TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug- Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und deren Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke verschiedener Spezies INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Dana Alms (geb. Neumann) aus Neubrandenburg Hannover 2013
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<strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie<br />
Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug-<br />
Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und<br />
deren Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke<br />
verschiedener Spezies<br />
INAUGURAL – DISSERTATION<br />
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften<br />
- Doctor rerum naturalium -<br />
(Dr. rer. nat.)<br />
vorgelegt von<br />
Dana Alms (geb. Neumann)<br />
aus Neubrandenburg<br />
<strong>Hannover</strong> 2013
Wissenschaftliche Betreuung:<br />
1. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Löscher<br />
2. Univ.-Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn<br />
Institut für Zelluläre Chemie<br />
Medizinische <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
3. Univ.-Prof. Dr. Konstantin Wewetzer<br />
Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie<br />
Medizinische <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Löscher<br />
Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Rita Gerardy-Schahn<br />
Univ.-Prof. Dr. rer. physiol. Konstantin Wewetzer<br />
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Gert Fricker<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2013<br />
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der FAZIT Stiftung gefördert.
Für meine Familie
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... V<br />
1 EINLEITUNG .....................................................................................................................1<br />
2 STAND DER FORSCHUNG ..................................................................................................3<br />
2.1 Epilepsie ...................................................................................................................................... 3<br />
2.1.1 Definition und Bedeutung ................................................................................................................. 3<br />
2.1.2 Temporallappenepilepsie ................................................................................................................. 5<br />
2.1.3 Therapie .............................................................................................................................................. 6<br />
2.2 Pharmakoresistenz .................................................................................................................... 9<br />
2.2.1 Definition und Bedeutung ................................................................................................................. 9<br />
2.2.2 Target-Hypothese ............................................................................................................................ 10<br />
2.2.3 Genvarianz-Hypothese ................................................................................................................... 11<br />
2.2.4 Netzwerk-Hypothese....................................................................................................................... 11<br />
2.2.5 Multidrug-Transporter-Hypothese ................................................................................................. 12<br />
2.3 Bluthirnschranke ..................................................................................................................... 14<br />
2.3.1 Aufbau und Funktion der Barriere ................................................................................................. 14<br />
2.3.2 Selektivität und Substanztransport über die Bluthirnschranke ................................................. 16<br />
2.4 Multidrug-Transporter ............................................................................................................. 17<br />
2.4.1 P-Glykoprotein (Pgp) ...................................................................................................................... 19<br />
2.4.2 Weitere Multidrug-Transporter ...................................................................................................... 21<br />
2.5 Andere Transporter-Familien................................................................................................. 22<br />
2.6 Wechselwirkungen mit Pgp ................................................................................................... 23<br />
2.6.1 Bekannte Pgp-Substrate ................................................................................................................ 26<br />
2.6.2 Bekannte Pgp-Induktoren .............................................................................................................. 27<br />
2.6.3 Bekannte Pgp-Inhibitoren............................................................................................................... 28<br />
2.6.4 Pgp-Trafficking ................................................................................................................................. 29<br />
2.7 In-vivo-Untersuchungen ......................................................................................................... 30<br />
2.8 In-vitro-Untersuchungen ........................................................................................................ 31<br />
2.8.1 Indirekte In-vitro-Modelle ................................................................................................................ 32<br />
2.8.2 Direkte In-vitro-Modelle .................................................................................................................. 32<br />
2.8.3 Primärkulturen.................................................................................................................................. 35<br />
2.8.4 Ko- und Trikulturen .......................................................................................................................... 36<br />
2.8.5 Humanes dynamisches In-vitro-Bluthirnschranken-Modell ....................................................... 37<br />
3 FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT .................................................................... 38<br />
4 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................. 40<br />
4.1 Immortalisierte Zelllinien ........................................................................................................ 40<br />
4.1.1 Humane Hirnkapillarendothelzellen: hCMEC/D3........................................................................ 40<br />
I
4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT ...................................................................................... 41<br />
4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4 ...................................................................................... 42<br />
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte .................................................. 43<br />
4.1.4.1 Tierhaltung ............................................................................................................................ 43<br />
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels .............................................................................. 44<br />
4.1.4.3 Präparation der Astrozyten ................................................................................................. 45<br />
4.2 Kultivierung der Zellen ........................................................................................................... 46<br />
4.2.1 Passagierung ................................................................................................................................... 47<br />
4.2.2 Kryokonservierung .......................................................................................................................... 48<br />
4.2.3 Auftauen der Zellen ......................................................................................................................... 48<br />
4.3 Untersuchung der Funktionalität .......................................................................................... 48<br />
4.3.1 Kumulations-Assay ......................................................................................................................... 51<br />
4.3.2 Transport-Assay .............................................................................................................................. 53<br />
4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot ..................................................................... 59<br />
4.5 Quantifizierung der Substanzen ........................................................................................... 60<br />
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader .................................................. 60<br />
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter ................................................... 60<br />
4.6 Auswertung der Daten und Statistik .................................................................................... 60<br />
5 ERGEBNISSE .................................................................................................................. 62<br />
5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 ....................................................... 62<br />
5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen .................................................................................... 62<br />
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen ................................................................. 63<br />
5.1.3 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Kumulations-Assays ................................................ 65<br />
5.1.3.1 Auswahl des Substrats......................................................................................................... 65<br />
5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität ..................... 68<br />
5.1.3.3 Modulationen der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika ............................................. 74<br />
5.1.3.4 Einfluss des Serums während des Kumulationsversuchs ............................................. 81<br />
5.1.3.5 Hydrocortison und dessen Einfluss auf den Efflux .......................................................... 81<br />
5.1.3.6 Vergleichende Untersuchungen der Pgp-Funktion in Rattenhirnendothelien ............. 84<br />
5.1.3.7 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp ............................................. 87<br />
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays ..................................................... 88<br />
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen......................................................................... 88<br />
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays ................................. 92<br />
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze ................................... 94<br />
