TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
Herstellung der Proteinlysate
Für die Herstellung der Lysate wurden die Zellen zunächst mit kaltem PBS gewaschen.
Anschließend wurden 300-800 µl mit Protease-Inhibitor versetztem Lysispuffer in Abhängigkeit von
der Größe der Kultivierungsgefäße auf die Zellen gegeben und für diese über 30 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen mit Hilfe eines Schabers von der Oberfläche der Kulturschalen/Wells
gelöst, das Volumen in Eppendorfgefäße überführt und darin eventuell noch intakte Zellen lysiert.
Nach einer 15-minütigen Zentrifugation bei 18550xg und 4 °C wurde der Überstand in ein neues
Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung bei – 20 °C gelagert.
Vorbereitung der Proben
Mittels des BCA Protein Assays wurde die Proteinkonzentration der Zellproben bestimmt, um
für alle Proben die gleiche Proteinmenge auftragen zu können (genauere Angaben siehe 4.3.1
Bestimmung der Proteinkonzentration). Pro Probe wurden i.d.R. 15-40 µg Protein eingesetzt. Die
Proben wurden mit dem nötigen Volumen an Proteinlysat vorbereitet und mit einem Viertel des
jeweiligen Volumens an 5x konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bei
37 °C inkubiert.
Elektrophorese: SDS-PAGE
Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelen und des Detergenz
Sodiumdodecylsulfat (SDS), welches die Proteine denaturiert und ihnen eine negative Ladung
verschafft. In den Gelen wurden die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, wobei kleinere
bzw. leichtere Proteine eine längere Laufstrecke im Gel zurücklegen.
Sofern keine Fertiggele (10 % Tris-Glycin, Life Technologies, Darmstadt) verwendet wurde, fanden für
die Gelelektrophorese zwei Gele Anwendung: das Sammelgel (4 % Acrylamid) und das Trenngel
(10 % Acrylamid). Ersteres sorgte für die Konzentration der Proben in den Geltaschen und damit für
einen gleichmäßigen Lauf der Proteine. Im Trenngel erfolgte dann die eigentliche Auftrennung des
Proteingemisches in einzelne Proteinbanden. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von max.
U = 125 V durchgeführt.
Elektroblotting
Nach der Auftrennung des Proteingemisches mittels SDS-PAGE erfolgte die Übertragung auf
eine Polyvinylidenmembran in einer Semi-Dry-Blottingapparatur. Dazu wurden 6 Whatman ® -Blotting-
Papiere (Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe) und die Membran auf die Größe des Gels
zurechtgeschnitten. Die PVDF-Membran (PVDF Transfer Membran T830.1, Carl Roth GmbH + CO.
KG, Karlsruhe) wurde mit Hilfe von 100 % Methanol für die folgenden wässrigen Lösungen zugänglich
gemacht.
Daran anschließend erfolgte der Aufbau des Western Blots. Die verwendete Stromstärke in
mA richtete sich nach der Fläche des Gels multipliziert mit 2. Die Blottingdauer betrug 2 h. Zur
Überprüfung, ob die Proteine vom Gel auf die Membran übertragen wurden, wurde das Gel mit einer
Coomassie-Lösung gefärbt.
Immunodetektion
Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C in 5 %iger Magermilchlösung geschwenkt, um
freie Bindungsstellen zu blocken. Anschließend wurden die Membranen an einer rot markierten Bande
bei 72 kDa geschnitten. Auf der oberen Hälfte erfolgte dann der Nachweis des Pgps mit einem
Molekulargewicht von 170 kDa, auf dem unteren Membranabschnitt wurde ß-Aktin (42 kDa)
nachgewiesen.
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