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ANHANG
Aussaat und Kultivierung der Zellen
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6- und 12Well-Membraneinlagen, für Transportversuche nach
der bidirektionalen Methode wurden lediglich 6Well-Membraninserts verwendet. Für die hCMEC/D3-
und rBCEC-Zellen wurden die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. einem Gemisch aus
Collagen IV und Fibronectin beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage bis zur Konfluenz kultiviert und
i.d.R. ab dem 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transportversuch verwendet. Für alle
Gruppen wurde fast ausschließlich eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.
Für Transportversuche mit den hCMEC/D3-Zellen wurden diese in verschiedenen Medien
kultiviert und zwei verschiedene Versuchsmedien verwendet. Des Weiteren wurden die Zellen 1 Tag
vor dem Versuch mit und ohne 1 nM Simvastatin kultiviert.
Bidirektionaler Transport-Assay
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden
2) Inhibitor lösen: 5 mM Tariquidar in DMSO
3) Versuchsmedium +/-Inhibitor bzw. Versuchsmedium + Vehikel (= Lösungsmittel des Inhibitors:
DMSO) ansetzen
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet.
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die
Inkubation mit Inhibitor
5) Medium in den Transwell-Inserts absaugen (erst basolateral, dann apikal)
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: 2,5 ml basolateral, 1,5 ml apikal
7) 1 h Vorinkubation (bei 50 U/min und bei 37 °C)
8) Medium für Permeabilitätskontrolle vorbereiten:
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol
9) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Vom
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123
Versuchsmedium
Digoxin
Medium + Inhibitor
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
bzw. Vehikel
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)
vorbereiten
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (2,7 ml basolateral, 2 ml apikal)
Das Medium mit Substrat wird nur in eine der beiden Kammern gegeben, entweder apikal oder
basolateral. Die Probenentnahme erfolgt kontralateral.
Mannitol nur in basolaterale Kammer geben, apikal erfolgt nur die Zugabe des
Versuchsmediums. Aus dieser Kammer werden auch die Proben entnommen.
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten: 100 µl Probenvolumen aus der kontralateralen
Kammer
Zusätzlich Entnahme von Ausgleichsvolumina: apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl
14) Versuchsende: Entnahme der letzten Proben, erneute TEER-Messung, entsprechende
Entsorgung der verbleibenden Flüssigkeiten
15) Messung der Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät (FLUOStar
OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid Scintillator System
LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)
16) Berechnung des Substratgehalts mit Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim)
17) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.
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