5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials ........................................................................................ 96<br />
5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay ........................................................................................ 98<br />
5.1.4.6 Einfluss des Formats der Membraneinlagen ................................................................. 100<br />
II
5.1.4.7 Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit Astrozyten ....................................... 100<br />
5.1.4.8 Überprüfung des Transports durch Pgp ......................................................................... 103<br />
5.1.4.9 Integrität der Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität ................. 106<br />
5.1.4.10 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen ................. 111<br />
5.2 Primärkulturen des Hirnendothels der Ratte (rBCEC) .................................................... 114<br />
5.2.1 Pgp-Expression in rBCEC-Zellen: Western Blot ....................................................................... 114<br />
5.2.2 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Kumulations-Assays ..................................................... 115<br />
5.2.3 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Transport-Assays .......................................................... 119<br />
5.2.3.1 Auswahl des Substrats ..................................................................................................... 119<br />
5.2.3.2 Einfluss des Membranformats und –formats ................................................................. 122<br />
5.2.3.3 Die Kokultivierung der rBCEC-Zellen mit Astrozyten ................................................... 124<br />
5.2.3.4 Geeignete Pgp-Inhibitoren zur Überprüfung des Transports ...................................... 127<br />
5.2.3.5 Integrität primärer Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität ........ 130<br />
5.2.2.6 Zusammenfassung des Transports in primären Hirnendothelien der Ratte ............. 134<br />
6 DISKUSSION ................................................................................................................. 137<br />
6.1 Die humane immortalisierte Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 ......................... 139<br />
6.1.1 Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen ........................................................................................ 139<br />
6.1.2 Die Modulation der Pgp-Funktionalität ...................................................................................... 139<br />
6.1.2.1 Optimierung der Versuchsbedingungen ......................................................................... 140<br />
6.1.2.2 Bekannte Pgp-Induktoren ................................................................................................. 141<br />
6.1.2.3 Antiepileptika ...................................................................................................................... 144<br />
6.1.2.4 Hydrocortison ..................................................................................................................... 148<br />
6.1.2.5 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp ........................................... 149<br />
6.1.3 hCMEC/D3-Zellen als In-vitro-Bluthirnschranken-Modell ........................................................ 150<br />
6.1.3.1 Einflüsse auf den Nachweis von Pgp-spezifischen Transport .................................... 151<br />
6.1.3.2 Die Kokultur mit Astrozyten .............................................................................................. 157<br />
6.1.3.3 Überprüfung eines asymmetrischen Transports ........................................................... 158<br />
6.1.3.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen ................. 159<br />
6.2 Primäre Hirnkapillarendothelien der Ratte (rBCEC) ........................................................ 161<br />
6.2.1 Die Modulation der Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen ......................................................... 162<br />
6.2.2 Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen .............................................................................. 165<br />
6.2.2.1 Versuchsbedingungen ...................................................................................................... 165<br />
6.2.2.2 Die Kokultur mit Astrozyten .............................................................................................. 166<br />
6.2.2.3 Primärkulturen des Hirnkapillarendothels anderer Spezies ........................................ 168<br />
6.2.2.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen ......................... 169<br />
6.3 Schlussbetrachtung .............................................................................................................. 171<br />
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 173<br />
III
SUMMARY ........................................................................................................................... 176<br />
7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 179<br />
8 ANHANG ...................................................................................................................... 206<br />
8.1 Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte ............................................................. 206<br />
8.2 Gewinnung primärer Rattenhirnkapillarendothelien ....................................................... 210<br />
8.3 Gewinnung primärer Astrozyten der Ratte ....................................................................... 212<br />
8.4 Durchführung eines Kumulations-Assays ........................................................................ 213<br />
8.5 Durchführung eines Transport-Assays ............................................................................. 215<br />
8.6 Durchführung eines Western Blots .................................................................................... 218<br />
PUBLIKATIONEN ................................................................................................................... 221<br />
DANKSAGUNG ..................................................................................................................... 223<br />
IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS<br />
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS<br />
AUC<br />
BCRP<br />
BHS<br />
CBZ<br />
CETA<br />
Dex<br />
Dox<br />
DMSO<br />
g<br />
Glu<br />
IBE<br />
ILAE<br />
LEV<br />
MDT<br />
MRP<br />
P<br />
PBS<br />
Pgp<br />
PHB<br />
PHT<br />
Puro<br />
Rif<br />
SEM<br />
TLE<br />
TPM<br />
Vin<br />
VPA<br />
VPM<br />
WHO<br />
ZNS<br />
Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve)<br />
humanes Breast Cancer Resistance Protein<br />
Bluthirnschranke<br />
Carbamazepin<br />
Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assay<br />
(Concentration Equilibrium Transport Assay)<br />
Dexamethason<br />
Doxorubicin<br />
Dimethylsulfoxid<br />
Gravitationsbeschleunigung<br />
Glutamat<br />
Internationales Büro für Epilepsie (International Bureau for Epilepsy)<br />
Internationale Liga gegen Epilepsie (International League Against<br />
Epilepsy)<br />
Levetiracetam<br />
Multidrug-Transporter<br />
Multidrug Resistance-Associated Protein<br />
Passage der Zellen<br />
Phosphat-gepufferte Saline (Phosphate Buffered Saline)<br />
P-Glykoprotein<br />
Phenobarbital<br />
Phenytoin<br />
Puromycin<br />
Rifampicin<br />
Standardfehler (Standard Error of Mean)<br />
Temporallappenepilepsie<br />
Topiramat<br />
Vincristin<br />
Valproat<br />
Verapamil<br />
Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation)<br />
Zentrales Nervensystem<br />
V
EINLEITUNG<br />
1 EINLEITUNG<br />
Epilepsien gehören mit einer Prävalenz von 0,5-1 % in der Bevölkerung zu<br />
den häufigsten chronisch neurologischen Erkrankungen (World Health Organisation<br />
WHO, 2005). Epilepsien sind durch spontane, wiederkehrende Krampfanfälle<br />
charakterisiert (FISHER et al. 2005). Die Standardtherapie bei Epilepsien ist die<br />
Behandlung mit einem oder mehreren antikonvulsiven Medikamenten<br />
(Antiepileptika), die die Anfälle symptomatisch unterdrücken. Etwa ein Drittel der<br />
Patienten spricht nicht auf diese Therapie an. Sie gelten als pharmakoresistent.<br />
Es existieren verschiedene Erklärungsansätze für die Pharmakoresistenz bei<br />
Epilepsien. Eine der favorisierten Hypothesen besagt, dass sogenannte Multidrug-<br />
Transporter (MDT) eine erhöhte Expression in der Bluthirnschranke (BHS)<br />
aufweisen, was zum Auswärtstransport der Antiepileptika aus dem Zielgewebe führt<br />
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). Die physiologische Funktion dieser Efflux-<br />
Transporter ist der Schutz des Gehirns vor potentiell toxischen Substanzen, indem<br />
sie aus dem Gehirn zurück ins Blut transportiert werden. Damit leisten die MDT einen<br />
wichtigen Beitrag zur Aufrechterhaltung der BHS. Die Überexpression des MDT P-<br />
Glykoprotein (Pgp) wurde in Resektionsgeweben pharmakoresistenter<br />
Epilepsiepatienten nachgewiesen (z.B. TISHLER et al. 1995; LIU et al. 2012). Geht<br />
man davon aus, dass Antiepileptika Substrate der MDT sind, würde eine erhöhte<br />
Expression dieser Transporter einen vermehrten Efflux antikonvulsiver Substanzen<br />
aus dem Gehirn bewirken. Folglich könnten keine therapeutisch wirksamen<br />
Konzentrationen im Gehirn erreicht werden (SIDDIQUI et al. 2003) und weitere, teils<br />
auch stärkere epileptische Anfälle wären die Folge. Diverse Untersuchungen konnten<br />
bereits nachweisen, dass Antiepileptika Pgp-Substrate sind (z.B. SCHINKEL et al.<br />
1996; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und 2009).<br />
Die Ursachen der erhöhten Pgp-Expression bei Epilepsien sind bis heute nicht<br />
eindeutig geklärt. Studien in Tiermodellen lassen aber den Schluss zu, dass die<br />
Hochregulierung von Pgp in Gliazellen, Neuronen und Endothelzellen der<br />
Gehirnkapillaren anfallsbedingt ist und dem Schutz der Neurone im Gehirn vor<br />
Glutamat dient (ZHU & LIU 2004; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a; BANKSTAHL et<br />
al. 2008a). Die Glutamat-Konzentration steigt nach epileptischen Anfällen im Gehirn<br />
an. Dadurch können toxische Konzentrationen erreicht werden (DURING &<br />
SPENCER 1993), die zur Neurodegeneration führen können. Die Pgp-Expression<br />
1
EINLEITUNG<br />
wird in gleichem Maß heraufreguliert, sodass Glutamat aus den Zellen transportiert<br />
wird und weitere Erregungen vermieden werden. Mit Hilfe von In-vivo- und In-vitro-<br />
Untersuchungen wurde gezeigt, dass Glutamat ein Pgp-Substrat ist (LIU & LIU<br />
2001).<br />
Aufgrund der möglichen Folgen nicht behandelter Epilepsien wie z.B. eine<br />
verkürzte Lebensdauer (SPERLING et al. 2004) ist die Klärung der Mechanismen der<br />
Pharmakoresistenz von großer Bedeutung. Deshalb sollte im Rahmen dieses<br />
Promotionsprojekts die Rolle von Pgp in der Pharmakoresistenz untersucht werden.<br />
Dazu wurden vergleichende In-vitro-Studien mit immortalisierten Zelllinien aus<br />
