TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
Die Primärhirnendothelzellen benötigten ebenfalls eine Beschichtung, um sich
an den Zellkulturgefäßen anheften zu können. Collagen Typ IV wurde dazu in A.
bidest. gelöst, sodass eine Stocklösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml
entstand. Diese wurde in 1:10 in A. bidest. verdünnt und auf die Zellkulturschalen
gegeben. Diese wurden 1 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das
Collagen abgenommen und die Schalen wurden unter der Sterilbank getrocknet. Für
Transportstudien mit den primären Zellen wurden die Transwell-Inserts vor der
Aussaat der Zellen mit einem Gemisch aus Collagen Typ IV und Fibronectin (1:2)
beschichtet. Dies erfolgte für 2 h bei 37 °C. Das Gemisch wurde anschließend von
den Transwell-Inserts abgesaugt und diese unter der Sterilwerkbank getrocknet.
4.2.2 Kryokonservierung
Zum Einfrieren wurden die Zellen nach Abtrypsinierung und Zentrifugation
(s.o.) in fetalem Kälberserum, welches mit 10 % DMSO versetzt wurde,
aufgenommen und resuspendiert. Die Zellen einer 78 cm 2 großen Petrischale
wurden dazu in etwa 5 ml Einfriermedium aufgenommen und auf 5 Kryoröhrchen (à 1
ml) verteilt. Anschließend wurden die Röhrchen in einem vorgekühlten Behältnis über
Nacht bei -80 °C gelagert, um am nächsten Tag in einen Flüssigstickstoffbehälter (-
196 °C) für die permanente Lagerung überführt zu werden.
4.2.3 Auftauen der Zellen
Die Kryoröhrchen wurden zu diesem Zweck kurz in einem 37 °C warmen
Wasserbad geschwenkt. Der flüssige Inhalt wurde in ein 15 ml-Röhrchen überführt
und nach Zugabe von 5 ml warmen Medium bei 800xg zentrifugiert. Das Medium
wurde anschließend abgesaugt, die Zellen in 5 ml frischem Medium aufgenommen
und in einer kleinen Petrischale (A = 28 cm 2 ) kultiviert.
4.3 Untersuchung der Funktionalität
Zur Untersuchung der Funktionalität des Multidrug-Transporters Pgp wurden
in der vorliegenden Arbeit zwei Methoden angewendet: der Kumulations-Assay und
der Transport-Assay.
Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über alle verwendeten Substanzen in den
funktionalen Assays, wobei der mögliche Einfluss auf Pgp aufgezeigt wird.
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