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ERGEBNISSE -funktionen, Unabhängigkeit der Zellen vom pH-Wert) zugefügt. In zwei einzelnen Versuchen konnte auf diese Weise ein Transport von Rhodamin 123 festgestellt werden (Abbildung 5.15 C & D). Diese Ergebnisse waren aber auf 6Well- Membraneinlagen nicht reproduzierbar. 5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials Ein weiterer beeinflussender Faktor ist das Material der Membraneinlagen, auf denen die Zellen für die Transportversuche kultiviert werden. Bisher wurden in der Arbeitsgruppe Membraneinlagen der Firma Corning verwendet. Aufgrund von Lieferproblemen wurde der Herstellungsprozess der Membranen geändert, was Einfluss auf die Versuchsergebnisse hatte. Es wurde notwendig, Membranen verschiedener Hersteller zu untersuchen. Für die humanen Zellen wurden Membraneinlagen der Firma Greiner und des bisherigen Herstellers Corning miteinander verglichen. Auffällig war, dass die Membraneinlagen der Firma Greiner (gleiche Porengröße, aber höhere Porendichte) für die hCMEC/D3-Zellen stets niedrigere TEER-Werte zeigten als die von Corning (siehe Abschnitt 5.1.4.1), obwohl die Mannitol-Permeabilität für beide Hersteller ähnlich hoch war. Einmalig wurden auch Membraneinlagen der Firma Millipore verwendet. Die Membran-Inserts der Firma Greiner schienen laut diesen Transport-Assays zur Untersuchung des Transports in hCMEC/D3-Zellen geeigneter zu sein. Dieser Versuch wurden unter den gleichen und auch leicht modifizierten Bedingungen mehrere Male wiederholt, dennoch konnte dieses Ergebnis nicht reproduziert werden. Nach diesen Versuchen kann keinem der Membraneinlagen-Hersteller ein Vorzug für Transportversuche der Konzentrationsgleichgewichtsmethode gegeben werden. 96
% Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Rhodamin 123 ERGEBNISSE A Greiner Inserts hCMEC/D3 P:34 n=5 B Corning Inserts hCMEC/D3 P:34 n=3 150 125 100 apikal basolateral 150 125 100 75 * * TEER: 22,1 *cm 2 75 50 0 60 120 180 240 300 360 min TEER: 46,7 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min C 150 Millipore Inserts hCMEC/D3 P:35 n=3 125 100 75 TEER: 22,5 *cm 2 50 0 60 120 180 240 min Abbildung 5.17: CETA mit 2 µM Rhodamin 123. Es wurde der Einfluss des Membranmaterials verschiedener Hersteller untersucht. Alle Gruppen erhielten am Tag vor dem Versuch 1 nM Simvastatin. Der Transport wurde über 6 bzw. 4 h auf Membranen im 6Well- Format beobachtet. Die Zellen wurden am 7. bzw. 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die Versuche verwendet. Die Monolayer auf Greiner-Inserts zeigten trotz niedrigeren Widerstands einen Transport von basolateral nach apikal innerhalb der ersten Stunde des Assays. Die Mannitol-Permeabilität in den Transportversuchen mit Rhodamin 123 zeigte einen Wert von 77 nm/s, für die Monolayer auf Millipore-Inserts 112 nm/s. Ein Transport des Substrats Rhodamin 123 war mit Inserts der Hersteller Corning und Millipore nicht festzustellen. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet. Die ersten Transportexperimente wurden mit dem Material Polyester durchgeführt. In den Abschnitten 5.1.4.6 (Einfluss des Formats der Membraneinlagen) und 5.1.4.7 (Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit Astrozyten) ist neben einem anderen Format auch der Vergleich zwischen zwei 97
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% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Greiner Inserts<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
B<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
100<br />
apikal<br />
basolateral<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* * TEER: 22,1 *cm 2<br />
75<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
TEER: 46,7 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
C<br />
150<br />
Millipore Inserts<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=3<br />
125<br />
100<br />
75<br />
TEER: 22,5 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.17: CETA mit 2 µM Rhodamin 123. Es wurde der Einfluss des<br />
Membranmaterials verschiedener Hersteller untersucht. Alle Gruppen erhielten am Tag vor<br />
dem Versuch 1 nM Simvastatin. Der Transport wurde über 6 bzw. 4 h auf Membranen im 6Well-<br />
Format beobachtet. Die Zellen wurden am 7. bzw. 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die<br />
Versuche verwendet. Die Monolayer auf Greiner-Inserts zeigten trotz niedrigeren Widerstands<br />
einen Transport von basolateral nach apikal innerhalb der ersten Stunde des Assays. Die<br />
Mannitol-Permeabilität in den Transportversuchen mit Rhodamin 123 zeigte einen Wert von 77<br />
nm/s, für die Monolayer auf Millipore-Inserts 112 nm/s. Ein Transport des Substrats Rhodamin<br />
123 war mit Inserts der Hersteller Corning und Millipore nicht festzustellen. Die Werte sind als<br />
Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und<br />
dem Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.<br />
Die ersten Transportexperimente wurden mit dem Material Polyester<br />
durchgeführt. In den Abschnitten 5.1.4.6 (Einfluss des Formats der<br />
Membraneinlagen) und 5.1.4.7 (Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit<br />
Astrozyten) ist neben einem anderen Format auch der Vergleich zwischen zwei<br />
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