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ERGEBNISSE
Für das Substrat Rhodamin 123 wurden in diesem Zusammenhang zusätzlich
Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner miteinander verglichen (Daten
nicht gezeigt). Aber auch in diesen Experimenten war es nicht möglich, einen
Transport durch Pgp nachzuweisen. Die TEER-Werte in diesem nicht dargestellten
Versuchen lagen in einem Bereich von 19,9–47,6 Ω*cm 2 . Dabei zeigten die
Zellmonolayer, die mit dem humanen Serum kultiviert wurden, in den einzelnen
Versuchen geringere Widerstände und höhere Mannitol-Permeabilitäten als die der
Gruppe mit bovinem Serum. Humanes Serum hatte unter den hier beschriebenen
Bedingungen scheinbar keinen Einfluss auf die Dichtigkeit der Monolayer und
demzufolge auf die Detektion des Transports der Substrate Digoxin, Verapamil und
Rhodamin 123 (Abbildung 5.15).
In den LLC-Zellen, deren Kultivierung mit bovinem Serum erfolgte, wurden
etwa 8-mal höhere TEER-Werte gemessen. Die Mehrheit anderer Arbeitsgruppen
verwendet zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen ebenfalls bovines Serum. Aus
diesem Grund entschieden wir uns ebenfalls für das bovine Serum zur weiteren
Kultivierung der humanen Zellen für Transport-Assays.
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays
Die FDA empfiehlt für Studien, die den Transport durch Pgp bzw. die
Funktionalität des MDTs untersuchen, die Substanz Digoxin. Diese wurde in der
hiesigen Arbeitsgruppe in einer Konzentration von 10 nM in einem Gemisch mit
radioaktiv markierten Digoxin verwendet. Für die Untersuchungen der Eignung der
humanen Zellen für Transport-Assays wurde deshalb zunächst Digoxin verwendet.
Der Nachweis eines asymmetrischen Digoxin-Transports in monokultivierten
hCMEC/D3-Zellen war unabhängig vom Ursprung des Serums nicht möglich
(Abbildung 5.14). Auch nach Untersuchung weiterer Parameter, wie zum Beispiel
Membranmaterial, Mediumkomponenten oder Format der Membraneinlagen, konnte
ein Transport von Digoxin nicht nachgewiesen werden.
Deshalb wurden anschließend Verapamil, ebenfalls in einem Gemisch mit der
radioaktiv markierten Substanz, und der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 für
Transportversuche als Pgp-Substrat eingesetzt. In Abbildung 5.15 ist zur besseren
Vergleichbarkeit der drei verwendeten Pgp-Substrate ein weiterer Versuch mit
Digoxin dargestellt. In diesem Experiment konnte erneut kein asymmetrischer
Transport festgestellt werden.
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