TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
MATERIAL UND METHODEN wurde Puromycin abgesehen von der Behandlung lediglich über die ersten zwei Passagen dem Medium zugefügt. RÉGINA et al. (1999) wiesen für diese Endothelzelllinie nach, dass sie morphologische Kriterien und Eigenschaften der BHS zeigt. Dies und die Überexpression der Multidrug-Transporter waren bei der Auswahl dieser Zelllinie ausschlaggebend. Das zur Kultivierung der GPNT-Zellen verwendete Medium bestand aus: - MEM + GlutaMAX-I/Ham‘s F-10 + GlutaMAX-I im Verhältnis 1:1 - 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert; 30 min bei 56 °C hitzeinaktiviert) - 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin - 1 ng/ml bFGF - 5 µg/ml Puromycin Das Zytostatikum Puromycin wurde lediglich über die ersten Passagen nach Auftauen als Mediumszusatz verabreicht und anschließend abgesetzt. Die Zusammensetzung des Medium wurde mit Modifikationen RÉGINA et al. (1999) nachempfunden. 4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4 RBE4-Zellen (Rat Brain Endothelial cells) wurden ebenso wie GPNT-Zellen aus Rattenhirnendothel gewonnen, allerdings handelt es sich hierbei um eine andere Endothelzelllinie. Diese wurde durch die Transfektion mit einem E1A-Adenovirusenthaltenden Plasmid immortalisiert (ROUX et al. 1994) und zeigte den Phänotyp von Endothelien. RBE4-Zellen stellen eine etablierte Zelllinie dar und werden als ein In-vitro-Modell der BHS verwendet (ROUX et al. 1994). Des Weiteren weisen diese Zellen Eigenschaften auf, die auch von Hirnendothelien in vivo gezeigt werden (ROUX & COURAUD 2005; ASCHNER et al. 2006). Die Zellen zeigen ähnliche Charakteristika wie Primärzellkulturen, z.B. die Expression spezifischer Endothel- Marker (z.B. Alkalische Phosphatase ALP). Zudem konnte die Expression des Glukose-Transporters GLUT1 und der Effluxpumpe Pgp für RBE4-Zellen nachgewiesen werden (BEGLEY et al. 1996; RÉGINA et al. 1998). Beide Transporter kommen in der BHS vor. Die RBE4-Zellen wurden in folgendem Medium kultiviert: - MEM + GlutaMAX-I/Ham’s F-10 + GlutaMAX-I (1:1) 42
MATERIAL UND METHODEN - 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht standardisiert; 30 min bei 56 °C hitzeinaktiviert) - 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin - 1 % (v/v) L-Glutamin (200 mM) - 1 ng/ml bFGF Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach BEGLEY et al. (1996). Sowohl GPNT- als auch RBE4-Zellen weisen typische Marker der BHS auf. Aufgrund fehlender oder nur in geringen Maß ausgeprägter parazellulärer Begrenzungen sind transendotheliale Permeabilitätsversuche und Transport-Assays nicht möglich (ROUX & COURAUD 2005). GPNT- und RBE4-Zellen können aber für Kumulations-Assays eingesetzt werden, die die Funktionalität zu untersuchender Transporter wiedergeben. 4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte Da immortalisierte Zellen Veränderungen im Vergleich zum Ursprungsgewebe aufweisen können, und diese sich auch auf die Ausbildung der Tight junctions und somit die Barriere-Eigenschaften auswirken können, werden seit langem Primärkulturen der Hirnkapillarendothelien verschiedener Spezies als In-vitro- Modelle der BHS verwendet (FRANKE et al. 2000). Es ist bekannt, dass Astrozyten durch die Induktion von Tight-junction-Proteinen zu einem dichten Zellmonolayer beitragen (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003; HATHERELL et al. 2011). Deshalb wurden Studien zu Kokulturen von Endothelzellen und Astrozyten durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Primärkulturen des Hirnkapillarendothels, welche im Weiteren rBCEC (rat Brain Capillary Endothelial Cells) genannt werden, und der Astrozyten der Ratte eingesetzt. 4.1.4.1 Tierhaltung Es wurden zwei verschiedene Rattenstämme, CD ® -IGS- und Wistar-Ratten im Tierstall des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gezüchtet. Die Tiere wurden nach Geschlechtern getrennt in verschiedenen Käfigen aber im gleichen Tierraum gehalten. Die initialen Zuchttiere wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. CD ® -IGS-Ratten entsprechen dabei Sprague-Dawley-Ratten. Bei beiden 43
- Seite 1 und 2: Tierärztliche Hochschule Hannover
- Seite 3 und 4: Für meine Familie
- Seite 5 und 6: 4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzel
- Seite 7 und 8: SUMMARY ...........................
