TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ZUSAMMENFASSUNG Diese wurden im Transwell-Modell eingesetzt, um deren Eignung und Pgpspezifischen Transport untersuchen zu können. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der MDT-Hypothese, der damit verbundenen Überexpression der MDT sowie der Etablierung einer humanen Zelllinie als Transwell-Modell. Von besonderem Interesse war dabei das Pgp. Es ist nicht hinreichend geklärt, wodurch eine verstärkte Funktion dieser Transporter bei epileptischen Patienten ausgelöst wird. Ziel der Untersuchungen war es herauszufinden, ob Antiepileptika die Funktionalität von Pgp induzieren. Dazu wurde die humane Zelllinie hCMEC/D3 ausgewählt. Bei hCMEC/D3-Zellen handelt es sich um immortalisierte Endothelzellen aus dem Temporallappen einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin (WEKSLER et al. 2005). Die hCMEC/D3- Zellen exprimieren für Endothelien typische Marker-proteine und werden für In-vitro- Untersuchungen eingesetzt (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In vorläufigen Studien wurden auch primäre Hirnkapillarendothelzellen der Ratte eingesetzt. Der Western Blot ermöglichte den Nachweis von Pgp sowohl in den immortalisierten hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen als auch in den primären Hirnendothelien der Ratte. Die funktionelle Untersuchung wurde mit Hilfe von Kumulations-Assays mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 durchgeführt. Dazu wurden hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen mit den Antiepileptika Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat behandelt. In den Primärkulturen wurden Carbamazepin und Phenytoin untersucht. Die Behandlung erstreckte sich i.d.R. über drei Tage. Im Kumulations-Assay konnte für alle Zelllinien und den primären rBCEC-Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden, dessen Funktion durch bekannte Induktoren und den spezifischen Inhibitor Tariquidar moduliert werden konnte. Dabei zeigten die hCMEC/D3-Zellen funktionelles Pgp, welches sich trotz vergleichsweise geringer Expression nur schwer induzieren ließ. Die Ergebnisse der Kumulations-Assays variierten in den Zellen der verschiedenen Spezies. Die Funktionalität von Pgp wurde nicht von allen Antiepileptika in den gewählten Konzentrationen beeinflusst. Das heißt, dass die getesteten Antiepileptika nicht in allen Zellen induzierende Wirkungen hatten. Die robustesten Effekte in hCMEC/D3-Zellen ließen sich mit Carbamazepin (100 µM) und Valproat (300 µM) zeigen. In RBE4-Zellen induzierte Carbamazepin (50 µM) die Funktionalität Pgps. In den Versuchen mit rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin zu einer 174
ZUSAMMENFASSUNG Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere Konzentrationen der Antiepileptika untersucht werden, um mögliche konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden. Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell- Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol- Permeabilitäten zeigte. Demzufolge führte die Kokultur dieser Gliazellen mit den Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et al. 2002) könnten dazu beitragen, gezielte In-vitro-Untersuchung des Transports von Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen. 175
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Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch<br />
bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit<br />
Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere<br />
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konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser<br />
Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp<br />
vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen,<br />
konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden.<br />
Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse<br />
sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und<br />
Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben<br />
(CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer<br />
Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des<br />
Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen<br />
werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell-<br />
Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol-<br />
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Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der<br />
Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur<br />
teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die<br />
relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass<br />
die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der<br />
immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der<br />
Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des<br />
humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et<br />
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Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen.<br />
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