TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

MATERIAL UND METHODEN
verwendeten Rattenstämmen handelte es sich um Auszuchtstämme. Die für die
Präparation benötigten Tiere (Versuchstiere) stammten aus zwei Generationen der
institutseigenen Zucht. Wasser und Futter in Form von Pellets (Altromin 1324
Standarddiät, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) standen den Tieren ad libitum zur
Verfügung. Einmal wöchentlich wurden die Tiere in neue Käfige mit frischem Einstreu
umgesetzt. Die Auswechslung des Futters und Wassers erfolgte einmal bzw.
zweimal pro Woche. Die Tiere wurden bei einer Lufttemperatur von 20-24 °C und
einer Luftfeuchtigkeit von 50–60 % gehalten. Zwischen 06:00 Uhr und 18:00 Uhr
waren die Tiere einer 12-stündigen Hellphase mit einer Leuchtstärke von 19–30 Lux
in den Makrolonkäfigen ausgesetzt. Es wurden maximal zwei Generationen der
Ratten gezüchtet.
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels
Für die Präparation des Endothelgewebes wurden 2–3 Wochen alte Ratten
verwendet. Die Präparation erfolgte mit leichten Modifikationen nach Protokollen von
RÉGINA et al. (1999) und PERRIÈRE et al. (2005). Pro Präparation wurden
abhängig von Wurfgröße und benötigter Zellzahl 5–16 Tiere nach CO 2 -Narkose
dekapitiert. Die Köpfe wurden kurz in 70 %igen Ethanol getaucht und bis zur
weiteren Aufarbeitung auf Eis gehalten. Alle nun folgenden Schritte fanden unter der
Sterilwerkbank statt. Die Schädel wurden eröffnet. Die Gehirne wurden
herauspräpariert und in eiskalter PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin auf Eis
gesammelt. Das Stammhirn, der Plexus und das Kleinhirn wurden abgetrennt und
die Meningen mittels Pinzette, Filterpapier und Wattestäbchen entfernt. Die Cortices
wurden in eine neue Petrischale mit frischer PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin
überführt. Anschließend wurde die Lösung abgesaugt und die Cortices mit Skalpellen
zu einer homogenen Masse zerkIeinert und für 1,5 h in einem 37 °C warmen
Wasserbad mit 15 ml einer Enzymlösung (DMEM/F-12, Dispase II, DNAse I,
Collagenase II und Penicillin/Streptomycin (Volumina und Konzentrationen siehe
Anhang S. 210) inkubiert. Das Gemisch wurde während der Inkubation mehrere Male
geschwenkt, um einen gleichmäßigen Verdau des Gewebes zu gewährleisten. Zum
Stoppen der Reaktion wurde der Verdau nach der Inkubationszeit mit 20 ml einer
20 % (w/v) Lösung von Bovinem Serumalbumin (BSA) versetzt, auf zwei 50 ml-
Röhrchen verteilt und für 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand,
der u.a. Myelin enthält, wurde dekantiert, die verbliebenen Pellets erneut mit der
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