TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
Transport-Assay nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden
2) Inhibitor lösen: 5 mM TQD in DMSO oder 8,23 mM PSC833 in Ethanol/Tween80 (9:1) und A.
bidest.
3) Versuchsmedium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten
TQD wird in einer Konzentration von 0,5 µM, PSC833 in einer Endkonzentration von 10 µM
verwendet.
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die
Inkubation mit dem Inhibitor
5) Absaugen des Medium in den Transwell-Inserts (erst basolateral, dann apikal)
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: Volumen vom Format der Membran-
Inserts abhängig (12Well bzw. 6Well) basolateral: 1,5 bzw. 2,5 ml, apikal 0,7 bzw. 1,5 ml
7) 1 h Vorinkubation (bei 37 °C und 50 U/min)
8) Vorbereitung des Versuchsmediums mit jeweiligem Substrat: Rhodamin 123, Digoxin oder
Verapamil
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123
Digoxin
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin
Verapamil
Stocklösung 1: 4,375 mM Verapamil in Ethanol
Stocklösung 2: Stocklösung 1 im Versuchsmedium verdünnen (43,75 µM)
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Verapamil
Vom Versuchsmedium: Medium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten
9) Medium für Permeabilitätskontrolle ansetzen:
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (basolateral: 1,5 bzw. 2,7 ml, apikal: 0,7 bzw. 1,5 ml)
Das Medium mit Substrat wird in beide Kammern gegeben. Die Probenentnahme erfolgt
ebenfalls aus beiden Kammern.
Mannitol wird nur in die basolaterale Kammer geben, apikal erfolgen nur die Zugabe des
Versuchsmediums sowie auch die Probenentnahme.
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten aus beiden Kammern: 50 bzw. 100 µl
basolateral, 70 bzw. 130 µl apikal
14) Weiteres Vorgehen siehe Bidirektionaler Transport-Assay
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.
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