TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
8) Versuchsende: Entnahme von je 100 µl Mediumproben, restliches Medium absaugen, Platten auf
Eis halten
9) Zellen mit eiskaltem PBS waschen, Zellen mit Schaber lösen, in je 500 µl PBS aufnehmen und in
ein Eppendorfgefäß überführen
10) Zentrifugieren der Zellen bei 250xg für 8 min bei 4 °C
11) Überstand entfernen, Zugabe von je 150 µl Lysispuffer, Zellen resuspendieren
12) Entnahme von 100 µl Zelllysat und Transfer auf schwarze 96Well-Platten
13) Messung der Lysate, Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät
(FLUOStar OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid
Scintillator System LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)
Proteinbestimmung
1) Zentrifugation des verbleibenden Zelllysats bei 18550xg und 4 °C für 15 min
2) Überführen der Überstande in neue Eppendorfgefäße
3) Pro Probe 10 µl Volumen auf 96Well-Platte pipettieren (i.d.R. unverdünnt und 1:2 verdünnt),
zusätzlich 10 µl pro Konzentration der BSA-Standardreihe
4) Ansetzen der Reaktionslösung: Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung im Verhältnis 50:1
mischen (BCA-Assay-Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA)
5) Zugabe von je 200 µl Reaktionslösung, 30 min bei 37 °C dunkel inkubieren
6) Messung der optischen Dichte, Ermittlung der Eichkurve
7) Berechnung der Proteinkonzentration (mg/ml) anhand der Eichkurve mit Excel ® (Microsoft,
Unterschleißheim)
Auswertung
1) Berechnung des Substratgehalts anhand der Proteinkonzentration
2) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)
Für alle Versuche erfolgte die Auswertung der Ergebnisse so, dass zweiseitig und stets gegen
die Kontrolle getestet wurde.
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