Hirnkapillarendothel des Menschen und der Ratte durchgeführt, in denen die<br />
Auswirkungen auf Funktionalität und Expression des Transporters Pgp nach der<br />
Behandlung mit verschiedenen Antiepileptika untersucht wurden. Darüber hinaus<br />
sollte der Transport von Antiepileptika durch Pgp in Hirnendothelzellen humanen<br />
Ursprungs sowie in Primärkulturen verschiedener Spezies untersucht werden.<br />
2
STAND DER FORSCHUNG<br />
2 STAND DER FORSCHUNG<br />
2.1 Epilepsie<br />
2.1.1 Definition und Bedeutung<br />
Der Begriff Epilepsie stammt vom altgriechischen Wort „epilepsis“ = der Anfall,<br />
der Überfall. Laut der Definition der Internationalen Liga gegen Epilepsie (ILAE) und<br />
des Internationalen Büros für Epilepsie (IBE) ist Epilepsie eine Störung des Gehirns,<br />
die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung epileptischer Anfälle sowie durch<br />
neurobiologische, kognitive, psychologische und soziale Konsequenzen dieses<br />
Zustands gekennzeichnet ist (FISHER et al. 2005). Epilepsien sind chronische<br />
Erkrankungen, von denen weltweit etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al.<br />
2006) betroffen sind. Diese stellen die zweithäufigste Gruppe neurologischer<br />
Erkrankungen dar und gehören zu den häufigsten Hirnerkrankungen bei Menschen,<br />
Hunden und Katzen (LÖSCHER 1994). Die Prävalenz beim Menschen liegt bei<br />
0,52 % in Europa, in Entwicklungsländern sogar bei 1,5 % (STRZELCZYK et al.<br />
2008). Laut SANDER (2003) und KWAN et al. (2011) erkranken bis zu 51/100.000<br />
Personen jährlich neu an Epilepsie. Etwa 10 % der Bevölkerung erleiden einmal in<br />
ihrem Leben einen epileptischen Anfall, wobei ein Drittel dieser Menschen<br />
chronische Epilepsien entwickelt (ENGEL 2011).<br />
Die Epilepsiepatienten leiden an Krampfanfällen, die in verschiedene<br />
Schweregrade eingeteilt und einige Sekunden bis zu mehreren Minuten andauern<br />
können. Die Symptome können vielseitig sein, von Konvulsionen und dem Verlust<br />
des Bewusstseins bis hin zu solchen, die nicht immer bemerkt werden, wie z.B.<br />
Erstarren, unwillkürliches Lippenlecken, Kaubewegungen oder Zuckungen der Arme<br />
und Beine. Auslöser für die unwillkürlich auftretenden, epileptischen Anfälle sind<br />
hypersynchronisierte Entladungen ganzer Neuronengruppen, welche durch<br />
Funktionsstörungen des Nervensystems hervorgerufen werden.<br />
Konkrete Ursachen derartiger Funktionsstörungen sind nur in wenigen Fällen<br />
auszumachen. Die Einteilung erfolgt dazu in symptomatische, kryptogene und<br />
idiopathische Epilepsien. Bei den symptomatischen Epilepsien sind die Anfälle auf<br />
andere Erkrankungen wie z.B. Tumore, Infektionen oder Hirntraumata<br />
zurückzuführen. Als kryptogen werden Epilepsien bezeichnet, wenn kein exakter<br />
Grund für die Anfälle zu finden ist (LÖSCHER & BRANDT 2010). Auch bei<br />
3
STAND DER FORSCHUNG<br />
idiopathischen Epilepsien ist der auslösende Faktor unbekannt, es wird aber von<br />
einer erblich bedingten erhöhten Anfallsbereitschaft ausgegangen (ENGEL 2006;<br />
BERG et al. 2010). Bei etwa zwei Drittel der Patienten sind die auslösenden<br />
Faktoren unbekannt bzw. als Zusammenspiel mehrerer Einflüsse anzusehen. Wenn<br />
keine konkrete Diagnose gestellt werden kann, werden die Epilepsien nach ihrem<br />
Anfallstyp oder dem Syndrom eingeteilt. Bekannte Ursachen, die zur Erhöhung der<br />
Anfallsbereitschaft führen können, sind zum einen Erkrankungen des Gehirns selbst,<br />
wie zum Beispiel Hirntumoren, Entzündungen, Blutungen und Traumata<br />
(THEODORE et al. 2008; STEFAN 2009). Zum anderen können Erkrankungen des<br />
Gesamtorganismus, die mit Funktionsstörungen des Gehirns einhergehen, zur<br />
Entwicklung von Epilepsien führen.<br />
Der Ursprung der Anfälle kann auf bestimmte Regionen eingegrenzt werden<br />
oder aber im gesamten Gehirn liegen. Auf Vorschlag der ILAE wird eine Einteilung<br />
nach dem Anfallsmuster der Epilepsien vorgenommen. Dabei werden fokale und<br />
generalisierte Anfälle unterschieden. Bei den letztgenannten ist das gesamte Gehirn<br />
betroffen, ein genauer Ursprung ist nicht auszumachen. Bei fokalen Anfällen nimmt<br />
nur ein Teil des Gehirns (epileptischer Fokus) am Anfallsgeschehen teil. Diese<br />
Anfälle können auf ihre umschriebene Region beschränkt bleiben aber auch<br />
sekundär generalisieren und auf das ganze Gehirn übergreifen. Weitere<br />
Unterteilungen können wie schon erwähnt nach Ursachen, zudem nach Alter bei<br />
Krankheitsbeginn, auslösenden Faktoren und elektroenzephalographischen<br />
Befunden vorgenommen werden.<br />
Bei epileptischen Anfällen kommt es zu einer überschießenden Erregung von<br />
Nervenzellen. Im gesunden Organismus werden die Entstehung und die<br />
Weiterleitung der Aktionspotentiale an einem Neuron durch inhibitorisch wirkende<br />
Transmitter unterbrochen. Die γ-Aminobuttersäure (GABA) ist hierbei der wichtigste<br />
Vertreter. Ein weiterer Neurotransmitter, dem eine große Bedeutung im zentralen<br />
Nervensystem (ZNS) zukommt, ist das Glutamat. Während GABA eine hemmende<br />
Wirkung auf die Weiterleitung von Aktionspotentialen hat, zeigt Glutamat den<br />
umgekehrten Effekt. Es wirkt erregend. Beide Transmitter befinden sich in einem<br />
Gleichgewicht. Verschiebungen in diesem Gleichgewicht können Anfälle auslösen<br />
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005a). Kommt es beispielsweise zu einer Blockade der<br />
GABA-Synthese oder GABA-Rezeptoren, können Krampfanfälle die Folge sein. Ein<br />
weiterer Aspekt, der in Zusammenhang mit der Entstehung von Epilepsien<br />
4
STAND DER FORSCHUNG<br />
(Epileptogenese) diskutiert wird, ist die Veränderung der Eigenschaften<br />
spannungsabhängiger Kanäle (KÖHLING 2008). Zusätzlich gewinnen weitere<br />
Hypothesen zur Epileptogenese wie eine exzitatorische GABAerge Aktivität mit proepileptischer<br />
Wirkung, pH-Verschiebungen (ARAM & LODGE 1987; JABS et al.<br />
2008) sowie Defekte der BHS an Bedeutung.<br />
Epilepsien sind komplexe Erkrankungen, die oftmals mit pathologischen<br />
Verhaltens- und Befindensstörungen, wie beispielsweise Bewusstseinsverlust,<br />
Einschränkungen der Sinneswahrnehmung und Bewegung (durch Verkrampfungen<br />
der Muskulatur) und Störungen mentaler Funktionen einhergehen (GARCÍA-<br />
MORALES et al. 2008). Zudem wurde aufgezeigt, dass eine Verkürzung der<br />
Lebensdauer, auch körperliche Schmerzen, neuropsychologische und psychiatrische<br />
Beeinträchtigungen sowie soziale Defizite (DEVINSKY 2003; SPERLING 2004;<br />
KANNER et al. 2012) als mögliche Folgen unbehandelbarer Epilepsien auftreten<br />
können.<br />
Epilepsien sind kostenintensive Erkrankungen. Kosten, die für Diagnostik,<br />
Therapie und Medikamente, Rehabilitation, Fehlzeiten am Arbeitsplatz,<br />
Arbeitslosigkeit und frühzeitige Berentung anfallen, werden in Deutschland jährlich<br />
auf 7738 € pro Patient geschätzt (STRZELCZYK et al. 2012). Allein die Kosten für<br />
Antiepileptika lagen 2009 bei 1 % der Gesamtkosten für Medikamente in<br />
Deutschland (HAMER et al. 2012). Ein großer Teil der Kosten wird durch den hohen<br />
Anteil pharmakoresistenter Epilepsiepatienten verursacht, weshalb die Aufklärung<br />
der Mechanismen der Pharmakoresistenz und die Entwicklung neuer und besserer<br />
Therapiestrategien von großer Bedeutung ist.<br />
2.1.2 Temporallappenepilepsie<br />
Etwa 25 % der Epilepsiepatienten sind von der Temporallappenepilepsie<br />
(TLE) betroffen. Hierbei gehen die Anfälle vom Schläfenlappen, auch<br />
Temporallappen, des Gehirns aus. TLE kann in jedem Lebensalter auftreten und<br />
stellt aber die häufigste Form der Epilepsien bei Kindern und Jugendlichen dar<br />
(ENGEL 2001). Nahezu alle Betroffenen zeigen fokale Anfälle, die oft mit<br />
Bewusstseinsstörungen einhergehen. Daneben treten auch Anfälle ohne Störungen<br />
des Bewusstseins und sekundär generalisierte tonisch-klonische Anfälle auf. Bei<br />
etwa der Hälfte der Patienten lässt sich eine Ursache nicht nachweisen, seltener<br />
besteht eine familiäre Häufigkeit. Innerhalb des Schläfenlappen gehen die meisten<br />
5
STAND DER FORSCHUNG<br />
Anfälle von mesialen Abschnitten wie z.B. dem Hippocampus aus (BERTRAM 2009).<br />
Hierbei ist das Zusammenspiel des Schläfenlappens mit der Amygdala und dem<br />
Hippocampus wichtig. Diese Teile des Gehirns spielen für Emotionen und die<br />
Ausbildung des Gedächtnisses eine große Rolle (MCDONALD & WHITE 1993),<br />
weshalb es bei TLE-Patienten zu Störungen der Gedächtnisleistung und der Psyche<br />
kommen kann.<br />
Die TLE ist im überwiegenden Maß nur schwer zu behandeln, da die Hälfte<br />
der Betroffenen trotz Therapie nicht anfallsfrei wird. Das Phänomen der<br />
Pharmakoresistenz tritt sehr gehäuft auf, 30-45 % der Patienten reagieren nicht auf<br />
die verabreichten Medikamente (TAVAKOLI et al. 2011). Einzelne Studien gehen von<br />
bis zu 75 % pharmakoresistenten Epilepsiepatienten aus (SPENCER 2002;<br />
SCHMIDT & LÖSCHER 2005).<br />
2.1.3 Therapie<br />
Die Therapie erfolgt ausschließlich symptomatisch, wobei die meist dauerhafte<br />
Gabe von Antiepileptika Mittel der Wahl ist. Diese Medikamente können ihre Wirkung<br />
nur entfalten, wenn sie die BHS passieren. Es handelt sich dabei um relativ kleine (<<br />
500 Da) und lipophile Moleküle, sodass die BHS gut überwunden werden kann. Die<br />
Wirkungsweise erfolgt dabei im Wesentlichen über eine verstärkte synaptische<br />
Inhibition oder aber über die Modulation spannungsabhängiger Ionenkanäle<br />
(ROGAWSKI & LÖSCHER 2004). Das Ziel der Behandlung ist die völlige<br />
Anfallsfreiheit, dabei sollen möglichst wenige oder keine Nebenwirkungen auftreten.<br />
Die dauerhafte Therapie beginnt i.d.R. mit einem einzelnen Antiepileptikum<br />
(Monotherapie), wie zum Beispiel mit Phenytoin, Phenobarbital, Topiramat und<br />
Levetiracetam. Bei einigen Patienten können aber weiterhin Anfälle auftreten.<br />
Deshalb werden häufig weitere Therapeutika eingesetzt, die den jeweiligen<br />
Wirkmechanismus ergänzen und zur Anfallsfreiheit führen sollen. Dabei ist zu<br />
beachten, dass einige Antiepileptika wie z.B. Carbamazepin, Phenobarbital und<br />
Phenytoin potentielle Induktoren des Cytochrom-P 450 -Systems sind. Sie werden<br />
deshalb schneller abgebaut und können nicht ihre volle Wirkung entfalten. Andere<br />
Antiepileptika hingegen können Enzyme, die an der Glucuronidierung beteiligt sind,<br />
hemmen (Valproat). Neuere Antiepileptika wie Topiramat und Levetiracetam zeigen<br />
keine oder nur sehr wenige solcher Wechselwirkungen (SCHMIDT & LÖSCHER<br />
2009).<br />
6
STAND DER FORSCHUNG<br />
Dank der Forschung auf den Gebieten der Genetik, der Transkriptomanalysen<br />
und der Epigenetik konnten viele weitere Angriffspunkte für Antiepileptika gefunden<br />
und bestehende Risiken und Nebenwirkungen minimiert werden (SIMONATO et al.<br />
2012). Dennoch sind auch Medikamente der neuen Generation nicht in der Lage,<br />
therapieresistente Epilepsien zu behandeln oder gar Anfällen vorzubeugen<br />
(LÖSCHER & SCHMIDT 2011).<br />
Trotz intensiver Forschungen und Entwicklungen neuer Antiepileptika bleibt<br />
ein generelles Problem bestehen: der Durchtritt durch die BHS. Trotz des lipophilen<br />
