TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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ERGEBNISSE Für das Substrat Rhodamin 123 wurden in diesem Zusammenhang zusätzlich Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner miteinander verglichen (Daten nicht gezeigt). Aber auch in diesen Experimenten war es nicht möglich, einen Transport durch Pgp nachzuweisen. Die TEER-Werte in diesem nicht dargestellten Versuchen lagen in einem Bereich von 19,9–47,6 Ω*cm 2 . Dabei zeigten die Zellmonolayer, die mit dem humanen Serum kultiviert wurden, in den einzelnen Versuchen geringere Widerstände und höhere Mannitol-Permeabilitäten als die der Gruppe mit bovinem Serum. Humanes Serum hatte unter den hier beschriebenen Bedingungen scheinbar keinen Einfluss auf die Dichtigkeit der Monolayer und demzufolge auf die Detektion des Transports der Substrate Digoxin, Verapamil und Rhodamin 123 (Abbildung 5.15). In den LLC-Zellen, deren Kultivierung mit bovinem Serum erfolgte, wurden etwa 8-mal höhere TEER-Werte gemessen. Die Mehrheit anderer Arbeitsgruppen verwendet zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen ebenfalls bovines Serum. Aus diesem Grund entschieden wir uns ebenfalls für das bovine Serum zur weiteren Kultivierung der humanen Zellen für Transport-Assays. 5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays Die FDA empfiehlt für Studien, die den Transport durch Pgp bzw. die Funktionalität des MDTs untersuchen, die Substanz Digoxin. Diese wurde in der hiesigen Arbeitsgruppe in einer Konzentration von 10 nM in einem Gemisch mit radioaktiv markierten Digoxin verwendet. Für die Untersuchungen der Eignung der humanen Zellen für Transport-Assays wurde deshalb zunächst Digoxin verwendet. Der Nachweis eines asymmetrischen Digoxin-Transports in monokultivierten hCMEC/D3-Zellen war unabhängig vom Ursprung des Serums nicht möglich (Abbildung 5.14). Auch nach Untersuchung weiterer Parameter, wie zum Beispiel Membranmaterial, Mediumkomponenten oder Format der Membraneinlagen, konnte ein Transport von Digoxin nicht nachgewiesen werden. Deshalb wurden anschließend Verapamil, ebenfalls in einem Gemisch mit der radioaktiv markierten Substanz, und der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 für Transportversuche als Pgp-Substrat eingesetzt. In Abbildung 5.15 ist zur besseren Vergleichbarkeit der drei verwendeten Pgp-Substrate ein weiterer Versuch mit Digoxin dargestellt. In diesem Experiment konnte erneut kein asymmetrischer Transport festgestellt werden. 92
% Rhodamin 123 % Rhodamin 123 % Digoxin % Verapamil ERGEBNISSE A 150 125 Digoxin (10 nM) hCMEC/D3 P:36 apikal basolateral n=3 B 150 125 100 Verapamil (10 nM) hCMEC/D3 P:33 n=3 TEER: 21,3 *cm 2 100 75 TEER: 26,9 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min 75 50 0 60 120 180 240 300 360 min C Rhodamin 123 (2 µM) hCMEC/D3 P:34 n=5 D Rhodamin 123 (2 µM) hCMEC/D3 P:34 n=5 150 150 125 100 75 * * 125 100 75 * * * TEER: 22,1 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min TEER: 17,0 *cm 2 50 0 60 120 180 240 300 360 min Abbildung 5.15: Verschiedene Transportuntersuchungen zu Digoxin (10 nM), Verapamil (10 nM) und Rhodamin 123 (2 µM) in hCMEC/D3-Zellen. Der Transport wurde über 6 h auf Membranen im 6Well-Format des Herstellers Greiner beobachtet. Die Zellen wurden in Medium mit bovinem Serum kultiviert und am 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen 72–89 nm/s. Die Widerstände waren für alle vier gezeigten Versuche annähernd gleich. Ein Transport von Digoxin und Verapamil konnte nicht nachgewiesen werden. Für Rhodamin 123 war ein Transport über die ersten 60 min (C) bzw. 90 min (D) des Versuchs nachweisbar. Im weiteren Verlauf dieser beiden Versuche mit Rhodamin 123 war ein asymmetrischer Transport nicht mehr festzustellen. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet. Die Unterschiede zwischen den Verapamil-Konzentrationen in beiden Kammern (B) wurden nicht gekennzeichnet. Die basolaterale Konzentration war höher als die in der apikalen Kammer, weshalb nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen wurde. 93
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% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Digoxin<br />
% Verapamil<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150<br />
125<br />
Digoxin (10 nM)<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
apikal<br />
basolateral<br />
n=3<br />
B<br />
150<br />
125<br />
100<br />
Verapamil (10 nM)<br />
hCMEC/D3 P:33<br />
n=3<br />
TEER: 21,3 *cm 2<br />
100<br />
75<br />
TEER: 26,9 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
75<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
C<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
D<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
150<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* *<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* * *<br />
TEER: 22,1 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
TEER: 17,0 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
Abbildung 5.15: Verschiedene Transportuntersuchungen zu Digoxin (10 nM), Verapamil<br />
(10 nM) und Rhodamin 123 (2 µM) in hCMEC/D3-Zellen. Der Transport wurde über 6 h auf<br />
Membranen im 6Well-Format des Herstellers Greiner beobachtet. Die Zellen wurden in Medium<br />
mit bovinem Serum kultiviert und am 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch<br />
verwendet. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen 72–89 nm/s. Die Widerstände waren<br />
für alle vier gezeigten Versuche annähernd gleich. Ein Transport von Digoxin und Verapamil<br />
konnte nicht nachgewiesen werden. Für Rhodamin 123 war ein Transport über die ersten 60<br />
min (C) bzw. 90 min (D) des Versuchs nachweisbar. Im weiteren Verlauf dieser beiden Versuche<br />
mit Rhodamin 123 war ein asymmetrischer Transport nicht mehr festzustellen. Die Werte sind<br />
als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Two-way ANOVA<br />
und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet. Die<br />
Unterschiede zwischen den Verapamil-Konzentrationen in beiden Kammern (B) wurden nicht<br />
gekennzeichnet. Die basolaterale Konzentration war höher als die in der apikalen Kammer,<br />
weshalb nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen wurde.<br />
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