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ANHANG Tabelle 8.3: Verwendete Antikörper und Verdünnungen Antikörper Bezug Lösungsmittel Verdünnung Primärantikörper Anti-Pgp C219 Signet 2 %ige Magermilch 1:200 (Maus, monoklonal) Anti-β-Aktin Sigma-Aldrich 2 %ige Magermilch 1:5000 (Kaninchen, monoklonal) Sekundärantikörper Kaninchen-anti-Maus-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000 Ziege-anti-Kaninchen-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000 Sowohl Primärantikörper als auch Sekundärantikörper wurden in 2 %iger Magermilchlösung verdünnt. Die Inkubation mit dem jeweiligen Primärantikörper erfolgte für 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte entfernt. Die nun folgende einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Sekundärantikörper waren an das Enzym Meerrettichperoxidase (Horse Radish Peroxidase, HRP) gekoppelt. Diese setzt Luminol bzw. dessen Derivate in die oxidierte Form um, wobei eine detektierbare Lumineszenz frei wird. Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurden die Membranen erneut gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem chemilumineszenten Substrat des SuperSignal ® West Femto Kits. Dazu wurden pro Membranhälfte etwa 300 µl des chemilumineszenten Substrats verwendet. Die Signale wurden entweder mit dem Programm Chemidoc XRS System (inklusive Image Lab Software; Bio-Rad Laboratories, München) aufgezeichnet oder aber durch eine Inkubation der Membranen auf Röntgenfilm für etwa 10 sec bis 30 min fixiert. Nach der Entwicklung und Fixierung des Films wurde dieser gescannt. Unabhängig von der Aufzeichnung der Signale wurden die Banden anschließend mit der Quantity One ® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories) quantifiziert. Die statistische Auswertung wurde mit Prism5 ® (GraphPad, San Diego, CA, USA) vorgenommen. Dabei wurden die für die Pgp-Signale ermittelten Daten auf die Werte für ß-Aktin normiert. 220
PUBLIKATIONEN PUBLIKATIONEN Originalarbeiten Noack, A., Noack, S., Hoffmann, A., Maalouf, K., Couraud, P.-O., Romero, I.A., Weksler, B., Alms, D., Naim, H.Y., Löscher, W., 2012. Drug-induced trafficking of P- glycoprotein in human brain capillary endothelial cells. PLOS ONE. Eingereicht Alms, D., Fedrowitz, M., Löscher, W., 2013. Marked differences in the effect of antiepileptic and cytostatic drugs on the functionality of P-glycoprotein in human and rat brain capillary endothelial cell lines. Biochem. Pharmacol. Eingereicht Zitierfähige Kongressbeiträge D. Neumann, M. Fedrowitz, W. Löscher (2011): „Several antiepileptic drugs induce the MDT P-glycoprotein in rat and human brain endothelial cell lines“. 65 th Annual Meeting American Epilepsy Society 2011, Baltimore, Poster 1.243 Alms D., Fedrowitz M., Löscher W. (2012): „Induction of the Multidrug-Transporter P- glycoprotein by several antiepileptic drugs in rat and human brain endothelial cell lines“. 8 th FENS Forum of Neuroscience 2012, Barcelona, FENS Abstract, Volume 6, Poster 034.01 221
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Tierärztliche Hochschule Hannover
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Für meine Familie
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4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzel
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EINLEITUNG 1 EINLEITUNG Epilepsien
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ERGEBNISSE Tabelle 5.7 fasst alle R
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DISKUSSION 6.1 Die humane immortali
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DISKUSSION Phenobarbital, Phenytoin
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DISKUSSION nachweisen. In wie weit
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DISKUSSION die Pgp-Funktionalität
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DISKUSSION 1 %/h für die Permeabil
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DISKUSSION möglicherweise nicht oh
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DISKUSSION al. 2010). Aus diesem Gr
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DISKUSSION Permeabilität und TEER
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DISKUSSION 6.2 Primäre Hirnkapilla
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DISKUSSION µM) zumindest Tendenzen
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