TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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MATERIAL UND METHODEN 4 MATERIAL UND METHODEN Hinweis: Im Anhang befinden sich die ausführlichen Protokolle der nun im Folgenden beschriebenen Methoden. Weiterhin sind alle verwendeten Substanzen, Verbrauchsmaterialien und Geräte samt der jeweiligen Bezugsquelle sowie die Zusammensetzungen verwendeter Puffer und Lösungen im Anhang aufgelistet. 4.1 Immortalisierte Zelllinien Für die vorliegende Arbeit wurden drei verschiedene immortalisierte Zelllinien verwendet (hCMEC/D3, GPNT und RBE4) sowie Primärkulturen aus dem Rattenhirnendothel. GPNT- und RBE4-Zellen wurden freundlicherweise von Prof. F. Roux (INSERM U26, Unité de Neuro-Pharmaco-Nutrition, Hôpital Fernand Widal, Paris, Frankreich), die hCMEC/D3-Zellen von Dr. P.-O. Couraud (The Cochin Institute: INSERM (Unit 1016), CNRS (UMR 8104) und Descartes Universität Paris, Frankreich, UPD (UMR-S 1016)) zur Verfügung gestellt. 4.1.1 Humane Hirnkapillarendothelzellen: hCMEC/D3 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 (human Cerebral Microvessel Endothelial Cells) wurde im Zuge einer chirurgischen Entfernung des epileptischen Fokus aus dem Gewebe des Temporallappens einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin gewonnen (WEKSLER et al. 2005). Die Zellen wurden mittels einer sequentiellen lentiviralen Transduktion mit hTERT (human telomerase catalytic unit) und SV40 T-Antigen transfiziert. Nach folgenden Klonierungsschritten wurde der Klon hCMEC/D3 für die Entwicklung der Zelllinie verwendet. Er zeigte die Expression der Endothelial-Marker PECAM-1, ß-Catenin, ZO-1 und Willebrand-Faktor. Die Zellen zeigen in Kultur Kontaktinhibition, Charakteristika der BHS wie Expression von Tight junction-Proteinen sowie der Multidrug-Transporter Pgp, MRP1 und BCRP (WEKSLER et al. 2005). Diese Transporterproteine befähigen die Zellen, aktiv Substanzen herauszutransportieren. Sie gelten deshalb als geeignetes Werkzeug für Untersuchungen der Entzündungs- und Infektionsantworten und der Funktion der BHS (POLLER et al. 2010; FASLER-KAN et al. 2010; DANIELS et al. 2012). Es gibt erste Untersuchungen zur Eignung der hCMEC/D3-Zellen als BHS- 40
MATERIAL UND METHODEN Modell für Transportuntersuchungen (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). Diese Anwendung wird aber kontrovers diskutiert (URICH et al. 2012). Weiterhin wurden bereits Studien zu Ko- oder Trikulturen mit dieser immortalisierten Zelllinie durchgeführt, die die Optimierung von In-vitro-BHS-Modellen durch die Kultivierung mit Astrozyten und Perizyten aufzeigen (HATHERELL et al. 2011). Die Hirnkapillarendothelzellen wurden in folgendem Medium kultiviert: - EBM-2 Medium - 5 % (v/v) fetales Kälberserum - 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml) - 1 % Chemically defined Lipid Concentrate (1/100) - 10 mM HEPES (1 M) - 5 µg/ml Ascorbinsäure - 1,4 µM Hydrocortison - 1 ng/ml basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach WEKSLER et al. (2005). Für die Verwendung in Transport-Assays, für die dichte Monolayer der Zellen eine Notwendigkeit darstellen, wurden vergleichende Untersuchungen mit Seren unterschiedlicher Herkunft durchgeführt. Dazu wurden ein nicht-standardisiertes und ein standardisiertes fetales Kälberserum sowie humanes Serum zur Kultivierung der Zellen auf den Inserts verwendet. Unter den im Folgenden beschriebenen Bedingungen für die Transportversuche wurden allerdings keine Unterschiede festgestellt, sodass die hCMEC/D3-Zellen für Transportstudien mit nichtstandardisiertem Serum bovinen Ursprungs kultiviert wurden. Welches Serum für die einzelnen Versuche, die im Abschnitt Ergebnisse dargestellt sind, verwendet wurde, ist angegeben. 4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT Diese immortalisierten Zellen stammen von einer gut charakterisierten Endothelzelllinie (GP8) aus Rattenhirn (GREENWOOD et al. 1996). Diese wurden mit einem Puromycin-Resistenzgen-enthaltenden Plasmid transfiziert und nach GP8 und der Firma NeuroTech S:A: benannt. Das Zytostatikum Puromycin diente bei dieser Zelllinie der Selektion Pgp-exprimierender Zellen. Zudem führt es zu einer verstärkten Pgp-Expression (DEMEUSE et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit 41
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Modell für Transportuntersuchungen (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). Diese<br />
Anwendung wird aber kontrovers diskutiert (URICH et al. 2012). Weiterhin wurden<br />
bereits Studien zu Ko- oder Trikulturen mit dieser immortalisierten Zelllinie<br />
durchgeführt, die die Optimierung von In-vitro-BHS-Modellen durch die Kultivierung<br />
mit Astrozyten und Perizyten aufzeigen (HATHERELL et al. 2011).<br />
Die Hirnkapillarendothelzellen wurden in folgendem Medium kultiviert:<br />
- EBM-2 Medium<br />
- 5 % (v/v) fetales Kälberserum<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)<br />
- 1 % Chemically defined Lipid Concentrate (1/100)<br />
- 10 mM HEPES (1 M)<br />
- 5 µg/ml Ascorbinsäure<br />
- 1,4 µM Hydrocortison<br />
- 1 ng/ml basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)<br />
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach WEKSLER et al. (2005).<br />
Für die Verwendung in Transport-Assays, für die dichte Monolayer der Zellen<br />
eine Notwendigkeit darstellen, wurden vergleichende Untersuchungen mit Seren<br />
unterschiedlicher Herkunft durchgeführt. Dazu wurden ein nicht-standardisiertes und<br />
ein standardisiertes fetales Kälberserum sowie humanes Serum zur Kultivierung der<br />
Zellen auf den Inserts verwendet. Unter den im Folgenden beschriebenen<br />
Bedingungen für die Transportversuche wurden allerdings keine Unterschiede<br />
festgestellt, sodass die hCMEC/D3-Zellen für Transportstudien mit nichtstandardisiertem<br />
Serum bovinen Ursprungs kultiviert wurden. Welches Serum für die<br />
einzelnen Versuche, die im Abschnitt Ergebnisse dargestellt sind, verwendet wurde,<br />
ist angegeben.<br />
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Diese immortalisierten Zellen stammen von einer gut charakterisierten<br />
Endothelzelllinie (GP8) aus Rattenhirn (GREENWOOD et al. 1996). Diese wurden<br />
mit einem Puromycin-Resistenzgen-enthaltenden Plasmid transfiziert und nach GP8<br />
und der Firma NeuroTech S:A: benannt. Das Zytostatikum Puromycin diente bei<br />
dieser Zelllinie der Selektion Pgp-exprimierender Zellen. Zudem führt es zu einer<br />
verstärkten Pgp-Expression (DEMEUSE et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit<br />
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