TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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DISKUSSION Die für Carbamazepin und Phenytoin verwendete Konzentration von 100 µM liegt außerhalb der beim Menschen therapeutischen Plasmakonzentrationen von 17- 51 µM für Carbamazepin und 40-79 µM für Phenytoin (PATSALOS et al. 2008; siehe Tabelle 5.1). Die primären Zellen zeigten während der Behandlung mit den Antiepileptika zwar keine offensichtlichen toxischen Effekte wie beispielsweise Zellablösungen. Dennoch könnte es möglich sein, dass die Zellen nicht mehr in der Lage waren, mit dieser erhöhten Konzentration umzugehen, und es sich bei den durch Carbamazepin und Phenytoin hervorgerufenen Inhibitionen um zellschädigende Auswirkungen handelte. Allerdings berichteten WEISS et al. (2003) nach der Behandlung mit Valproat (> 100 µM) und Phenytoin (> 100 µM) in LLC- Zellen ebenfalls von inhibitorischen Effekten. Aufgrund der Effekte auf den Efflux von Rhodamin durch Induktoren und Inhibitoren kann man aber davon ausgehen, dass in den Primärendothelzellen der Ratte funktionelles Pgp vorhanden ist. Mögliche toxische Effekte für die Primärzellen durch die Behandlung mit Antiepileptika sollten dennoch in Zytotoxizitäts-Assays untersucht werden. Die Zellen beider Rattenstämme zeigten bezüglich des Grundtransports von Rhodamin 123 ein unterschiedliches Ausmaß (Abbildung 5.23 & 5.24), das aber nicht reproduzierbar war. Für Primärkulturen ist bekannt, dass Schwankungen vieler Parameter in Abhängigkeit von den Zellchargen durch Präparation und Reinheit der Kultur auftreten können (ZHANG et al. 2006). Beide zeigten aber die gleichen modulatorischen Effekte nach der Behandlung mit den genannten Substanzen. Carbamazepin bildete eine Ausnahme, da es nur in Hirnendothelzellen der Wistar- Ratten getestet wurde. Die inhibitorischen Effekte durch die Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin bedürfen weiterer Experimente und zusätzlicher niedrigerer Konzentrationen, um die Wirkung von Antiepileptika in den Primärkulturen abzuklären. Abgesehen von der schnelleren Anheftung an Zellkulturmaterialien und dem Wachstum der Endothelzellen der CD-Ratten zeigten die Zellen in Kumulationsversuchen keine Vorteile gegenüber Zellen aus Wistar-Ratten. Die Primärkulturen beider Rattenstämme können aufgrund vergleichbarer Uptake- Ergebnisse für die Untersuchungen der Funktionalität eingesetzt werden. Für weitere Versuche zur Modulation der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika sollten die primären Rattenhirnendothelzellen ohne Hydrocortison kultiviert werden. 164
DISKUSSION 6.2.2 Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen 6.2.2.1 Versuchsbedingungen Für die Untersuchung des Transports wurden zwei verschiedene Rattenstämme, unterschiedliche Pgp-Substrate und Membraneinlagen (Firmen Corning und Greiner) verwendet. Die gewonnenen Hirnzellen wurden nicht immortalisiert, sodass sie nur über einen kurzen Zeitraum für Experimente verwendbar waren und regelmäßig frische Zellen präpariert werden mussten. Dieser Fakt kann konstante Kultivierungsbedingungen erschweren, da die Anheftung, das Wachstum der Zellen sowie weitere Einflussfaktoren chargenabhängig sein können (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). So könnten die variablen Ergebnisse der Transport-Assays erklärt werden. Einer der größten Nachteile des Transwell-Modells ist, dass die bislang eingesetzten immortalisierten Zelllinien aus Endothelien der BHS aufgrund der suboptimalen Expression und Ausbildung der Tight junctions eine relativ hohe parazelluläre Permeabilität zeigen (LIU et al. 2008). Für Transportversuche ist aber die Ausbildung der Tight junctions, die zusammen mit anderen Faktoren zu hohen transendothelialen Widerständen führen, unerlässlich. Es wird beschrieben, dass der TEER-Wert nach Zugabe von cAMP und Ro 20-1724 ansteigt (RUBIN et al. 1991). Beide Substanzen haben Einfluss auf die Struktur und Funktion bestimmter Tightjunction-Proteine und damit auf die Dichtigkeit eines Zellverbands. Die primären Rattenhirnzellen wurden 24 h vor jedem Transportversuch mit diesen beiden Substanzen inkubiert, um die Ausbildung der Tight junctions zwischen den Zellen zu verbessern. Im Vergleich mit den humanen Zellen wurden höhere TEER-Werte gemessen, dennoch war die Mannitol-Permeabilität immer noch sehr hoch (siehe Tabelle 5.6). FRANKE et al. (1999 & 2000) wiesen in primären Hirnendothelzellen des Schweines Mannitol-Permeabilitäten von 17-18 nm/s nach. Deshalb muss man davon ausgehen, dass die Monolayer der primären Rattenhirnendothelzellen nicht ausreichend dicht waren. Es wurden keine Transportversuche durchgeführt, ohne dass die Primärkulturen vorher cAMP und Ro 20-1724 erhielten. Es können also keine Aussagen darüber getroffen werden, ob diese Substanzen in den hier beschriebenen Experimenten einen großen Einfluss hatten oder ob die Primärkulturen auch ohne den Einsatz von cAMP und Ro 20-1724 dichtere Zellmonolayer ausbilden. Des Weiteren wird dem Kulturmedium der rBCEC-Zellen 165
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TEER-Wert nach Zugabe von cAMP und Ro 20-1724 ansteigt (RUBIN et al. 1991).<br />
Beide Substanzen haben Einfluss auf die Struktur und Funktion bestimmter Tightjunction-Proteine<br />
und damit auf die Dichtigkeit eines Zellverbands. Die primären<br />
Rattenhirnzellen wurden 24 h vor jedem Transportversuch mit diesen beiden<br />
Substanzen inkubiert, um die Ausbildung der Tight junctions zwischen den Zellen zu<br />
verbessern. Im Vergleich mit den humanen Zellen wurden höhere TEER-Werte<br />
gemessen, dennoch war die Mannitol-Permeabilität immer noch sehr hoch (siehe<br />
Tabelle 5.6). FRANKE et al. (1999 & 2000) wiesen in primären Hirnendothelzellen<br />
des Schweines Mannitol-Permeabilitäten von 17-18 nm/s nach. Deshalb muss man<br />
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ausreichend dicht waren. Es wurden keine Transportversuche durchgeführt, ohne<br />
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keine Aussagen darüber getroffen werden, ob diese Substanzen in den hier<br />
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