TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ANHANG 8) Versuchsende: Entnahme von je 100 µl Mediumproben, restliches Medium absaugen, Platten auf Eis halten 9) Zellen mit eiskaltem PBS waschen, Zellen mit Schaber lösen, in je 500 µl PBS aufnehmen und in ein Eppendorfgefäß überführen 10) Zentrifugieren der Zellen bei 250xg für 8 min bei 4 °C 11) Überstand entfernen, Zugabe von je 150 µl Lysispuffer, Zellen resuspendieren 12) Entnahme von 100 µl Zelllysat und Transfer auf schwarze 96Well-Platten 13) Messung der Lysate, Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät (FLUOStar OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid Scintillator System LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA) Proteinbestimmung 1) Zentrifugation des verbleibenden Zelllysats bei 18550xg und 4 °C für 15 min 2) Überführen der Überstande in neue Eppendorfgefäße 3) Pro Probe 10 µl Volumen auf 96Well-Platte pipettieren (i.d.R. unverdünnt und 1:2 verdünnt), zusätzlich 10 µl pro Konzentration der BSA-Standardreihe 4) Ansetzen der Reaktionslösung: Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung im Verhältnis 50:1 mischen (BCA-Assay-Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA) 5) Zugabe von je 200 µl Reaktionslösung, 30 min bei 37 °C dunkel inkubieren 6) Messung der optischen Dichte, Ermittlung der Eichkurve 7) Berechnung der Proteinkonzentration (mg/ml) anhand der Eichkurve mit Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim) Auswertung 1) Berechnung des Substratgehalts anhand der Proteinkonzentration 2) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA) Für alle Versuche erfolgte die Auswertung der Ergebnisse so, dass zweiseitig und stets gegen die Kontrolle getestet wurde. 214
ANHANG 8.5 Durchführung eines Transport-Assays Medien und Puffer PBS (pH 7,3) Versuchsmedium Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ® Versuchspuffer HBSS-Puffer (Hank’s Balanced Salt Solution; 1x) 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 1 mM Natriumpyruvat Medien zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf Transwell-Inserts 1. Normales Kulturmedium EBM-2 Medium 5 % (v/v) FKS 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin 1 % (v/v) HEPES 0,01 % Hydrocortison 0,1 % bFGF 0,5 % (v/v) Ascorbinsäure 1 % Lipidkonzentrat 2. Medium mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren EBM-2 Medium 2,5 % (v/v) FKS 1 % Penicillin/Streptomycin 0,05 % (v/v) Hydrocortison 0,1 % (v/v) bFGF Je 0,025 % Ascorbinsäure, VEGF, IGF, EGF 3. Medium mit weniger Zusätzen EBM-2 Medium 2,5 % FKS 1 % Penicillin/Streptomycin 1 % HEPES 0,00055 % Hydrocortison 0,1 % bFGF 24 h vor dem Transportversuch Zugabe von 1 nM Simvastatin: Stocklösung 1: 60 mM; dazu Simvastatin in Ethanol lösen (50 mg/ml), Zugabe von 0,813 ml 1 N Natriumhydroxid und Einstellen des pH-Werts auf 7,2. Stocklösung 2: Stocklösung 1 in Medium verdünnen (1 µM) 1 Tag vor dem Versuch wird Simvastatin dem Zellkulturmedium so zugegeben, dass es in einer Konzentration von 1 nM im Medium gelöst ist. Medien zur Kultivierung der rBCEC-Zellen auf Transwell-Inserts Medium C: Siehe Abschnitt 8.2 24 h vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung (20:1): 12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal 6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal 215
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ANHANG<br />
8.5 Durchführung eines Transport-Assays<br />
Medien und Puffer<br />
PBS (pH 7,3)<br />
Versuchsmedium<br />
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®<br />
Versuchspuffer<br />
HBSS-Puffer (Hank’s Balanced Salt Solution; 1x)<br />
10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)<br />
1 mM Natriumpyruvat<br />
Medien zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf Transwell-Inserts<br />
1. Normales Kulturmedium<br />
EBM-2 Medium<br />
5 % (v/v) FKS<br />
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
1 % (v/v) HEPES<br />
0,01 % Hydrocortison<br />
0,1 % bFGF<br />
0,5 % (v/v) Ascorbinsäure<br />
1 % Lipidkonzentrat<br />
2. Medium mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren<br />
EBM-2 Medium<br />
2,5 % (v/v) FKS<br />
1 % Penicillin/Streptomycin<br />
0,05 % (v/v) Hydrocortison<br />
0,1 % (v/v) bFGF<br />
Je 0,025 % Ascorbinsäure, VEGF, IGF, EGF<br />
3. Medium mit weniger Zusätzen<br />
EBM-2 Medium<br />
2,5 % FKS<br />
1 % Penicillin/Streptomycin<br />
1 % HEPES<br />
0,00055 % Hydrocortison<br />
0,1 % bFGF<br />
24 h vor dem Transportversuch Zugabe von 1 nM Simvastatin:<br />
Stocklösung 1: 60 mM; dazu Simvastatin in Ethanol lösen (50 mg/ml), Zugabe von 0,813 ml 1 N<br />
Natriumhydroxid und Einstellen des pH-Werts auf 7,2.<br />
Stocklösung 2: Stocklösung 1 in Medium verdünnen (1 µM)<br />
1 Tag vor dem Versuch wird Simvastatin dem Zellkulturmedium so zugegeben, dass es in einer<br />
Konzentration von 1 nM im Medium gelöst ist.<br />
Medien zur Kultivierung der rBCEC-Zellen auf Transwell-Inserts<br />
Medium C: Siehe Abschnitt 8.2<br />
24 h vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung (20:1):<br />
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
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