TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

DISKUSSION
Zusammensetzung des Mediums
Für die humanen Zellen wurden ab der Aussaat auf Transwell-Inserts drei
Kulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung (siehe Abschnitt 5.1.4.3 S. 94 f.
und Anhang S. 215) getestet (Wachstumsfaktoren wie VEGF, IGF-1, EGF, ein
reduzierter Serum- und/oder Hydrocortisongehalt) und es konnte kein Einfluss auf
die Integrität der Monolayer und den Transportnachweis in hCMEC/D3-Zellen
nachgewiesen werden. Für den eigentlichen Transportversuch wurde letztlich ein
Puffer verwendet, der sich aus HBSS-Puffer mit 1mM Natriumpyruvat und 10 mM
HEPES zusammensetzte. Dieser wurde u.a. von POLLER et al. (2008) und CARL et
al. (2010) in Transportuntersuchungen mit hCMEC/D3-Zellen verwendet. Mit diesem
Puffer konnte im Gegensatz zum Medium Opti-MEM ® , welches üblicherweise für
Transport-Assays in der hiesigen Arbeitsgruppe verwendet wurde, ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden, weshalb der
HBSS-Puffer für weitere Transport-Assays eingesetzt wurde.
Die Zellen wurden 1 Tag vor dem Transportversuch mit 1 nM Simvastatin
inkubiert (Kultivierungsprotokoll für hCMEC/D3-Zellen für Transport-Assays nach P.-
O. Couraud, Stand 2009). Diese Substanz, welche zu den Statinen gehört, soll u.a.
zur Erhöhung des Wachstumsfaktors VEGF und damit zur Integrität der
Zellmonolayer beitragen (PARK et al. 2008). Vergleichende Transportversuche mit
und ohne Simvastatin ließen aber keine Einflüsse durch diese Substanz auf TEER-
Werte und Mannitol-Permeabilitäten in den Transportversuchen mit den Substraten
Digoxin und Rhodamin 123 erkennen.
Methodik
Die hier beschriebenen Transportversuche wurden größtenteils nach der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA) durchgeführt. Diese Methode gilt als
sensitiver, um v.a. auch schwache Substrate der MDT wie z.B. Antiepileptika
detektieren zu können (LUNA-TORTÓS et al. 2008). Es konnte ein asymmetrischer
Transport der Substanz Rhodamin 123 festgestellt werden (Abbildung 5.15), der aber
nicht konsistent in allen Versuchen nachweisbar war. Andere Arbeitsgruppen, die
Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen durchführten, verwendeten
ausschließlich den bidirektionalen Assay mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 und
bekannten Substraten der Protonen-gekoppelten Oligopeptid-Transporter
(Glycylsarcosin, Carnosin, Histidin und Valacyclovir) (POLLER et al. 2008; CARL et
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