Charakters der Antiepileptika kann der Eintritt ins Gehirn durch MDT wie Pgp oder<br />
Multidrug Resistance-Associated Proteins (MRPs) beschränkt sein. Dies ist von<br />
besonderer Bedeutung, da viele Antiepileptika Substrate für Pgp oder MRPs der<br />
BHS sind (SCHINKEL et al. 1996; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und 2009). Allerdings<br />
ist bisher nicht für alle Antiepileptika bekannt, ob und durch welche Transporter sie<br />
transportiert werden. LUNA-TORTÓS et al. konnten zwar 2008 in In-vitro-Versuchen<br />
für die Antiepileptika Phenytoin, Phenobarbital, Lamotrigin und Levetiracetam einen<br />
Transport durch humanes Pgp nachweisen. Ebenso konnte in In-vivo-<br />
Untersuchungen mit Ratten für Phenytoin nachgewiesen werden, dass es durch Pgp<br />
transportiert wird (POTSCHKA & LÖSCHER 2001), dennoch gibt es bislang keinen<br />
Nachweis über den Transport beim Menschen in vivo.<br />
Liposome oder die Kopplung an Nanopartikel stellen Möglichkeiten dar, den<br />
Efflux durch die Transporter zu umgehen ohne sie zu hemmen und so die BHS zu<br />
überqueren (HUWYLER et al. 2002; FRICKER & MILLER 2004). Erste<br />
Untersuchungen zeigten Erfolge in der Anreicherung von Nanopartikeln und<br />
Liposomen im ZNS, die die BHS durch (rezeptorvermittelte) Endozytose passieren<br />
(BRIGGER et al. 2002; FRICKER & MILLER 2004; VERGONI et al. 2009; VAN<br />
DORPE 2012). Allerdings ist dieses Gebiet für klinische Studien noch nicht<br />
ausreichend erforscht (SILVA 2006; ALAM 2010).<br />
Neueste Forschungen untersuchen die lokale Gabe von Antiepileptika in den<br />
epileptischen Fokus im Gegensatz zur üblichen systemischen Applikation, die<br />
Auswirkungen auf andere physiologische Systeme als das epileptische Gehirn haben<br />
kann. Die Nebenwirkungen sind dabei nicht unerheblich. Praktikabilität und<br />
Verfahrensweise der lokalen Gabe sind noch nicht vollständig untersucht, aber<br />
mittels der lokalen Applikation der Antiepileptika könnte die Bioverfügbarkeit<br />
gesteigert und die Nebenwirkungen verringert werden (BOON et al. 2012).<br />
7
STAND DER FORSCHUNG<br />
Bei der Suche nach neuen Antiepileptika gewinnen sogenannte Biomarker<br />
immer mehr an Bedeutung. Biomarker werden als „objektiv messbare Charakteristika<br />
eines normalen oder pathologischen biologischen Prozesses oder einer biologischen<br />
Antwort auf eine therapeutische Invention“ definiert (Biomarkers Definitions Working<br />
Group 2001). Biomarker können eine Möglichkeit bieten, Krankheiten festzustellen<br />
oder deren Verlauf zu bestimmen (ENGEL 2011). Bei Epilepsien können Biomarker<br />
auf mögliche Ziele neuer Therapien hinweisen und bei der Erforschung neuer<br />
Antiepileptika abklären, ob und in welchem Ausmaß diese Einfluss auf relevante<br />
biologische und erkrankungsspezifische Prozesse haben (SIMONATO et al. 2012).<br />
Ebenso könnte es möglich sein, anhand von Untersuchungen der Expressionsprofile<br />
bestimmter Gene und ihrer Proteinprodukte Biomarker für die Epileptogenese zu<br />
entwickeln (PITKÄNEN & LUKASIUK 2011).<br />
Sofern ein Fokus bei einer pharmakoresistenten Epilepsie vorhanden ist, kann<br />
die chirurgische Entfernung dieses Fokus eine Alternative zur medikamentösen<br />
Therapie darstellen (FOLDVARY et al. 2001). Dabei wird auf die Erhaltung wichtigen<br />
funktionellen Gewebes geachtet. Derzeit gibt es Untersuchungen zur sogenannten<br />
Radiochirurgie, mit der noch gezielter selektiv epileptisches Gewebe entfernt werden<br />
kann (BOON et al. 2012). Weitere chirurgische Möglichkeiten stellen die Stimulation<br />
des Nervus vagus oder die Tiefenhirnstimulation dar (HOLMES et al. 2004; BOON et<br />
al. 2007a; ZHONG et al. 2011; VONCK et al. 2012). Der genaue Hintergrund der<br />
Stimulation des Nervus vagus, dessen afferente Fasern auch zum Herz-Kreislauf-<br />
Zentrum laufen, ist noch nicht endgültig geklärt. Die Tiefenhirnstimulation ist seit<br />
2012 als therapeutische Maßnahme zugelassen, allerdings ist die Zahl der Patienten,<br />
die auf diese Therapie reagieren, gering. Eine vollständige Heilung wird bislang<br />
weder durch die Resektion noch durch die Stimulation erzielt, da viele Patienten<br />
anschließend weiter mit Antiepileptika behandelt werden müssen (LÖSCHER &<br />
SCHMIDT 2006a; BOON et al. 2007b; ZHONG et al. 2011; VONCK et al. 2012; WU<br />
& SHARAN 2012).<br />
8
STAND DER FORSCHUNG<br />
2.2 Pharmakoresistenz<br />
2.2.1 Definition und Bedeutung<br />
Etwa 30-40 % der Epilepsiepatienten reagieren nicht oder nur unzureichend<br />
auf die medikamentöse Behandlung und werden als pharmakoresistent eingestuft<br />
(KWAN et al. 2011). Eine einheitliche allgemein anerkannte Definition des Begriffs<br />
existierte lange nicht. Pharmakoresistenz wurde üblicherweise als ausbleibende<br />
Anfallsfreiheit oder weniger als 50 %ige Anfallsreduktion trotz angemessener<br />
Auswahl und einer ausreichend langen Applikation von mindestens zwei<br />
Antiepileptika mit verschiedenen Wirkmechanismen in maximal tolerierbaren Dosen<br />
beschrieben (REGESTA & TANGANELLI 1999; KWAN & BRODIE 2000; KWAN &<br />
BRODIE 2010).<br />
Die Zahl der pharmakoresistenten Epilepsiepatienten schwankt in den<br />
einzelnen Untersuchungen, weil der Begriff Pharmakoresistenz lange nicht einheitlich<br />
definiert wurde und in den Studien abweichende Kriterien für die Definition der<br />
Pharmakoresistenz berücksichtigt wurden (SCHMIDT & LÖSCHER 2005; PATI &<br />
ALEXOPOULOS 2010). Aus diesem Grund gründete die ILAE eine Projektgruppe,<br />
um eine einheitliche international gültige Definition der Pharmakoresistenz zu<br />
schaffen. Diese definierte den Begriff wie folgt: „adäquate Behandlungsversuche mit<br />
zwei tolerierten und angemessen ausgewählten sowie angewandten Antiepileptika-<br />
Behandlungsprotokollen, in Monotherapie oder in Kombination, führen zu keiner<br />
anhaltenden Anfallsfreiheit“ (KWAN et al. 2010). Die Lebensqualität<br />
pharmakoresistenter Epilepsiepatienten ist aufgrund der weiterhin auftretenden<br />
Anfälle besonders durch mögliche Verletzungen bis hin zu einem frühzeitigen Tod<br />
und psychosoziale Störungen eingeschränkt (KWAN et al. 2011).<br />
Pharmakoresistenz kann auch durch eine Toleranz gegenüber bestimmten<br />
Therapeutika verursacht werden (LÖSCHER & SCHMIDT 2006b), wobei Toleranz<br />
als Adaptation des Körpers und der daraus folgenden verringerten Wirksamkeit eines<br />
Medikaments nach mehrmaliger Gabe beschrieben wird (KOELLA 1986). Eine<br />
bestehende Toleranz kann i.d.R. umgangen werden, wenn Medikamente mit einem<br />
anderen Wirkungsmechanismus verabreicht werden.<br />
Für die Erklärung der Pharmakoresistenz existieren viele Hypothesen (REMY<br />
& BECK 2006), denen verschiedene Mechanismen zugrunde gelegt werden. Aus<br />
9
STAND DER FORSCHUNG<br />
diesem Grund beschrieb SISODIYA (2003) ähnlich der Koch`schen Postulate, die die<br />
Bedeutung von Bakterien bei Infektionserkrankungen beschrieben (KOCH 1884;<br />
FALKOW 1988), vier Kriterien, welche für die Akzeptanz einer Hypothese als<br />
Ursache für Pharmakoresistenz bei Epilepsien erfüllt sein müssen. Der Mechanismus<br />
muss<br />
1) in epilepsie-assoziiertem Gewebe nachweisbar sein,<br />
2) zur Pharmakoresistenz führen,<br />
3) an der Resistenz gegenüber Medikamenten involviert sein und<br />
4) bei der Inhibition zur Überwindung der Pharmakoresistenz führen.<br />
Diese Kriterien lassen sich in einem gewissen Maß auch auf andere<br />
Hirnerkrankungen wie z.B. Tumoren, die mit Pharmakoresistenz assoziiert werden,<br />
anwenden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).<br />
Einzelne Hintergründe der Pharmakoresistenz sind nur unzureichend erforscht<br />
und werden kontrovers diskutiert. Allerdings besteht die Annahme, dass nicht nur ein<br />
einzelner Mechanismus verantwortlich ist, sondern dass Pharmakoresistenz bei<br />
Epilepsiepatienten als Zusammenspiel mehrerer Faktoren zu erklären ist (REGESTA<br />
& TANGANELLI 1999; KWAN & BRODIE 2000; SCHMIDT & LÖSCHER 2009).<br />
2.2.2 Target-Hypothese<br />
Die Target-Hypothese nimmt an, dass genetisch bedingte oder erworbene<br />
Veränderungen der Zielstrukturen der Antiepileptika zu unzureichenden<br />
pharmakodynamischen Effekten führen (SCHMIDT & LÖSCHER 2005; LÖSCHER &<br />
POTSCHKA 2005b; REMY & BECK 2006). Studien an Tiermodellen und an<br />
Hirngeweben pharmakoresistenter Epilepsiepatienten brachten erste Hinweise.<br />
Antiepileptika haben verschiedene Zielstrukturen, über die die Wirkung<br />
vermittelt wird (ROGAWSKI & LÖSCHER 2004). GABA A -Rezeptoren stellen einen<br />
Angriffspunkt für Antiepileptika wie Phenobarbital dar (ROGAWSKI & LÖSCHER<br />
2004). GABA als ein inhibitorischer Neurotransmitter aktiviert diese Rezeptoren und<br />
führt zu einem Einstrom von Chlorid-Ionen. Dadurch wird eine Hyperpolarisation<br />
ausgelöst, die in einer verminderten Erregbarkeit mündet. Ein Status epilepticus kann<br />
zu Veränderungen der Untereinheiten des GABA A -Rezeptors führen (GOODKIN et<br />
al. 2008). In einem Tiermodell der TLE zeigten BETHMANN et al. (2008), dass<br />
sowohl strukturelle als auch funktionelle Veränderungen dieses Rezeptors mit<br />
10
STAND DER FORSCHUNG<br />
Pharmakoresistenz in Zusammenhang stehen. Hierbei kam es nur zu ungenügenden<br />
Effekten von Phenobarbital.<br />
Spannungsabhängige Natrium-Kanäle, die maßgeblich an der Entstehung des<br />
Aktionspotentials beteiligt sind, stellen ein weiteres Ziel der Antiepileptika dar. Dabei<br />
sind v.a. Carbamazepin, Lamotrigin und Phenytoin zu nennen (ROGAWSKI &<br />
LÖSCHER 2004), die auf diese Ionenkanäle einwirken. Bezüglich der Toleranz bzw.<br />
Pharmakoresistenz wurde eine geringere Sensitivität der Na + -Kanäle für<br />
Carbamazepin in resezierten Geweben epileptischer Patienten gezeigt (REMY et al.<br />
2003; JANDOVA et al. 2006).<br />
2.2.3 Genvarianz-Hypothese<br />
Genetische Polymorphismen werden nicht nur mit Resistenzen und<br />
Therapieversagen bei Antikonvulsiva, Zytostatika und Antibiotika assoziiert<br />
(SCHWAB et al. 2003a; SIDDIQUI et al. 2003). Zusammen mit Wechselwirkungen<br />
von Medikamenten und Überexpression der MDT gelten sie als Hauptgrund für<br />
Therapieversagen, individuelle Variabilität und Ausmaß und Häufigkeit der<br />
Nebenwirkungen (HO & KIM 2005; KERB 2006).<br />
Die Genvarianz-Hypothese untersucht den Zusammenhang zwischen<br />
genetischen Polymorphismen, beispielsweise des Efflux-Transporters Pgp, und der<br />
verminderten Wirksamkeit der Antiepileptika. Solche Veränderungen könnten<br />
ursächlich dafür sein, dass zwei Patienten bei gleicher Epilepsieerkrankung<br />
unterschiedlich auf die gleiche Therapie reagieren (SIDDIQUI et al. 2003; LÖSCHER<br />
& POTSCHKA 2005b; HUNG et al. 2008). Allerdings werden Polymorphismen im<br />
ABCB1-Gen für Pgp im Zusammenhang mit Pharmakoresistenz bei<br />
Epilepsiepatienten kontrovers diskutiert (BOURNISSEN et al. 2009).<br />
2.2.4 Netzwerk-Hypothese<br />
Zusätzlich zu den bereits genannten Erklärungen zur Pharmakoresistenz wird<br />
die Netzwerk-Hypothese diskutiert. Diese geht von unterschiedlichen strukturellen<br />
und funktionellen Netzwerken bei pharmakosensitiven und –resistenten Patienten<br />
