br />
(Berkshire, UK), Levetiracetam von UCB Pharma (Brüssel, Belgien) und Topiramat<br />
vom R. W. Johnson Research Institute (Pennsylvania, USA) zur Verfügung gestellt.<br />
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