TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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% Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 ERGEBNISSE A 150 125 100 75 Rhodamin 123 (2 µM) hCMEC/D3 P:30 n=3 * * * apikal basolateral * AUC/h: 785,3 50 0 60 120 180 240 min * TEER: 119,0 *cm 2 B 150 125 100 75 * + PSC833 (10 µM) hCMEC/D3 P:30 n=3 * * 50 0 60 120 180 240 min * AUC/h: 760 TEER: 131,3 *cm 2 Veränderung der AUC/h - 3,2 % C Rhodamin 123 (2 µM) hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15 n=3 D + PSC833 (10 µM) hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15 n=3 150 125 100 * * * * * 150 125 100 * * * * * - 44,1 % 75 AUC/h: 716,3 TEER: 162,6 *cm 2 50 0 60 120 180 240 min 75 AUC/h: 400,3 TEER: 164,9 *cm 2 50 0 60 120 180 240 min E Rhodamin 123 (2 µM) hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7 n=6 F + TQD (0,5 µM) hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7 n=5 150 125 100 * * * 150 125 100 - 56,9 % 75 AUC/h: 147,4 TEER: 155,2 *cm 2 50 0 60 120 180 240 min 75 AUC/h: 63,5 TEER: 163,1 *cm 2 50 0 60 120 180 240 min Abbildung 5.21: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen in Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–F) auf Transwell-Inserts im 12Well-Format (Corning). Die Experimente wurden über eine Dauer von 4 h durchgeführt. Die Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat (A–D) und Polyester (E & F) kultiviert und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Graph A, C und E zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen von Rhodamin 123 gemessen 104
ERGEBNISSE wurden. Unter B, D und F sind Versuche dargestellt, in denen die Inhibition des Substrats durch Hemmstoffe Valspodar (PSC833) und Tariquidar (TQD) untersucht wurde. Alle Experimente zeigten einen asymmetrischen Transport von Rhodamin 123. Die Inhibition des Rhodamin-Transports konnte nicht oder nur teilweise nachgewiesen werden. Die AUC verringerte sich um maximal 56,9 % im Vergleich zum Transport (B, D und F). Für die monokultivierten Zellen (A & B) wurden niedrigere TEER-Werte gemessen als für die kokultivierten Zellen. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 366,5 nm/s für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen (A & B). Für die mit Astrozyten kokultivierten Zellen wurden Mannitol-Permeabilitäten von 191,5 nm/s (C & D) bzw. 24 nm/s (E & F) festgestellt. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt. Die Abbildung 5.21 zeigt, dass der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 nicht vollständig durch die spezifischen Pgp-Inhibitoren PSC833 und Tariquidar gehemmt wurde. Die Graphen B, D und F zeigen jeweils die Ergebnisse nach Inkubation mit den Inhibitoren. Dabei fielen die Konzentrationsunterschiede zwischen den Kammern zwar niedriger aus als ohne Inhibitor (C & E), aber sie waren zumindest für Abbildung 5.21 B & D noch signifikant. Der Transport-Assay (unter Graph E dargestellt) zeigte leichte Konzentrationsunterschiede zwischen der apikalen und basolateralen Kammer, die auf einen Transport von Rhodamin 123 hinweisen. Dieser Transport wurde durch die Zugabe von 0,5 µM Tariquidar vollständig aufgehoben. Der jeweilige Netto-Transport pro Stunde, der als Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) angegeben ist, sollte nach Zugabe eines Inhibitors um mindestens 50 % verringert sein. Die AUC zeigte nach der Inkubation mit den Inhibitoren niedrigere Werte als ohne, der Netto-Transport/h sank um 44,1-56,9 % (D & F). Einmalig verringerte sich die AUC um 3,2 % (B). Die AUC fiel für die Transportversuche auf Polyester-Membranen (E & F) geringer aus als für die Polycarbonat-Inserts (A-D). Die Mannitol-Permeabilitäten für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen lagen bei 366,5 nm/s, damit waren diese im Vergleich zu den kokultivierten Zellen etwa 2- (C & D) bzw. 15-fach erhöht (E & F). 105
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ERGEBNISSE<br />
A<br />
150<br />
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75<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
* * *<br />
apikal<br />
basolateral<br />
*<br />
AUC/h: 785,3<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
*<br />
TEER: 119,0 *cm 2<br />
B<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
*<br />
+ PSC833 (10 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
*<br />
*<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
*<br />
AUC/h: 760<br />
TEER: 131,3 *cm 2<br />
Veränderung<br />
der AUC/h<br />
- 3,2 %<br />
C<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
D<br />
+ PSC833 (10 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
100<br />
* * *<br />
* *<br />
150<br />
125<br />
100<br />
*<br />
*<br />
* * *<br />
- 44,1 %<br />
75<br />
AUC/h: 716,3<br />
TEER: 162,6 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
75<br />
AUC/h: 400,3<br />
TEER: 164,9 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
E<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7<br />
n=6<br />
F<br />
+ TQD (0,5 µM)<br />
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7<br />
n=5<br />
150<br />
125<br />
100<br />
* * *<br />
150<br />
125<br />
100<br />
- 56,9 %<br />
75<br />
AUC/h: 147,4<br />
TEER: 155,2 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
75<br />
AUC/h: 63,5<br />
TEER: 163,1 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.21: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen in<br />
Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–F) auf Transwell-Inserts im<br />
12Well-Format (Corning). Die Experimente wurden über eine Dauer von 4 h durchgeführt. Die<br />
Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat (A–D) und Polyester (E & F) kultiviert<br />
und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Graph A, C und E<br />
zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen von Rhodamin 123 gemessen<br />
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