TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ANHANG
Collagen IV-Fibronectin-Lösung
Collagen IV in A. bidest. lösen (1 mg/ml)
270 µl Collagen IV-Stocklösung
+ 135 µl Fibronectin-Stocklösung (1 mg/ml)
+ 2,295 ml A. bidest.
120 µl der Mischung pro Insert pipettieren, 2 h bei 37 °C inkubieren, Lösung abnehmen, Inserts
unter der Sterilbank trocknen lassen
Präparation
1) 5-6 Ratten (2-3 Wochen alt) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im
Becherglas auf Eis sammeln
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren in Petrischale mit eiskaltem PBS + 1 %
Penicillin/Streptomycin sammeln
3) Kleinhirn abtrennen, auf Filterpapier mit Wattestäbchen von Meningen befreien
4) Stammhirn, Plexus entfernen Cortices in neue Petrischale mit Puffer überführen, Lagerung auf
Eis!
5) Puffer absaugen und Cortices mit Skalpellen zu homogenen Brei zerkleinern
6) 15 ml Enzymlösung zugeben und mit 10 ml-Pipette homogenisieren, in ein 50 ml-Röhrchen
überführen
7) 1,5 h im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln
8) Verdau mit 20 ml 20 % BSA-Lösung mischen, Gemisch auf zwei 50 ml-Röhrchen verteilen
9) 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugieren, Überstand (Myelin) dekantieren und verwerfen, Pellet
mit restlicher Enzym-Lösung resuspendieren
10) 1 h im Wasserbad bei 37 °C inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln
11) Nylonmembran (Porendurchmesser: 80 µm) 3-mal mit 5 ml DMEM/F12 spülen
12) Verdau durch Nylongewebe filtrieren, zurückgehaltene Kapillaren 3-mal vorsichtig mit je 5 ml
DMEM/F-12 waschen, Filtrat verwerfen
13) Kapillaren mit 11 ml Medium A ohne Puromycin vom Filter waschen
14) Pro Petrischale (A = 28 cm 2 ) 5 ml Zellsuspension + 20 µl Puromycin-Lösung (Endkonzentration: 4
µg/ml) versetzen
Kultivierung
1) 3 Tage im Brutschrank kultivieren, mit Medium A waschen, Mediumswechsel auf Medium B
2) Für Aussaat auf Membran-Inserts Beschichtung mit Collagen IV und Fibronectin
3) Bei 70-80 % Konfluenz: Passage auf beschichtete Membran-Inserts (0,5 bzw. 1,5 ml
Zellsuspension pro 12Well bzw. 6Well-Insert), Medium C
4) Alle 2-3 Tage Mediumswechsel: Medium absaugen, sammeln, zentrifugieren, Überstand 1:1 mit
frischem Medium mischen
5) 1 Tag vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal
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