aus, die durch Krankheit oder eine veränderte Genetik bedingt sind (LÖSCHER &<br />
POTSCHKA 2005b; SCHMIDT & LÖSCHER 2009). Beispielsweise zeigten mehrere<br />
Untersuchungen in einem Epilepsiemodell der Ratte, dass Veränderungen des<br />
11
STAND DER FORSCHUNG<br />
Netzwerks in den Basalganglien auftreten (FEDROWITZ et al. 2002; GERNERT et<br />
al. 2004; NOLTE et al. 2006).<br />
2.2.5 Multidrug-Transporter-Hypothese<br />
Diese Hypothese geht von einer Überexpression sogenannter MDT in der<br />
BHS aus und stellt die bisher am besten untersuchte Hypothese der<br />
Pharmakoresistenz dar (SCHMIDT & LÖSCHER 2009). MDT wie Pgp oder MRPs<br />
sorgen für den Abtransport von Substanzen aus dem Gehirn zurück ins Blut. Dieser<br />
Effekt ist bei potentiell gefährlichen Stoffen durchaus erwünscht, doch kann er bei<br />
Überexpression dieser Proteine zu einem erhöhten Efflux der Medikamente führen<br />
und folglich zu einer verringerten Konzentration und Wirkung im Zielgewebe<br />
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).<br />
Erste Hinweise auf den Zusammenhang zwischen Pharmakoresistenz und der<br />
Überexpression des MDT Pgp lieferten Arbeiten von TISHLER et al. (1995) an<br />
Hirngeweben pharmakoresistenter Epilepsiepatienten. Eine erhöhte Expression<br />
dieses Efflux-Transporters wurde durch andere Forschergruppen bestätigt<br />
(DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al. 2003). Zusätzlich wurde in<br />
Kapillarendothelien und Astrozyten eine Überexpression der Transporter MRP1 und<br />
MRP2 nachgewiesen (LAZAROWSKI et al. 2007). VOLK & LÖSCHER (2005)<br />
zeigten zudem auch in tierexperimentellen Untersuchungen, dass Ratten, die<br />
gegenüber Antiepileptika resistent waren, eine Überexpression von Pgp aufwiesen.<br />
Abbildung 2.1 stellt die Überexpression von MDT in epileptischem<br />
Gehirngewebe dar. Epileptische Anfälle scheinen derartige Überexpressionen zu<br />
verursachen. Studien mit verschiedenen Tiermodellen der TLE zeigten eine Pgp-<br />
Überexpression in Hirnkapillarendothelzellen, Astrozyten und Neuronen (SISODIYA<br />
2003; VOLK et al. 2004a; VOLK et al. 2005; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a). Diese<br />
Untersuchungen unterstützen die Annahme, dass hohe Anfallsfrequenzen zu<br />
Therapiebeginn mit dem Auftreten pharmakoresistenter Epilepsien korrelieren<br />
(REGESTA & TANGANELLI 1999).<br />
12
STAND DER FORSCHUNG<br />
Abbildung 2.1: Physiologische Expression von MDT an der BHS (A) und Überexpression von<br />
MDT in epileptischem Hirngewebe (B), nach LÖSCHER & POTSCHKA (2005a). Physiologisch<br />
werden MDT fast ausschließlich an der luminalen Seite der Gehirnkapillarendothelien<br />
exprimiert. Moleküle und Substanzen gelangen durch Diffusion vom Blut ins Gehirn. Im<br />
epileptischen Fokus werden die MDT in der luminalen Membran der Gehirnkapillarendothelien<br />
hochreguliert. Zudem werden sie in Gliazellen und Neuronen exprimiert. Aufgrund der<br />
Hochregulation gelangen Wirkstoffe nicht in ausreichendem Maß in das Gehirngewebe.<br />
Die Kriterien, die laut SISODIYA (2003) für die Bestätigung einer Hypothese<br />
zur Pharmakoresistenz erfüllt sein müssen, werden von der MDT-Hypothese<br />
bezüglich Pgp in Nagermodellen für Epilepsien erfüllt (SCHMIDT & LÖSCHER<br />
2009).<br />
1) Die Pgp-Expression ist aufgrund der Anfälle in Endothelzellen der<br />
Gehirnkapillaren, Astrozyten und Neurone erhöht (RIZZI et al. 2002; SEEGERS et al.<br />
2002; VOLK et al. 2004a; VOLK et al. 2005; BANKSTAHL & LÖSCHER 2008).<br />
2) Der Vergleich pharmokosensitiver und –resistenter Ratten zeigte eine<br />
erhöhte Pgp-Expression in den pharmakoresistenten Tieren (VOLK & LÖSCHER<br />
2005).<br />
3) Diese erhöhte Pgp-Expression steht in Zusammenhang mit einer<br />
niedrigeren Konzentration der Antiepileptika im Gehirn pharmakoresistenter Tiere<br />
(RIZZI et al. 2002; VAN VLIET et al. 2007).<br />
13
STAND DER FORSCHUNG<br />
4) Die Gabe des selektiven Pgp-Inhibitors Tariquidar führte zur Überwindung<br />
der Resistenz gegenüber der Antiepileptika Phenobarbital und Phenytoin (BRANDT<br />
et al. 2006; VAN VLIET et al. 2006).<br />
Nach diesen Studien könnte Pgp eine große Rolle für pharmakoresistente<br />
Epilepsien in Tiermodellen spielen. Allerdings ist das Ausmaß, mit dem sich diese<br />
Kriterien auf humane Epilepsiepatienten übertragen lassen, noch unklar (LÖSCHER<br />
& SILLS 2007). In humanen Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie wurde<br />
bereits eine Überexpression von Pgp in reseziertem epileptischem Gewebe<br />
nachgewiesen (TISHLER et al. 1995; DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al.<br />
2004; MARCHI et al. 2004). Dabei ist nicht bekannt, ob diese Überexpression ein<br />
Epiphänomen ist, welches durch epileptische Anfälle verursacht wird, oder ob ein<br />
kausaler Zusammenhang mit der Antiepileptika-Resistenz besteht (LÖSCHER et al.<br />
2011).<br />
Es ist nicht sicher, ob mit der Administration spezifischer MDT-Inhibitoren die<br />
Pharmakoresistenz beim Menschen umgangen werden kann. Zudem gibt es zurzeit<br />
noch keine genauen Hinweise, ob bzw. welche weiteren Antiepileptika Substrate der<br />
MDT in der BHS darstellen und demzufolge zurück ins Blut transportiert werden<br />
(LÖSCHER et al. 2011).<br />
2.3 Bluthirnschranke<br />
2.3.1 Aufbau und Funktion der Barriere<br />
Die Entdeckung der BHS geht auf Untersuchungen von Paul Ehrlich zurück.<br />
Ehrlich stellte fest, dass ins Blut injizierte Farbstoffe sich nicht im Gehirn anreicherten<br />
(EHRLICH 1885). Weitere Versuche ergaben, dass Farbstoffe, die direkt ins ZNS<br />
appliziert wurden, auch nur dort verblieben und sich nicht im restlichen Körper<br />
ausbreiteten (GOLDMANN 1913).<br />
Die BHS bildet eine physiologische Barriere zwischen dem Blutkreislauf und<br />
dem ZNS. Sie ist eine selektiv durchlässige Schranke, durch die ein kontrollierter<br />
Stoffaustausch stattfinden kann. Mittels Diffusion und Transportprozessen wird über<br />
diese Barriere die Nährstoffversorgung des Gehirns sichergestellt. Gleichzeitig wird<br />
durch diesen hochselektiven Filter das innere Milieu des Hirns aufrechterhalten und<br />
vor potentiell gefährlichen Substanzen geschützt. Die BHS trägt damit zur normalen<br />
Funktion des ZNS bei (BALLABH et al. 2004).<br />
14
STAND DER FORSCHUNG<br />
Diese Schranke besteht aus Endothelzellen, die die Hirnkapillaren auskleiden<br />
und deren Interzellularräume im Gegensatz zu anderen Stellen im Organismus durch<br />
sogenannte Tight junctions eng miteinander verknüpft sind (KANDEL et al. 2000;<br />
LÖSCHER & POTSCHKA 2002; ABBOTT et al. 2010). Die Barriere resultiert aus den<br />
Eigenschaften der Endothelzellen, den interzellulären Verknüpfungen und fast<br />
vollständig fehlenden Transport durch Vesikel (KANDEL et al. 2000). Abbildung 2.2<br />
zeigt, dass die Endothelzellen der BHS zusätzlich von einer perivaskulären<br />
Gliazellschicht, Astrozyten-Endfüßen, Perizyten und einer Basalmembran umgeben<br />
sind, die zur Undurchlässigkeit von Bakterien sowie großer und hydrophiler Stoffe<br />
beitragen.<br />
Abbildung 2.2: Vergleich einer Kapillare (A) mit einer Hirnkapillare (B), nach DEEKEN &<br />
LÖSCHER 2007. Aufgrund einer weniger dichten Anordnung der Zellen in peripheren<br />
Kapillaren ist ein leichterer Durchtritt für Substanzen möglich. An der BHS tragen zusätzlich<br />
Tight junctions zwischen den Endothelzellen, die Basalmembran, sowie Astrozyten und<br />
Perizyten zur Dichtigkeit dieser Barriere bei. Aus diesem Grund können sowohl Fremdstoffe<br />
als auch Medikamente nicht ohne Weiteres ins Gehirn gelangen.<br />
Die Astrozyten stehen in engem Kontakt mit den Kapillarendothelzellen der<br />
BHS. Astrozyten-Endfüße liegen eng von der Gewebeseite bis an die Hirnkapillaren<br />
an. Astrozyten sind durch die Sekretion bestimmter Faktoren an der Ausbildung der<br />
spezifischen Eigenschaften der BHS beteiligt. Beispielsweise scheinen diese<br />
Gliazellen Einfluss auf die Ausbildung von Tight junctions (DEHOUCK et al. 1990;<br />
15
STAND DER FORSCHUNG<br />
WOLBURG et al. 1994; CECCHELLI et al. 1999) und die Expression von MDT zu<br />
haben (GAILLARD et al. 2000; HAWKINS et al. 2002; WILLIS et al. 2007).<br />
Perizyten lagern sich nur teilweise um die Endothelzellen in der BHS, teilen<br />
sich aber die gleiche Basalmembran mit den Endothelzellen. Sie tragen zur Struktur<br />
der BHS bei und sind in der Lage, den Durchmesser der Blutgefäße als Reaktion auf<br />
verschiedene Stimuli anzupassen (THOMAS 1999; HASELOFF et al. 2005;<br />
PEPPIATT et al. 2006). Zudem scheinen auch sie an der Ausbildung der Tight<br />
junctions beteiligt zu sein (DOHGU et al. 2005).<br />
Die Tight junctions zwischen den Endothelzellen unterdrücken die<br />
parazelluläre Diffusion nahezu vollständig, was in einem Widerstand<br />
(transendothelial resistance) der Gefäßwand resultiert, der bei etwa 5-10 Ω*cm 2 liegt.<br />
Tight junctions sind zwischen allen Endothelzellen zu finden, aber nur an den<br />
Kapillargefäßen der BHS in vivo führt dies zu einem hohen Widerstand von bis zu<br />
2000 Ω*cm 2 (LATERRA & GOLDSTEIN 2000). In vitro liegen die Widerstände<br />
humaner Hirnkapillarendothelien je nach Präparation zwischen 20 und 1400 Ω*cm 2<br />
(GRANT et al. 1998).<br />
Es bleibt also festzuhalten, dass diese Barriere aus der Selektivität durch:<br />
1) Tight junctions zwischen den Endothelzellen der Gehirnkapillaren,<br />
2) Transporterproteine für den kontrollierten transzellulären Eintritt der<br />
Moleküle ins Gehirn und<br />
3) Enzyme, die Substanzen vor ihrem Durchtritt verändern oder<br />
degradieren (PETERSON 2012), resultiert.<br />
Ob auch Neurone eine Rolle bei der Modulation der BHS spielen, ist unklar<br />
und wird noch diskutiert (ROUX & COURAUD, 2005; LIM et al. 2007). LIM et al.<br />
(2007) fanden aber heraus, dass neuronale Vorläuferzellen die Pgp-Expression in<br />
vitro beeinflussen können.<br />
2.3.2 Selektivität und Substanztransport über die Bluthirnschranke<br />
Es existieren zwei grundsätzliche Wege, über die Substanzen die Barriere<br />
überwinden und ins Gehirn gelangen können (ABBOTT et al. 2006), erstens direkt<br />
durch die Zellen (transzellulär) oder zweitens zwischen den Zellen hindurch<br />
(parazellulär). Der parazelluläre Weg kommt v.a. für wasserlösliche Stoffe in<br />
Betracht. Da aber die anatomischen Gegebenheiten wie Tight junctions den<br />
parazellulären Weg weitestgehend versperren, spielt dieser für die BHS kaum eine<br />
16
STAND DER FORSCHUNG<br />
Rolle. Aus diesem Grund müssen viele Stoffe, die für die Funktion notwendig sind,<br />
aktiv ins Gehirn transportiert werden. Zum Beispiel gelangen hydrophile Substanzen,<br />
die nicht von Trägermolekülen transportiert werden, über rezeptorvermittelte<br />
Transzytose (z.B. Insulin) ins Gehirn (Abbott et al. 2006). Weitere Wege stellen der<br />
konzentrationsabhängige Transport, z.B. für Glukose mittels GLUT1 (TSUJI & TAMAI<br />
1999), und der Transport über spezifische Proteine dar. Dieser aktive Transport steht<br />
allerdings v.a. körpereigenen Stoffen, Nährstoffen und Abbauprodukten zur<br />
Verfügung (KANDEL et al. 2000; ABBOTT et al. 2006). Körperfremde Stoffe<br />
(Xenobiotika) werden nur in geringem Maß auf diese Weise transportiert. Allerdings<br />
