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ERGEBNISSE Für Digoxin sowie auch für Verapamil konnte kein Transport nachgewiesen werden. Für Rhodamin 123 hingegen konnte in einem Experiment ein Transport dieser Substanz über die ersten 60 min festgestellt werden (5.15 C). Dieser war aber nach den folgenden Probenzeitpunkten nicht mehr nachweisbar. In einem einzelnen Versuch, der unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, konnte erneut ein Transport von Rhodamin 123 in den ersten 90 min nachgewiesen werden (5.15 D). In weiteren Wiederholungen dieses Experiments mit monokultivierten humanen Zellen war der Nachweis eines Transports nicht mehr möglich (Daten nicht gezeigt). 5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze Des Weiteren wurde der Einfluss der Zusammensetzung des Mediums untersucht. Das Medium und v.a. der zeitliche Ablauf einzelner Medien zur Kultivierung und zur Versorgung der Zellen ab Erreichen der Konfluenz wurde den Protokollen anderer Arbeitsgruppen nachempfunden. Besonders der Zusatz der Substanz Simvastatin (aus der Gruppe der Statine, lipidsenkend) in der Konzentration von 1 nM sollte großen Einfluss auf die Dichtigkeit der Zellmembran haben und wurde nach dem Protokoll von P.-O. Couraud dem Medium einen Tag vor dem Transportversuch zugefügt Dennoch ließ sich das in den durchgeführten Transport-Assays nicht zeigen. Es wurden Versuche mit und ohne den Zusatz von 1 nM Simvastatin (1 Tag vor dem Versuch) durchgeführt. Ein entscheidender Einfluss auf den Transport war nicht zu erkennen. Zusätzlich zu Simvastatin wurden verschiedene Medien zur Kultivierung der humanen Zellen getestet. Zum einen wurde ein Basalmedium, welches mit Serum, Hydrocortison, Antibiotika, Lipidkonzentrat und einem Wachstumsfaktor (bFGF) versetzt wurde, verwendet. Dies entsprach dem normalen Kulturmedium, welches auf Seite 42 beschrieben ist. Zum anderen wurde dieses Kulturmedium mit den bereits genannten Inhaltsstoffen sowie noch weiteren Wachstumsfaktoren (Vascular Endothelial Growth Factor VEGF, Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1, Epidermal Growth Factor EGF) versetzt. Eine weitere, reduzierte Variante des Mediums wurde verwendet, sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben. Dieses Medium enthielt weniger Serum (2,5 %) und Wachstumsfaktoren (nur bFGF) und sollte die möglichen Wechselwirkungen des Kulturmediums mit den Versuchssubstanzen verringern. Dennoch hatten die Komponenten des Mediums und deren Konzentrationen keinen Einfluss auf das Ergebnis des Transport-Assays (Daten nicht gezeigt). Alle 94
% Rhodamin 123 % Rhodamin 123 ERGEBNISSE Zusammensetzungen der getesteten Medien sind im Anhang (siehe S. 215) aufgeführt. A + 1 nM Simvastatin hCMEC/D3 P:37 n=5 B - Simvastatin hCMEC/D3 P:30 n=5 150 125 apikal basolateral 150 125 100 100 75 TEER: 17,9 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min 75 TEER: 40,2 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min Abbildung 5.16: Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 (2 µM) in Abhängigkeit der Substanz Simvastatin. Der Transport wurde über 6 h auf Corning-Membranen im 6Well-Format beobachtet. Die Zellen wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Die Monolayer, die Simvastatin vor dem Versuchen erhielten, zeigten eine Mannitol- Permeabilität von 98 nm/s. Ohne Simvastatin lag die Permeabilität bei 75 nm/s. Die Zellen, die kein Simvastatin erhielten, zeigten 2-mal höhere Widerstände. Ein Transport von Rhodamin 123 war nicht nachweisbar. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Die verschieden hohen Konzentrationen an Rhodamin 123 in beiden Kammern (B) wurden nicht gekennzeichnet, weil die basolaterale Konzentration höher als die in der apikalen Kammer war. Aus diesem Grund wurde nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen. Ein Faktor, der ebenfalls Einfluss auf den Nachweis eines Transports haben kann, ist das Versuchsmedium. Dazu wurde zunächst das Versuchsmedium Opti- MEM ® getestet, welches weder Serum noch Wachstumsfaktoren enthielt. Dieses Medium wird in Transportversuchen mit anderen Zelllinien in der hiesigen Arbeitsgruppe standardmäßig eingesetzt. Ein Transport von Digoxin und Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen konnte aber mit dem Medium Opti-MEM ® nicht nachgewiesen werden. Weiterhin wurde der sogenannte HBSS-Puffer für Transport-Assays verwendet (nach CARL et al. 2010). Diesem Puffer wurde kein Serum, sondern lediglich 1 mM Natriumpyruvat als Energiequelle und 10 mM HEPES als Puffersubstanz (u.a. Gewährleistung der Aufrechterhaltung der Enzymstrukturen und 95
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ERGEBNISSE<br />
Für Digoxin sowie auch für Verapamil konnte kein Transport nachgewiesen<br />
werden. Für Rhodamin 123 hingegen konnte in einem Experiment ein Transport<br />
dieser Substanz über die ersten 60 min festgestellt werden (5.15 C). Dieser war aber<br />
nach den folgenden Probenzeitpunkten nicht mehr nachweisbar. In einem einzelnen<br />
Versuch, der unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, konnte erneut ein<br />
Transport von Rhodamin 123 in den ersten 90 min nachgewiesen werden (5.15 D).<br />
In weiteren Wiederholungen dieses Experiments mit monokultivierten humanen<br />
Zellen war der Nachweis eines Transports nicht mehr möglich (Daten nicht gezeigt).<br />
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze<br />
Des Weiteren wurde der Einfluss der Zusammensetzung des Mediums<br />
untersucht. Das Medium und v.a. der zeitliche Ablauf einzelner Medien zur<br />
Kultivierung und zur Versorgung der Zellen ab Erreichen der Konfluenz wurde den<br />
Protokollen anderer Arbeitsgruppen nachempfunden. Besonders der Zusatz der<br />
Substanz Simvastatin (aus der Gruppe der Statine, lipidsenkend) in der<br />
Konzentration von 1 nM sollte großen Einfluss auf die Dichtigkeit der Zellmembran<br />
haben und wurde nach dem Protokoll von P.-O. Couraud dem Medium einen Tag vor<br />
dem Transportversuch zugefügt Dennoch ließ sich das in den durchgeführten<br />
Transport-Assays nicht zeigen. Es wurden Versuche mit und ohne den Zusatz von 1<br />
nM Simvastatin (1 Tag vor dem Versuch) durchgeführt. Ein entscheidender Einfluss<br />
auf den Transport war nicht zu erkennen.<br />
Zusätzlich zu Simvastatin wurden verschiedene Medien zur Kultivierung der<br />
humanen Zellen getestet. Zum einen wurde ein Basalmedium, welches mit Serum,<br />
Hydrocortison, Antibiotika, Lipidkonzentrat und einem Wachstumsfaktor (bFGF)<br />
versetzt wurde, verwendet. Dies entsprach dem normalen Kulturmedium, welches<br />
auf Seite 42 beschrieben ist. Zum anderen wurde dieses Kulturmedium mit den<br />
bereits genannten Inhaltsstoffen sowie noch weiteren Wachstumsfaktoren (Vascular<br />
Endothelial Growth Factor VEGF, Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1, Epidermal<br />
Growth Factor EGF) versetzt. Eine weitere, reduzierte Variante des Mediums wurde<br />
verwendet, sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben. Dieses Medium enthielt<br />
weniger Serum (2,5 %) und Wachstumsfaktoren (nur bFGF) und sollte die möglichen<br />
Wechselwirkungen des Kulturmediums mit den Versuchssubstanzen verringern.<br />
Dennoch hatten die Komponenten des Mediums und deren Konzentrationen keinen<br />
Einfluss auf das Ergebnis des Transport-Assays (Daten nicht gezeigt). Alle<br />
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