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ANHANG
Tabelle 8.3: Verwendete Antikörper und Verdünnungen
Antikörper Bezug Lösungsmittel Verdünnung
Primärantikörper
Anti-Pgp C219
Signet 2 %ige Magermilch 1:200
(Maus, monoklonal)
Anti-β-Aktin
Sigma-Aldrich 2 %ige Magermilch 1:5000
(Kaninchen, monoklonal)
Sekundärantikörper
Kaninchen-anti-Maus-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000
Ziege-anti-Kaninchen-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000
Sowohl Primärantikörper als auch Sekundärantikörper wurden in 2 %iger Magermilchlösung
verdünnt. Die Inkubation mit dem jeweiligen Primärantikörper erfolgte für 1-2 h bei Raumtemperatur
auf einem Schüttler. Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte
entfernt. Die nun folgende einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde bei
Raumtemperatur durchgeführt.
Die Sekundärantikörper waren an das Enzym Meerrettichperoxidase (Horse Radish
Peroxidase, HRP) gekoppelt. Diese setzt Luminol bzw. dessen Derivate in die oxidierte Form um,
wobei eine detektierbare Lumineszenz frei wird. Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper
wurden die Membranen erneut gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem
chemilumineszenten Substrat des SuperSignal ® West Femto Kits. Dazu wurden pro Membranhälfte
etwa 300 µl des chemilumineszenten Substrats verwendet. Die Signale wurden entweder mit dem
Programm Chemidoc XRS System (inklusive Image Lab Software; Bio-Rad Laboratories,
München) aufgezeichnet oder aber durch eine Inkubation der Membranen auf Röntgenfilm für etwa 10
sec bis 30 min fixiert. Nach der Entwicklung und Fixierung des Films wurde dieser gescannt.
Unabhängig von der Aufzeichnung der Signale wurden die Banden anschließend mit der Quantity
One ® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories) quantifiziert. Die statistische Auswertung wurde
mit Prism5 ® (GraphPad, San Diego, CA, USA) vorgenommen. Dabei wurden die für die Pgp-Signale
ermittelten Daten auf die Werte für ß-Aktin normiert.
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