TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
8.3 Gewinnung primärer Astrozyten der Ratte
Medien und Puffer
PBS (pH 7,3)
PBS (pH 7,3) + 2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Siehe Abschnitt 8.2 Lagerung bei 4 °C
Dissoziationslösung
9,2 ml DMEM
0,4 ml Trypsin/EDTA-Lösung (10x) alle Lösungen
0,2 ml HEPES (1 M) mischen und
0,1 ml DNAse I (Endkonzentration: 0,1 mg/ml) sterilfiltrieren
0,1 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)
Astrozyten-Medium
DMEM Low Glucose
10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Präparation
1) 5-6 Ratten (0-3 Tage alt, P0-P3) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im
Becherglas mit PBS + 2% Penicillin/Streptomycin auf Eis sammeln
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren, Stammhirn und Kleinhirn entfernen, Cortices in
Petrischale mit eiskaltem PBS + 2 % Penicillin/Streptomycin sammeln
3) Cortices auf Filterpapier von Meningen befreien, Cortexhälften trennen, Hippocampus durch
Herausrollen entfernen Cortices in 15 ml-Röhrchen mit Puffer sammeln, Lagerung auf Eis!
4) Puffer absaugen, Dissoziationslösung zugeben, Cortices mit 10 ml-Pipette homogenisieren
5) Homogenat 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, regelmäßig schütteln
6) Verdau sorgfältig mit 10 ml-Pipette dissoziieren
7) 5 min bei 400xg zentrifugieren, Überstand absaugen (oder dekantieren)
8) Pellet in 10 ml Astrozytenmedium resuspendieren
9) 5 min bei 200xg zentrifugieren, Überstand absaugen
10) Pellet in 6 ml Astrozytenmedium (1 ml/Gehirn) aufnehmen
11) Zellsuspension durch ein Gewebesieb filtrieren (erst 70 µm, dann 40 µm)
12) Aussaat der Zellen in 25 cm 2 Flaschen (3-4 Gehirne/Flasche)
Kultivierung
1) mikroskopische Kontrolle am nächsten Tag, Medium absaugen, abgesetzte Zellen mit
Astrozytenmedium vorsichtig waschen, neues Medium hinzugeben
2) alle 2-3 Tage Mediumswechsel
3) Entfernung der Oligodendrozyten und Mikroglia: Flaschen bei 250 Umdrehungen/min (U/min)
schütteln für einige Stunden oder über Nacht
4) bei ca. 90 % Konfluenz: Passage oder Kryokonservierung
5) für Kokultur mit Hirnkapillarendothelzellen: bei 70-80 % Konfluenz Aussaat der Astrozyten 3 Tage
vor Endothelzellen
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