gelangen so auch Arzneimittel, die aufgrund ihres hydrophilen Charakters die BHS<br />
nicht passieren würden, wie z.B. einige Chemotherapeutika, Immunsuppressiva (z.B.<br />
Cyclosporin A) und L-DOPA ins Gehirn (TSUJI & TAMAI 1999).<br />
Demnach müssten lipophile Stoffe, zu denen auch toxische Substanzen<br />
gehören, relativ einfach ins Gehirn gelangen. Allerdings wird die Passage dieser<br />
Stoffe durch spezifische Efflux-Transporter eingeschränkt. Aufgrund der Polarität der<br />
Hirnendothelzellen sind Transporter entweder an der luminalen Seite (dem Blut<br />
zugewandt) oder an der abluminalen Seite (dem Gehirn zugewandt) der Zellen<br />
exprimiert (Abbildung 2.3). Die Expression auf der luminalen Seite ermöglicht den<br />
Transportern, lipophile Substanzen zurück ins Blut zu befördern (PARDRIDGE<br />
2003).<br />
Es können also kleine (< 500 Da), lipidlösliche, ungeladene Stoffe (z. B.<br />
Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid, Hormone) die BHS gut passieren, vorzugsweise über<br />
transzelluläre Diffusion (PARDRIDGE 2003). Auf diese Weise erreichen die meisten<br />
zentralwirksamen Medikamente das Gehirn. Antiepileptika sind hoch permeable<br />
Substanzen, weshalb die Diffusion dieser Substanzen über die BHS eine wichtige<br />
Rolle spielt.<br />
2.4 Multidrug-Transporter<br />
Bei MDT handelt es sich um Membranproteine, die u.a. in Leber, Darm und<br />
Niere lokalisiert sind. Dort haben sie Einfluss auf die Kumulation und den Ausstrom<br />
von Substanzen. Des Weiteren werden diese Proteine in der BHS, in den Hoden und<br />
in der Plazentaschranke exprimiert, wo sie den Einstrom vieler Substanzen limitieren<br />
(SCHINKEL & JONKER 2003) und demzufolge eine Schutzfunktion einnehmen<br />
(SCHERRMANN 2005; GEDEON et al. 2006; ENOKIZONO et al. 2008).<br />
17
STAND DER FORSCHUNG<br />
MDT gehören zur Superfamilie der Adenosintriphosphat-(ATP) Binding<br />
Cassette- (ABC-) Transporter. Diese Superfamilie lässt sich in sieben Subfamilien<br />
einteilen, die mit den Buchstaben „A“ bis „G“ gekennzeichnet sind. Gemeinsames<br />
Charakteristikum dieser Proteinfamilie ist die stark konservierte ATP-Bindedomäne<br />
(HIGGINS 1995), die für die Bindung und Hydrolyse von ATP verantwortlich ist. ABC-<br />
Transporter bestehen aus zwei hydrophoben transmembranalen Domänen und zwei<br />
hydrophilen ATP-bindenden Domänen (DEAN et al. 2001; REES et al. 2009). Aus<br />
der Abspaltung einer Phosphatgruppe vom ATP-Molekül wird die Energie für<br />
Konformationsänderungen der Transmembrandomäne gewonnen. Aufgrund dessen<br />
können Stoffe aktiv auch entgegen eines Konzentrationsgefälles durch Membranen<br />
transportiert werden (HOLLENSTEIN et al. 2007).<br />
Abbildung 2.3: Expression und Lokalisation der MDT an der BHS, aus LÖSCHER & POTSCHKA<br />
2005a. Die meisten Transporter, darunter auch das bekannte Pgp, befinden sich an der<br />
blutzugewandten Seite der Endothelzellen. Auf diese Weise können Fremdstoffe schnell zurück<br />
ins Blut transportiert werden. Die Polarität und Verteilung der MDT an der BHS scheint<br />
unterschiedlich stark ausgeprägt zu sein. Des Weiteren existieren mehr Transporter an der<br />
BHS als hier dargestellt (MERTSCH & MAAS 2002), von denen aber die Rolle im<br />
Substanztransport unklar ist.<br />
Neben der physikalischen Barriere durch die Anordnung der Endothelzellen in<br />
der BHS bieten die Transportproteine die Möglichkeit, kleine lipophile und damit<br />
membrangängige Moleküle wieder aus dem Gehirn zu transportieren. Was bei<br />
schädlichen Substanzen durchaus sehr nützlich ist, kann bei Medikamenten zu<br />
18
STAND DER FORSCHUNG<br />
erniedrigten und damit nicht wirksamen Konzentrationen am Wirkungsort Gehirn<br />
führen.<br />
Viele MDT wie das Pgp gehören zur Familie der ABC-Transporter. Sie sind<br />
u.a. in der BHS zu finden. Dort weisen sie oft nur eine geringe Substratspezifität auf.<br />
Zudem zeigen die MDT ein weit überlappendes Substratspektrum (SHAPIRO & LING<br />
1995), wie z.B. bei Pgp und MRP2, was zur Annahme führt, dass beide Transporter<br />
koreguliert sind (FROMM et al. 2000; JEDLITSCHKY et al. 2006).<br />
2.4.1 P-Glykoprotein (Pgp)<br />
Bei diesem phosphorylierten Glykoprotein handelt es sich um ein gut<br />
untersuchtes Membranprotein, welches zur Subfamilie ABCB der ABC-Transporter<br />
gehört. Es wurde erstmalig in Hamster-Ovarialzellen, die gegenüber dem<br />
Zytostatikum Colchicin unempfindlich waren, entdeckt (JULIANO & LING 1976). Es<br />
ist das Produkt des ABCB1- oder MDR1-Gens (CHEN et al. 1986). Pgp besteht aus<br />
1280 Aminosäuren und weist in seiner glykosylierten und phosphorylierten Form ein<br />
Molekulargewicht von 170 kDa auf. Pgp ist in die Membran eingebettet, wobei sich<br />
die ATP-Bindedomäne außerhalb der Zellmembran befindet. Die Substanzbindung<br />
erfolgt gleichzeitig mit der Bindung und Hydrolyse von ATP. Durch die aus der<br />
Abspaltung einer Phosphatgruppe gewonnene Energie erfolgt eine<br />
Konformationsänderung des Transporterproteins, und das Substrat wird transportiert<br />
(NERVI et al. 2010). Pgp besteht aus zwei sich wiederholenden Tandems aus<br />
Transmembran- und hydrophoben N-terminalen Domänen (LOO & CLARKE 1995;<br />
KAST et al. 1996). LOO & CLARKE (1999) wiesen zudem nach, dass lediglich die<br />
Transmembrandomäne dieses Transporters für die Substratbindung verantwortlich<br />
ist, und die N-terminalen Domänen auch für den Transport zur Membran keine Rolle<br />
spielen.<br />
Pgp ist in Organen mit exkretorischer Funktion wie Leber, Darm und Niere zu<br />
finden (THIEBAUT et al. 1987; CORDON-CARDO et al. 1989; Abbildung 2.4).<br />
Zusätzlich ist es in der BHS exprimiert (SCHINKEL 1999). In allen Lokalisationen ist<br />
es an der Absorption, Verteilung und Exkretion von Substanzen beteiligt<br />
(MARZOLINI et al. 2004a). Die physiologische Pgp-Expression scheint deshalb<br />
einen wichtigen Schutzmechanismus gegen potentiell toxische Stoffe darzustellen<br />
(FROMM 2004). In der Barriere zwischen ZNS und Blut trägt es wesentlich zur<br />
Funktion der BHS bei (SCHINKEL 1999).<br />
19
STAND DER FORSCHUNG<br />
Abbildung 2.4: Schema der Pgp-Expression im menschlichen Körper, nach MARZOLINI et al.<br />
(2004a). Pgp kommt sowohl in exkretorischen Organen wie Leber, Darm und Nieren als auch in<br />
den wichtigen Barrieren zum Gehirn, Hoden und zur Plazenta vor.<br />
Mit der Expression an der luminalen Seite des Endothels, also der zum Blut<br />
zugewandten Seite, ist Pgp am Schutz des Gehirns vor körperfremden Stoffen<br />
beteiligt (SCHERRMANN 2005). Gleichzeitig kann auch eine Vielzahl an<br />
Medikamenten wieder ins Blut zurücktransportiert werden, sodass effektive<br />
therapeutische Konzentrationen nicht erreicht werden. Die Schutzfunktion dieses<br />
Effluxproteins konnte in Pgp-defizienten bzw. Pgp-Knockout-Mäusen nachgewiesen<br />
werden, die nach Verabreichung verschiedener Substanzen vermehrt neurotoxische<br />
und fetusschädigende Effekte zeigten (SCHINKEL et al. 1994 und 1995; LANKAS et<br />
al. 1998; SCHINKEL 1999; SMIT et al. 1999).<br />
Pgp ist in der Lage, viele unterschiedliche Substanzen zu transportieren.<br />
Beispielsweise zählen Chemotherapeutika, Lipide, Steroide, Peptide, Xenobiotika,<br />
Immunsuppressiva, Glukokortikoide, Humanes Immundefizienz Virus- (HIV-)<br />
Protease-Inhibitoren und Antiepileptika zu den Substraten dieses MDT (AMBUDKAR<br />
& GOTTESMAN 1998; DEAN et al. 2001; SCHINKEL & JONKER 2003; SAKAEDA<br />
et al. 2003; LUNA-TORTÓS et al. 2008). Mit diesem breiten Substratspektrum ist<br />
20
STAND DER FORSCHUNG<br />
Pgp an mehreren Prozessen beteiligt, wie z.B. die Regulation der Verteilung und<br />
Bioverfügbarkeit von Substanzen, Efflux von Metaboliten in Urin, Galle und Darm und<br />
Transport von Stoffen über die BHS (TANIGAWARA 2000). Pgp scheint zudem<br />
zusammen mit anderen MDT eine weitere physiologische Rolle zu spielen: Es<br />
schützt die Astrozyten und andere Zelltypen vor der Apoptose (PALLIS et al. 2002;<br />
GENNUSO et al. 2004).<br />
Pgp sowie auch andere MDT werden mit der Pharmakoresistenz bei einigen<br />
Erkrankungen wie Epilepsien in Verbindung gebracht (SIDDIQUI et al. 2003). Ob die<br />
Überexpression von MDT, die als Ursache für die Pharmakoresistenz diskutiert wird,<br />
durch die Krankheit selbst oder auch durch die Antiepileptika-Therapie hervorgerufen<br />
wird, ist unklar.<br />
2.4.2 Weitere Multidrug-Transporter<br />
Weitere wichtige ABC-Transporter, die ebenfalls mit Pharmakoresistenz in<br />
Verbindung gebracht werden, sind die MRPs und das Breast Cancer Resistance<br />
Protein (BCRP). Diese sind ebenso wie das Pgp in Membranen eingelagert, wobei<br />
die Expression an der luminalen Seite der Hirnendothelzellen (SUGIYAMA et al.<br />
2003; NIES et al. 2004; ZHANG et al. 2004) auch bei diesen Effluxproteinen auf eine<br />
Schutzfunktion schließen lässt.<br />
Die erste Beschreibung des BCRPs erfolgte 1998 als überexprimiertes Protein in<br />
Brustkrebszellen (ALLIKMETS et al. 1998; DOYLE et al. 1998). Es gehört zur<br />
Subfamilie der ABCG, dessen Mitglieder Halbtransporter sind (DOYLE & ROSS<br />
2003). BCRP ist ein Homodimer, wobei Disulfidbrücken den Zusammenhalt<br />
gewährleisten und nur bei der Anlagerung zweier Dimere ein Transport möglich ist.<br />
Dieses Protein transportiert in der BHS u.a. Antibiotika, Calciumkanalblocker und<br />
Chemotherapeutika (ROBEY et al. 2009). Es zeigt dabei ein leicht überlappendes<br />
Substratspektrum mit Pgp (DOYLE & ROSS 2003; LÖSCHER & POTSCHKA<br />
2005a). Unklar ist, ob Antiepileptika durch BCRP transportiert werden. CERVENY et<br />
al. (2006) konnten allerdings in BCRP-überexprimierenden MDCK II-Zellen keinen<br />
Transport der Antiepileptika Phenobarbital, Phenytoin, Ethosuximid, Primidon,<br />
Valproat, Carbamazepin, Clonazepam und Lamotrigin nachweisen.<br />
MRP1 wurde als erstes Multidrug-Resistance Protein entdeckt (COLE et al.<br />
1992). Es gehört zur ABCC-Subfamilie. Die luminale Lokalisation an der BHS stellt<br />
für MRP1 eine Ausnahme dar. Außerhalb der BHS wird MRP1 an der basolateralen<br />
21
STAND DER FORSCHUNG<br />
Membran (dem Gewebe zugewandt) von Kapillarendothelien exprimiert (EVERS et<br />
al. 1996; PENG et al. 1999; LESLIE et al. 2005). MRP1 transportiert Glutathion und<br />
organische Anionen. Diese können an Glukuronate sowie an Sulfate konjugiert sein.<br />
Für den Transport anderer Substanzen durch MRP1 wird Glutathion benötigt.<br />
Außerdem werden Chemotherapeutika und HIV-Protease-Inhibitoren durch MRP1<br />
transportiert (RENES et al. 1999; BAKOS & HOMOLYA 2007).<br />
Wie für Pgp (TISHLER et al. 1995) konnte auch für MRPs ein Zusammenhang<br />
zwischen einer Resistenz und der Überexpression dieser Transporter nachgewiesen<br />
werden (SISODIYA et al. 1999; DOMBROWSKI et al. 2001).<br />
2.5 Andere Transporter-Familien<br />
Wie in Abbildung 2.3 zu sehen ist, sind noch weitere Transporter an der<br />
Absorption, Verteilung und Elimination von Stoffen beteiligt. Die Familien der Organic<br />
Anion Transport Polypeptides (OATP) und Organic Anion Transporters (OAT)<br />
benötigen im Unterschied zu den ABC-Transportern kein ATP, weshalb auch kein<br />