- Seite 9 und 10: EINLEITUNG 1 EINLEITUNG Epilepsien
- Seite 11 und 12: STAND DER FORSCHUNG 2 STAND DER FOR
- Seite 13 und 14: STAND DER FORSCHUNG (Epileptogenese
- Seite 15 und 16: STAND DER FORSCHUNG Dank der Forsch
- Seite 17 und 18: STAND DER FORSCHUNG 2.2 Pharmakores
- Seite 19 und 20: STAND DER FORSCHUNG Pharmakoresiste
- Seite 21 und 22: STAND DER FORSCHUNG Abbildung 2.1:
- Seite 23 und 24: STAND DER FORSCHUNG Diese Schranke
- Seite 25 und 26: STAND DER FORSCHUNG Rolle. Aus dies
- Seite 27 und 28: STAND DER FORSCHUNG erniedrigten un
- Seite 29 und 30: STAND DER FORSCHUNG Pgp an mehreren
- Seite 31 und 32: STAND DER FORSCHUNG 2.6 Wechselwirk
- Seite 33 und 34: STAND DER FORSCHUNG x A Induktoren
- Seite 35 und 36: STAND DER FORSCHUNG Antiepileptika
- Seite 37 und 38: STAND DER FORSCHUNG Ein weiterer Pg
- Seite 39 und 40: STAND DER FORSCHUNG zur Verfügung.
- Seite 41 und 42: STAND DER FORSCHUNG Dieser Umstand
- Seite 43 und 44: STAND DER FORSCHUNG junction-Protei
- Seite 45 und 46: STAND DER FORSCHUNG Hirnkapillarend
- Seite 47 und 48: FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEI
- Seite 49: MATERIAL UND METHODEN Modell für T
- Seite 53 und 54: MATERIAL UND METHODEN Enzymlösung
- Seite 55 und 56: MATERIAL UND METHODEN in Kultur geh
- Seite 57 und 58: MATERIAL UND METHODEN Tabelle 4.1:
- Seite 59 und 60: MATERIAL UND METHODEN Radioaktiv ma
- Seite 61 und 62: MATERIAL UND METHODEN Bestimmung de
- Seite 63 und 64: MATERIAL UND METHODEN Zellsuspensio
- Seite 65 und 66: MATERIAL UND METHODEN apparenten pa
- Seite 67 und 68: MATERIAL UND METHODEN einer Substan
- Seite 69 und 70: MATERIAL UND METHODEN wurden für a
- Seite 71 und 72: ERGEBNISSE bestätigt. Die kleinere
- Seite 73 und 74: ERGEBNISSE 5.1.3 Pgp-Funktionalitä
- Seite 75 und 76: Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protei
- Seite 77 und 78: Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protei
- Seite 79 und 80: Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protei
- Seite 81 und 82: Rhodamin 123 (% Kontrolle) ERGEBNIS
- Seite 83 und 84: Rhodamin 123 (Fluoreszenz/mg Protei
- Seite 85 und 86: ERGEBNISSE Zusammenfassung möglich
- Seite 87 und 88: ERGEBNISSE Tabelle 5.2: Übersicht
- Seite 89 und 90: ERGEBNISSE 5.1.3.4 Einfluss des Ser
- Seite 91 und 92: ERGEBNISSE Die Linie, die in beiden
- Seite 93 und 94: Rhodamin 123 (% Kontrolle) Rhodamin
- Seite 95 und 96: ERGEBNISSE Efflux (nicht gezeigt).
- Seite 97 und 98: TEER (*cm 2 ) ERGEBNISSE Zeitraum v
- Seite 99 und 100: % Digoxin % Digoxin % Digoxin ERGEB
MATERIAL UND METHODEN<br />
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht standardisiert; 30 min bei 56 °C<br />
hitzeinaktiviert)<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
- 1 % (v/v) L-Glutamin (200 mM)<br />
- 1 ng/ml bFGF<br />
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach BEGLEY et al. (1996).<br />
Sowohl GPNT- als auch RBE4-Zellen weisen typische Marker der BHS auf.<br />
Aufgrund fehlender oder nur in geringen Maß ausgeprägter parazellulärer<br />
Begrenzungen sind transendotheliale Permeabilitätsversuche und Transport-Assays<br />
nicht möglich (ROUX & COURAUD 2005). GPNT- und RBE4-Zellen können aber für<br />
Kumulations-Assays eingesetzt werden, die die Funktionalität zu untersuchender<br />
Transporter wiedergeben.<br />
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte<br />
Da immortalisierte Zellen Veränderungen im Vergleich zum Ursprungsgewebe<br />
aufweisen können, und diese sich auch auf die Ausbildung der Tight junctions und<br />
somit die Barriere-Eigenschaften auswirken können, werden seit langem<br />
Primärkulturen der Hirnkapillarendothelien verschiedener Spezies als In-vitro-<br />
Modelle der BHS verwendet (FRANKE et al. 2000). Es ist bekannt, dass Astrozyten<br />
durch die Induktion von Tight-junction-Proteinen zu einem dichten Zellmonolayer<br />
beitragen (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003; HATHERELL et al. 2011).<br />
Deshalb wurden Studien zu Kokulturen von Endothelzellen und Astrozyten<br />
durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Primärkulturen des Hirnkapillarendothels,<br />
welche im Weiteren rBCEC (rat Brain Capillary Endothelial Cells) genannt werden,<br />
und der Astrozyten der Ratte eingesetzt.<br />
4.1.4.1 Tierhaltung<br />
Es wurden zwei verschiedene Rattenstämme, CD ® -IGS- und Wistar-Ratten im<br />
Tierstall des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der<br />
<strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> gezüchtet. Die Tiere wurden nach<br />
Geschlechtern getrennt in verschiedenen Käfigen aber im gleichen Tierraum<br />
gehalten. Die initialen Zuchttiere wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland)<br />
bezogen. CD ® -IGS-Ratten entsprechen dabei Sprague-Dawley-Ratten. Bei beiden<br />
43
Change language