TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT ...................................................................................... 41
4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4 ...................................................................................... 42
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte .................................................. 43
4.1.4.1 Tierhaltung ............................................................................................................................ 43
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels .............................................................................. 44
4.1.4.3 Präparation der Astrozyten ................................................................................................. 45
4.2 Kultivierung der Zellen ........................................................................................................... 46
4.2.1 Passagierung ................................................................................................................................... 47
4.2.2 Kryokonservierung .......................................................................................................................... 48
4.2.3 Auftauen der Zellen ......................................................................................................................... 48
4.3 Untersuchung der Funktionalität .......................................................................................... 48
4.3.1 Kumulations-Assay ......................................................................................................................... 51
4.3.2 Transport-Assay .............................................................................................................................. 53
4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot ..................................................................... 59
4.5 Quantifizierung der Substanzen ........................................................................................... 60
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader .................................................. 60
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter ................................................... 60
4.6 Auswertung der Daten und Statistik .................................................................................... 60
5 ERGEBNISSE .................................................................................................................. 62
5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 ....................................................... 62
5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen .................................................................................... 62
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen ................................................................. 63
5.1.3 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Kumulations-Assays ................................................ 65
5.1.3.1 Auswahl des Substrats......................................................................................................... 65
5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität ..................... 68
5.1.3.3 Modulationen der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika ............................................. 74
5.1.3.4 Einfluss des Serums während des Kumulationsversuchs ............................................. 81
5.1.3.5 Hydrocortison und dessen Einfluss auf den Efflux .......................................................... 81
5.1.3.6 Vergleichende Untersuchungen der Pgp-Funktion in Rattenhirnendothelien ............. 84
5.1.3.7 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp ............................................. 87
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays ..................................................... 88
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen......................................................................... 88
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays ................................. 92
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze ................................... 94
5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials ........................................................................................ 96
5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay ........................................................................................ 98
5.1.4.6 Einfluss des Formats der Membraneinlagen ................................................................. 100
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