Transport entgegen eines Konzentrationsgradienten möglich ist. Der Transport<br />
erfolgt in Form eines Austauschs von Molekülen entlang eines<br />
Konzentrationsgefälles. Wird ein Molekül auf die eine Seite der Membran<br />
transportiert, erfolgt im Gegenzug der Transport eines Moleküls auf die andere<br />
Membranseite. So können diese Proteine Substanzen sowohl ins Gehirn<br />
transportieren als auch für den Efflux zurück ins Blut dieser Substanzen<br />
verantwortlich sein (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a).<br />
Diese Transporter-Familien kommen nicht nur in der BHS vor, sondern auch in<br />
vielen anderen Geweben (PIZZAGALLI et al. 2002; HAGENBUCH & MEIER 2003).<br />
Dort bewerkstelligen sie den Transport von körpereigenen Stoffen (z.B.<br />
Gallensäuren, Schilddrüsenhormone) als auch anionischen Arzneimitteln wie z.B. der<br />
HMG-CoA Reduktase-Inhibitor Pravastatin, das Zytostatikum Methotrexat, das<br />
Antibiotikum Benzylpenicillin und das Herzglykosid Digoxin (HAGENBUCH & MEIER<br />
2003; MIKKAICHI et al. 2004). Diese Transporter kommen in vielen Formen vor und<br />
auch hier können Polymorphismen Einfluss auf die Funktionen von MDTs nehmen<br />
(MARZOLINI et al. 2004a; KERB 2006; GIRARDIN 2006). Es können<br />
Wechselwirkungen mit Arzneimitteln auftreten, allerdings ist die Bedeutung für<br />
Antiepileptika und die Pharmakoresistenz bei Epilepsiepatienten unklar.<br />
22
STAND DER FORSCHUNG<br />
2.6 Wechselwirkungen mit Pgp<br />
Die Substanzen, die mit Pgp interagieren, weisen sehr unterschiedliche<br />
Strukturen auf. Deshalb können sie in vier verschiedene Kategorien eingeteilt<br />
werden: 1) Substrate, 2) Inhibitoren, 3) Modulatoren und 4) Induktoren (COLABUFO<br />
et al. 2010). Die Wechselwirkungen für Pgp sind vielfältig. Der MDT kann sowohl<br />
gehemmt als auch induziert werden, wobei Substrate von Pgp häufig auch Substrate<br />
der Cytochrom-P 450 -Enzyme sind, genauer des Cytochroms CYP3A (BRINKMANN &<br />
EICHELBAUM 2001; BECKER & DREWE 2006; siehe Tabelle 2.1), welches das<br />
häufigste Cytochrom-P 450 -Enzym in Leber und Darm darstellt (KLIEWER &<br />
WILLSON 2002). Die Regulation der Expression und Aktivität von CYP3A und Pgp<br />
scheint zumindest teilweise über die gleichen Mechanismen zu erfolgen, weshalb die<br />
Differenzierung der Effekte erschwert wird.<br />
23
STAND DER FORSCHUNG<br />
Tabelle 2.1: Übersicht über Substrate, Induktoren und Inhibitoren des MDT Pgp (nach<br />
BRINKMANN & EICHELBAUM 2001; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a und BECKER &<br />
DREWE 2006).<br />
Induktoren Substrate Inhibitoren<br />
Dexamethason<br />
Antiallergika:<br />
Terfenadin<br />
Alkaloide:<br />
Colchicin, Reserpin, Staurosporin<br />
Doxorubicin<br />
Antiarrhythmika:<br />
Amiodaron, Digoxin, Propafenon,<br />
Antiarrhythmika:<br />
Amiodaron 1 , Chinidin 1 , Lidocain<br />
Quinidin<br />
Flavonoide:<br />
Kämpferol,<br />
Antibiotika:<br />
Cefazolin, Cefaperazon<br />
Anti-Malaria-Medikamente:<br />
Chloroquin, Primaquin<br />
Quercetin<br />
Johanniskraut<br />
Antiepileptika:<br />
Carbamazepin A, x , Felbamat A, x ,<br />
Antimykotika:<br />
Itraconazol, Ketoconazol<br />
Lamotrigin A, x , Phenobarbital A ,<br />
Phenytoin A<br />
Phenobarbital A<br />
Beta-Blocker:<br />
Carvedilol, Celiprolol, Talinolol<br />
Calciumantagonisten:<br />
Diltiazem, Felodipin, Nicardipin,<br />
Nifedipin, Nitrendipin, Verapamil 1<br />
Phenytoin A Calciumantagonisten:<br />
Diltiazem, Nicardipin, Verapamil<br />
HIV-Protease-Hemmer:<br />
Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir,<br />
Saquinavir<br />
Rifampicin<br />
Chemotherapeutika:<br />
Daunorubicin, Doxorubicin,<br />
Immunsuppressiva:<br />
Cyclosporin A 1 , Tacrolimus<br />
Etoposid, Mitomycin C,<br />
Mitoxantron, Paclitaxel,<br />
Tamoxifen, Teniposid, Vincristin,<br />
Vinblastin<br />
Vinblastin<br />
H 1 -Blocker:<br />
Fexofenadin, Terfenadin<br />
Neuroleptika:<br />
Flupentixol, Phenothiazin,<br />
Thioxanthen<br />
HIV-Protease-Hemmer:<br />
Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir,<br />
Saquinavir<br />
Steroide:<br />
Ethinylestradiol, Norgestrel,<br />
Progesteron, Testosteron<br />
24
STAND DER FORSCHUNG<br />
x<br />
A<br />
Induktoren Substrate Inhibitoren<br />
Immunsuppressiva:<br />
Cyclosporin, Sirolimus,<br />
Makrolid-Antibiotika:<br />
Clarithromycin, Erythromycin<br />
Tacrolimus<br />
Morphine:<br />
Morphin 6-Glucoronid, Morphin,<br />
Loperamid<br />
Weitere:<br />
Mifepriston, Paroxetin, Talinolol,<br />
Tamoxifen, Terfenadin,<br />
Trifluoperazin, Vincristin,<br />
Carbamazepin A , Detergenzien<br />
(Cremophor)<br />
Steroide:<br />
Aldosteron, Dexamethason,<br />
Hydrocortison<br />
Entwickelte Inhibitoren:<br />
2. Generation: Elacridar, Valspodar<br />
(PSC833), Biricodar, Dexverapamil<br />
3. Generation:, Laniquidar,<br />
Tariquidar, Zosuquidar<br />
Weitere:<br />
Chlorpromazin, Colchicin,<br />
Furosemid, Methadon,<br />
Midazolam, Quetiapin, Rifampicin,<br />
Simvastatin<br />
widersprüchliche Angaben<br />
Antiepileptika<br />
1<br />
Pgp-Inhibitoren der ersten Generation<br />
25
STAND DER FORSCHUNG<br />
Die Tabelle 2.1 verdeutlicht das breite Substratspektrum von Pgp. Die Effekte<br />
der einzelnen Substanzen könnten auf der unterschiedlichen Expression der<br />
sogenannten Orphan Nuclear Receptors (ONR) beruhen, die v.a. in der Leber und im<br />
Darm exprimiert werden und dort den Abbau von Substanzen über metabolisierende<br />
Enzyme vermitteln. Sie sind an der Funktion der Cytochrom-P 450 -Enzyme und der<br />
Efflux-Transporter wie Pgp beteiligt (WANG & LECLUYSE 2003; XU et al. 2005;<br />
KÖHLE & BOCK 2009). Diese Rezeptoren wirken induzierend auf den<br />
Metabolismus, gleichzeitig können sie die Induktion von Pgp bewirken. Dabei findet<br />
die transkriptionelle Regulation durch beispielsweise den Pregnane X Receptor<br />
(PXR), Constitutive Androstane Receptor (CAR) oder den Farnesoid X Receptor<br />
(FXR) statt. Alle drei sind in der Leber und dem Darm lokalisiert, des Weiteren<br />
werden PXR und CAR zusätzlich in der Niere exprimiert. PXR wurde außerdem in<br />
Hirnkapillaren nachgewiesen (BAUER et al. 2004). Die Substanzen Dexamethason<br />
und Rifampicin haben eine induzierende Wirkung auf PXR (BAUER et al. 2004).<br />
Aufgrund unterschiedlicher Bindedomänen sind die ONRs je nach Gewebe und<br />
Spezies unterschiedlich stark exprimiert (KLIEWER & WILLSON 2002; ZHOU et al.<br />
2009), wodurch Substanzeffekte variieren können. Für Pgp und MRP2 konnte<br />
gezeigt werden, dass die Expression durch PXR und CAR stark reguliert wird<br />
(SYNOLD et al. 2001; WANG & LECLUYSE 2003; TIMSIT & NEGISHI 2007).<br />
Pgp zeigt ein breites Substratspektrum. Viele Substanzen können also von<br />
diesem MDT aus dem jeweiligem Zielgewebe ausgeschleust werden. Deshalb wird<br />
angestrebt, Medikamente zu entwickeln, die keine Pgp-Substrate darstellen und den<br />
Efflux durch MDT wie Pgp umgehen können (BEGLEY 2004).<br />
2.6.1 Bekannte Pgp-Substrate<br />
Pgp transportiert sehr viele unterschiedliche Substrate, wobei die Spezifität<br />
gegenüber einem Substrat oft relativ gering ist (DIDZIAPETRIS et al. 2003). Stoffe,<br />
die gute Pgp-Substrate darstellen, gelangen i.d.R. gar nicht oder nur in einem<br />
geringen Ausmaß ins Gehirn. Dabei scheint die Lipophilie und die Größe (oft > 500<br />
Da) der Substanz keine größere Rolle zu spielen (PARDRIDGE 2003). Die Substrate<br />
können sich gegenseitig in Form eines kompetitiven Antagonismus beeinflussen<br />
(HAIT & AFTAB 1992; FORD & HAIT 1993). Klinisch relevant wird dies v.a. bei<br />
Arzneimitteln mit einer geringen therapeutischen Breite, da bereits geringfügig<br />
erhöhte Plasmakonzentration toxische Effekte hervorrufen können.<br />
26
STAND DER FORSCHUNG<br />
Antiepileptika sind relativ kleine und lipophile Substanzen, weshalb sie die<br />
BHS gut passieren können (LÖSCHER & FREY 1984). Mehrere Studien in Bezug<br />
auf Epilepsie weisen darauf hin, dass es sich bei mindestens 13 Antiepileptika um<br />
Pgp-Substrate handelt: Acetazolamid, Carbamazepin, Carbamazepine-10,11-Epoxid,<br />
Eslicarbazepinacetat, Felbamat, Gabapentin, Lamotrigin, Levetiracetam,<br />
Oxcarbazepin, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat (LÖSCHER 2005;<br />
MARCHI et al. 2005; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012). Darüber hinaus<br />
scheinen einige Antiepileptika wie Carbamazepin, Phenytoin und Valproat auch<br />
durch MRPs transportiert zu werden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005c).<br />
2.6.2 Bekannte Pgp-Induktoren<br />
Für viele Substanzen ist bekannt, dass sie durch den MDT Pgp transportiert<br />
werden (BAUER et al. 2005). Das breite Substratspektrum ermöglicht den Efflux<br />
einer Vielzahl an Substanzen zurück ins Blut, um einen größtmöglichen Schutz des<br />
Organismus vor potentiell gefährlichen Stoffen zu erreichen. Zusätzlich zum Efflux<br />
vieler Substanzen führen einige dieser Stoffe zu einer Induktion des Transporters<br />
Pgp. Das Glukokortikoid Dexamethason und die Zytostatika Doxorubicin, Rifampicin<br />
und Puromycin stellen dabei nur einige der Stoffe dar, die die Expression von Pgp<br />
induzieren (FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999; PASCUSSI et al. 2000;<br />
DEMEUSE et al. 2004; CHEN et al. 2006; NARANG et al. 2008). Weitere<br />
Substanzen, die zur Pgp-Induktion führen können, sind Antiepileptika wie<br />
Phenobarbital, Phenytoin und Carbamazepin (LOMBARDO et al. 2008; WEN et al.<br />
2008). Induktionen dieses Efflux-Transporters wurden in Leberzellen (FARDEL et al.<br />
1997; MARTIN et al. 2008), in Darmzellen (DIXIT et al. 2002; MARTIN et al. 2008)<br />
und auch in der BHS nachgewiesen (BAUER et al. 2007; HARTZ et al. 2008). Es ist<br />
aber nicht ausreichend bekannt, inwieweit die Lokalisationen in den Organen eine<br />
Rolle spielen. Die Speziesunterschiede können aber erheblich sein und wurden u.a.<br />
von BALTES et al. (2007a) und MARTIN et al. (2008) beschrieben. Für die oben<br />
genannten Stoffe konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Pgp nicht direkt<br />
erfolgt, sondern über nukleare Rezeptoren wie z.B. PXR und CAR vermittelt werden<br />
kann. Diese Rezeptoren kommen u.a. auch in der BHS vor (BAUER et al. 2006) und<br />
sorgen über den Weg von Enzymen und Transportern für den Efflux von Xenobiotika.<br />
Somit sind sie an der Schutzfunktion des Gehirns beteiligt (WANG & LECLUYSE<br />
2003; XU et al. 2005; KÖHLE & BOCK 2009).<br />
27
STAND DER FORSCHUNG<br />
2.6.3 Bekannte Pgp-Inhibitoren<br />
Eine erhöhte Funktionalität bzw. Expression des MDT Pgp ist ein Phänomen,<br />
das bei vielen Erkrankungen auftritt. Erstmals wurde dies mit therapieresistenten<br />
Tumoren in Verbindung gebracht (JULIANO & LING 1976). Deshalb wurden in der<br />
Tumorforschung bereits Inhibitoren auf ihr Vermögen Pharmakoresistenzen<br />
aufzuheben in klinischen Studien getestet (THOMAS & COLEY 2003; ILLMER et al.<br />
2004; ROBEY et al. 2008b; LAGAS et al. 2009). Bei gleichzeitiger Verabreichung<br />
eines Pgp-Substrats und eines Pgp-Inhibitors wurde die Bioverfügbarkeit des<br />
Substrats erhöht (YU 1999). Der Nachweis, dass die Inhibition von Pgp in der BHS<br />
