TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ERGEBNISSE verschiedenen Materialien (Polyester und Polycarbonat) dargestellt, auf den genauer unter den genannten Punkten eingegangen wird. 5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay Die ersten Versuche wurden mittels der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA), die sich für den Nachweis des Transports von Antiepileptika als sensitiver erwiesen hat, durchgeführt. Dies führte aber nur bedingt zum Nachweis eines asymmetrischen Transports, weshalb weitere Transportversuche mit der bidirektionalen Methode durchgeführt wurden. Andere Arbeitsgruppen, die Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen durchführen, verwenden ausschließlich den bidirektionalen Assay (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). Daher wurde dieser zum Vergleich mit dem CETA angewandt. Es wurde nur die Substanz Rhodamin 123 als Substrat eingesetzt. Digoxin wurden unter diesen Bedingungen nicht untersucht. Wenn die Transportratio einen Wert von mindestens 1,5 aufweist, spricht man von einem Transport. Mit der bidirektionalen Methode gelang es nicht, einen eindeutigen asymmetrischen Transport nachzuweisen. In Abbildung 5.18 A war ein geringer asymmetrischer Transport zu erkennen, der allerdings eine Transportrate von nur 1,2 aufwies. Alle Transportraten für die hCMEC/D3-Zellen zeigten niedrigere Werte als 1,5. Obwohl in diesem Zusammenhang Medien mit einem unterschiedlichem Ausmaß an Mediumszusätzen (v.a. Wachstumsfaktoren) getestet wurden, ließ dies keinen Einfluss erkennen. Die Mannitol-Permeabilität war stets höher als der Grenzwert von 12 nm/s. Es fiel auf, dass die Greiner-Membraneinlagen eine höhere Transportrate aufwiesen, aber die TEER-Werte niedriger ausfielen. Dies ist mit den Ergebnissen der Transportversuche nach der CETA-Methode vergleichbar. Deshalb wurde für weitere Transportversuche die Konzentrationsgleichgewichtsmethode angewandt. 98
% Rhodamin 123 % Digoxin % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 ERGEBNISSE A C 100 80 60 25 20 15 10 5 Greiner Inserts hCMEC/D3 P:32 n=6 TR: 1,2 TEER: 20,6 *cm 2 * * * * b-A a-B 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 min 100 80 60 25 20 15 10 5 Corning Inserts hCMEC/D3 P:36 n=2 TR: 1,12 TEER: 49,0 *cm 2 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 min * B D 100 80 60 25 20 15 10 5 Corning Inserts hCMEC/D3 P:35 n=1 TR: 1,04 TEER: 53,2 *cm 2 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 min 100 75 50 25 Corning Inserts; LLC-Wt Digoxin n=3 TR: 3,8 TEER: 378,8 *cm 2 * * * * * 0 0 120 240 360 480 600 min Abbildung 5.18: Bidirektionale Transport-Assays mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen (A-C) und Beispiel eines bidirektionalen Transports von Digoxin in LLC-Wildtyp (Wt)-Zellen von C. Luna-Tortós (D). Der Transport-Assay wurde über einen Zeitraum von 2 h (A-C) bzw. 6 h (D) auf Membranen im 6Well-Format der Hersteller Greiner (A) und Corning (B-D) durchgeführt. Die Zellen wurden am 7. bzw. 8. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch eingesetzt. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 17,4 %/h (A), 11,4 %/h (B), und 9,9 (C) %/h. Die Widerstände für die hCMEC/D3-Zellen zeigten Werte von 20–53 Ω*cm 2 . Für den unter C gezeigten Versuch wurde Medium mit mehr Wachstumsfaktoren für die Zellkultivierung verwendet. Für A und B wurden die Zellen mit dem unter Material und Methoden beschriebenen Medium kultiviert. Die Transportratio lag für die unter A-C dargestellten Versuche < 1,5. Ein Transport von Rhodamin 123 konnte nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis eines asymmetrischen Transports von Digoxin (TR: 3,8) konnte in den LLC-Zellen erbracht werden. Der TEER lag bei 378,3 Ω*cm 2 . Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Digoxin-Konzentrationen in den beiden Kammern wurden mittels Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05). Abkürzung: TR: Transportratio 99
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% Rhodamin 123<br />
% Digoxin<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
C<br />
100<br />
80<br />
60<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Greiner Inserts<br />
hCMEC/D3 P:32<br />
n=6<br />
TR: 1,2<br />
TEER: 20,6 *cm 2<br />
* * * *<br />
b-A<br />
a-B<br />
0<br />
0 15 30 45 60 75 90 105 120<br />
min<br />
100<br />
80<br />
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5<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=2<br />
TR: 1,12<br />
TEER: 49,0 *cm 2<br />
0<br />
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min<br />
*<br />
B<br />
D<br />
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20<br />
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5<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=1<br />
TR: 1,04<br />
TEER: 53,2 *cm 2<br />
0<br />
0 15 30 45 60 75 90 105 120<br />
min<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
Corning Inserts; LLC-Wt<br />
Digoxin<br />
n=3<br />
TR: 3,8<br />
TEER: 378,8 *cm 2<br />
*<br />
* * * *<br />
0<br />
0 120 240 360 480 600<br />
min<br />
Abbildung 5.18: Bidirektionale Transport-Assays mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen<br />
(A-C) und Beispiel eines bidirektionalen Transports von Digoxin in LLC-Wildtyp (Wt)-Zellen von<br />
C. Luna-Tortós (D). Der Transport-Assay wurde über einen Zeitraum von 2 h (A-C) bzw. 6 h (D)<br />
auf Membranen im 6Well-Format der Hersteller Greiner (A) und Corning (B-D) durchgeführt. Die<br />
Zellen wurden am 7. bzw. 8. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch eingesetzt. Die<br />
Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 17,4 %/h (A), 11,4 %/h (B), und 9,9 (C) %/h. Die<br />
Widerstände für die hCMEC/D3-Zellen zeigten Werte von 20–53 Ω*cm 2 . Für den unter C<br />
gezeigten Versuch wurde Medium mit mehr Wachstumsfaktoren für die Zellkultivierung<br />
verwendet. Für A und B wurden die Zellen mit dem unter Material und Methoden beschriebenen<br />
Medium kultiviert. Die Transportratio lag für die unter A-C dargestellten Versuche < 1,5. Ein<br />
Transport von Rhodamin 123 konnte nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis eines<br />
asymmetrischen Transports von Digoxin (TR: 3,8) konnte in den LLC-Zellen erbracht werden.<br />
Der TEER lag bei 378,3 Ω*cm 2 .<br />
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den<br />
Digoxin-Konzentrationen in den beiden Kammern wurden mittels Two-way ANOVA und dem<br />
Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05).<br />
Abkürzung: TR: Transportratio<br />
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