TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
8.4 Durchführung eines Kumulations-Assays
Medien und Puffer
PBS (pH 7,3)
Versuchsmedium
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®
Collagen I-Lösung (für hCMEC-, GPNT-und RBE4-Zellen)
Collagen I in 0,2 % Essigsäure lösen (2 mg/ml)
1:50 Verdünnung der Stocklösung
1h bei 37 °C inkubieren, Collagen-Lösung abnehmen und Zellkulturgefäße unter der Sterilbank
trocknen lassen
Collagen IV-Lösung (für rBCEC-Zellen)
Siehe Abschnitt 8.2
Lysis-Puffer (pH 8,0)
25 mM Tris
50 mM NaCl
0,5 % (w/v) Natrium-deoxycholat
0,5 % (v/v) Triton X-100
Frisch zugesetzt: 1x Protease Inhibitor Cocktail Complete ®
Lagerung bei 4 °C
Aussaat und Kultivierung der Zellen
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6Well-Platten. Für die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen wurden
die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. Collagen IV beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage
bis zur Konfluenz kultiviert und i.d.R. ab dem dritten Tag der Konfluenz behandelt. Für alle Gruppen
wurde eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.
Kumulations-Assay
1) Vorbereiten des Assay-Mediums mit Inhibitor Tariquidar (TQD):
Stocklösung: 5 mM TQD in DMSO
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet
2) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop; Auswahl der Wells, die mit dem
Inhibitor inkubiert werden
3) Absaugen des Mediums, Opti-MEM ® +/- Inhibitor auf die Zellen geben (3 ml Medium pro Well)
4) Inkubation der Zellen für 1 h im Inkubator bei 50 U/min
5) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Opti-MEM ® + 10 µM Rhodamin 123
Digoxin
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
Stocklösung 2: Opti-MEM ® + Stocklösung 1 (100 µM)
Versuchsmedium: Opti-MEM ® + 1 µM Stocklösung 2 + 10 kBq/ml 3 H-Digoxin
Vom Versuchsmedium: Medium + TQD ansetzen (0,5 µM TQD)
6) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (3 ml/Well)
7) Inkubation für 2 h bei 37 °C und bei 50 U/min
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