durch lokale Applikation des Inhibitors zu einer erhöhten Konzentration<br />
verschiedener Substanzen wie z.B. Antiepileptika im Gehirn führt, wurde bereits<br />
erbracht (SAWCHUK & ELMQUIST 2000; LÖSCHER & POTSCHKA 2002).<br />
Noch werden Inhibitoren für MDT nicht regulär in der Epilepsietherapie<br />
eingesetzt. Dies ist u.a. darin begründet, dass Pgp nicht nur in der BHS exprimiert<br />
wird, sondern auch in anderen Organen und Geweben lokalisiert ist (Abbildung 2.4)<br />
und die Inhibition zum einen Auswirkungen auf die Bioverfügbarkeit und<br />
Pharmakodynamik anderer Substanzen, zum anderen toxische Nebenwirkungen auf<br />
gesunde Organe haben kann (DOYLE & ROSS 2003). Aus diesem Grund sollte die<br />
Applikation des jeweiligen Inhibitors möglichst lokal erfolgen, um Nebenwirkungen zu<br />
vermeiden. Dennoch könnte die zumindest transiente Inhibition von Pgp und weiterer<br />
MDT durch kurzzeitige Administration der Inhibitoren nützlich sein, um<br />
Pharmakoresistenzen aufgrund gesteigerter MDT-Funktionen aufzuheben oder gar<br />
zu vermeiden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a).<br />
Zu den Pgp-Inhibitoren zählt eine Reihe an Arzneimitteln (siehe Tabelle 2.1)<br />
mit unterschiedlichen Einsatzgebieten sowie eigens zu diesem Zweck entwickelte<br />
Substanzen. Auch Hilfsstoffe der jeweiligen Formulierung eines Medikaments,<br />
beispielsweise Emulgatoren, können hemmend auf Pgp wirken (MARTIN-FACKLAM<br />
et al. 2002; LÖSCHER & POTSCHKA 2005c).<br />
Für Cyclosporin A, einem Immunsuppressivum und Pgp-Inhibitor der ersten<br />
Generation, wurde dessen inhibierende Wirkung auf Pgp sowohl in Zelllinien (NOBILI<br />
et al. 2006) als auch in Tiermodellen (SLATER et al. 1986; SIKIC et al. 1997; EYAL<br />
et al. 2009) nachgewiesen. Allerdings wird es aufgrund seiner immunsuppressiven<br />
Wirkung eher bei Organtransplantationen eingesetzt und nicht zur Behandlung<br />
pharmakoresistenter Epilepsien (LIU et al. 2007).<br />
28
STAND DER FORSCHUNG<br />
Ein weiterer Pgp-Inhibitor der ersten Generation ist der Calciumantagonist<br />
Verapamil, der zur Behandlung koronarer Herzerkrankungen, Arrhythmien und<br />
Bluthochdruck eingesetzt wird (SCHWARTZ & TRIGGLE 1984). Allerdings wiesen<br />
klinische Studien für eine Inhibition von Pgp notwendigen Plasmakonzentrationen<br />
herztoxische Nebenwirkungen nach (DALTON et al. 1989; MILLER et al. 1991).<br />
Ähnliche toxische Effekte und eine zu geringe Spezifität waren für andere Pgp-<br />
Inhibitoren zu verzeichnen (DOYLE & ROSS 2003), was auf ihre ursprüngliche<br />
Indikation und nicht auf die Pgp-Hemmung zurückzuführen ist.<br />
Valspodar, ein Pgp-Inhibitor der zweiten Generation, schien eine größere<br />
Selektivität und Toleranz aufzuweisen, um die Nebenwirkungen für den Organismus<br />
gering zu halten. Allerdings traten auch hier Wechselwirkungen mit anderen<br />
Transportern auf (BATES et al. 2002; THOMAS & COLEY 2003; LÖSCHER &<br />
POTSCHKA 2005a). Pgp-Inhibitoren der dritten Generation, z.B. Elacridar und<br />
Tariquidar, erschienen hinsichtlich ihrer Spezifität der Pgp-Inhibition, der wenigen<br />
Wechselwirkungen mit dem Cytochrom-P 450 -System und Nebenwirkungen sehr<br />
vielversprechend (BATES et al. 2002; THOMAS & COLEY 2003), dennoch zeigten<br />
weiterführende Studien Interaktionen mit dem MDT BCRP (DE BRUIN et al. 1999;<br />
ROBEY et al. 2004; KANNAN et al. 2010).<br />
Die in Abschnitt 2.1.3 beschriebenen Strategien zur Überwindung des Efflux<br />
durch die MDT und der BHS in Form von Nanopartikeln und Liposomen, könnten<br />
auch für die Applikation von MDT-Inhibitoren an der BHS genutzt werden.<br />
Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass unerwünschte Nebenwirkungen der<br />
Inhibitoren durch den Einschluss in Liposomen eingegrenzt werden (FISHER & HO<br />
2002; FRICKER & MILLER 2004).<br />
2.6.4 Pgp-Trafficking<br />
Pgp ist in der Membran lokalisiert und in intrazellulären Kompartimenten wie<br />
Endoplasmatischem Retikulum (ER), Golgi-Apparat, Endosomen und Lysosomen zu<br />
finden. Es zirkuliert zwischen diesen Kompartimenten und der Zellmembran<br />
(intrazelluläres Trafficking) (FU & ARIAS 2012).<br />
Das Trafficking beschreibt im Wesentlichen den Transport innerhalb der Zellen<br />
vom Ort der Entstehung eines Proteins an seinen Wirkort einschließlich der<br />
Bereitstellung in Speichervesikeln und des Abbaus. Daran ist v.a. der Golgi-Apparat<br />
beteiligt, der für die Sortierung und den Transport der Proteine verantwortlich ist.<br />
29
STAND DER FORSCHUNG<br />
Proteine, die nicht im Zytosol sondern in Membranen oder extrazellulär benötigt<br />
werden, werden nach ihrer Synthese im rauhen Endoplasmatischen Retikulum zum<br />
Golgi-Apparat weitergeleitet und dort für den weiteren Transportweg modifiziert und<br />
in Endosomen verpackt.<br />
Zur Untersuchung des Traffickings nutzen Studien dazu v.a. das grünfluoreszierende<br />
Protein (GFP), welches Untersuchungen der Zellen als dynamisches<br />
System ermöglicht (LIPPINCOTT-SCHWARTZ 1998) und die direkte Beobachtung<br />
intrazellulärer Strukturen ermöglicht. Mit Zeitraffer-Aufnahmen von GFP-markierten<br />
sekretorischen Transportmolekülen war es möglich, den zeitlichen Ablauf vom<br />
Ursprung des Proteins über seinen Transportweg bis zum Zielort zu ermitteln<br />
(LIPPINCOTT-SCHWARTZ 2000).<br />
Mittels Pgp-Trafficking können weiterführende Untersuchungen zur Modulation<br />
des Transporters durchgeführt werden. Es wird davon ausgegangen, dass Pgp nicht<br />
permanent neu synthetisiert wird, sondern in Vesikeln zwischengelagert und erst<br />
später an die Membran transportiert wird (FU & ARIAS 2012), wo es dann aktiv am<br />
Efflux von Substanzen beteiligt ist. Die Aktivität dieses Pgps wurde z.B. in<br />
Rattenhirnendothelzellen gezeigt (MCCAFFREY et al. 2012). Das bedeutet, dass<br />
Pgp in einem relativ kurzen Zeitraum (innerhalb von Stunden) an seinen Wirkort<br />
gelangt und längere Phasen der Neusynthese damit umgangen werden können.<br />
Kenntnisse zu den Abläufen des Pgp-Trafficking könnten Hinweise zur<br />
Inhibition des Transporters geben. Dies könnte neue Therapiestrategien und<br />
Möglichkeiten aufzeigen, Pharmakoresistenzen zu umgehen. Es konnte<br />
nachgewiesen werden, dass die Unterbrechung des Pgp-Traffickings zur<br />
Zellmembran zu einem Anstieg der intrazellulären Konzentration von Antitumor-<br />
Medikamenten führte (FU et al. 2004; FU et al. 2007). Auf diese Weise könnten auch<br />
Einflüsse der Antiepileptika auf das Protein-Trafficking und auf die Bereitstellung von<br />
funktionellem Pgp sowie potentielle Behandlungs-möglichkeiten pharmakoresistenter<br />
Epilepsien untersucht werden.<br />
2.7 In-vivo-Untersuchungen<br />
Für In-vivo-Untersuchungen der MDT und deren Transport sowie<br />
Modulationen stehen funktionelle bildgebende Verfahren wie z.B. die<br />
Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (Singular Photon Emission<br />
Computed Tomographie; SPECT) und die Positron-Emissions-Tomographie (PET)<br />
30
STAND DER FORSCHUNG<br />
zur Verfügung. Auf diese Weise können radioaktiv-markierte Substrate oder<br />
Inhibitoren nicht-invasiv im lebenden Organismus nachgewiesen werden (LÖSCHER<br />
& LANGER 2010; LÖSCHER et al. 2011).<br />
Außerdem werden genetisch veränderte Tiere, vorzugsweise Mäuse,<br />
eingesetzt, um Funktionen bestimmter Proteine bzw. MDT, zu untersuchen. Dabei<br />
werden gezielt ein oder mehrere MDT ausgeschaltet, sodass Vergleiche dieser<br />
sogenannten Knockout-Tiere mit den unveränderten Wildtyp-Tieren angestellt<br />
werden können. Man geht davon aus, dass, sofern es sich um ein Substrat handelt,<br />
ein ausgeschalteter Transporter an der BHS zu einer erhöhten Substratkonzentration<br />
im Gehirn führt (DORAN et al. 2005). Allerdings muss dabei beachtet werden, dass<br />
durch den Knockout eines Transporters die Funktionen oder Expressionen anderer<br />
MDT verändert werden können, da sich die Transporter in ihren Funktionen<br />
möglicherweise gegenseitig ersetzen. Dies wurde bereits in Tierstudien gezeigt, bei<br />
denen Transporter oder deren mRNA an der BHS oder anderen Geweben<br />
heraufreguliert waren (SCHINKEL et al. 1994; CISTERNINO et al. 2004;<br />
HOFFMANN & LÖSCHER 2007). Derartige kompensatorische Mechanismen<br />
konnten auch in vitro nachgewiesen werden (KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010).<br />
2.8 In-vitro-Untersuchungen<br />
Für Untersuchungen der BHS, des Transports an der Barriere sowie deren<br />
Modulation werden seit langem unterschiedliche Techniken und Modelle verwendet<br />
(DELI et al. 2005). Mit Tiermodellen sind Untersuchungen zellulärer und molekularer<br />
Mechanismen allerdings nur begrenzt möglich. Daher wurden In-vitro-Modelle der<br />
BHS entwickelt, die viele In-vivo-Charakteristika der BHS zeigen. Gerade für die<br />
Untersuchung der Expression und Funktionalität der Transportsysteme der BHS<br />
haben sich In-vitro-Modelle bewährt (TAKAKURA et al. 1991; BONATE 1995; DELI<br />
et al. 2005), die u.a. zur Untersuchungen von Substraten der MDT eingesetzt werden<br />
(HOCHMAN et al. 2002). In-vitro-Modelle mit immortalisierten Zelllinien bieten die<br />
Vorteile, dass weder Tierhaltung noch aufwendige Primärzellpräparationen<br />
erforderlich sind. Mit In-vitro-Modellen lassen sich Substanzen auf ihre<br />
modulatorischen Eigenschaften gegenüber MDT in hohem Durchsatz testen. Sie sind<br />
i.d.R. günstiger als In-vivo-Modelle und lassen gezieltere Untersuchungen einzelner<br />
Sachverhalte sowie Analysen auf molekularer Ebene zu (LUNDQUIST & RENFTEL<br />
2002).<br />
31
STAND DER FORSCHUNG<br />
Letztlich zeigen alle zurzeit verfügbaren In-vitro-BHS-Modelle Vor- und<br />
Nachteile, und nicht für alle Modelle werden Zellen der BHS verwendet.<br />
Primärkulturen der BHS oder auch Kokulturen mit Astrozyten sollen eher geeignet<br />
sein (CARDOSO et al. 2010; HATHERELL et al. 2011), können aber nicht für alle<br />
Untersuchungen eingesetzt werden.<br />
In-vitro-Modelle können in direkte und indirekte Methoden unterteilt werden.<br />
2.8.1 Indirekte In-vitro-Modelle<br />
Der ATPase-Assay stellt eine indirekte Möglichkeit dar, die Aktivität eines<br />
Transporters zu untersuchen. Dabei werden Substrate eines Transporters ermittelt,<br />
indem die ATPase-Aktivität des Transporters quantifiziert wird. Dieser Assay macht<br />
sich die Eigenschaft der ABC-Transporter zunutze, die für den Transport einer<br />
Substanz über die BHS notwendigerweise Energie aus der Spaltung von ATP<br />
benötigen. Die Menge des bei der ATP-Hydrolyse freigesetzten Phosphats ist<br />
proportional der Aktivität eines Transporters (GLAVINAS et al. 2008).<br />
Der Calcein-AM-Assay dient in erster Linie dazu, vitale Zellen zu markieren.<br />
Dabei nutzt man die Eigenschaft intrazellulärer Esterasen, die die<br />
Acetoxymethylester (AM)-Gruppe des Calcein-AMs nach Aufnahme in vitale Zellen<br />
abspalten. Das freiwerdende Calcein kann die Zellen aufgrund des hydrophilen<br />
Charakters nicht verlassen und der Nachweis mittels Fluoreszenz-Messung ist<br />
möglich. Calcein-AM wird aber von Pgp und MRP1 transportiert (SZAKÁCS et al.<br />
1998; GLAVINAS et al. 2008), sodass mögliche Substrate der MDT um die Bindung<br />
an diese mit dem Calcein-AM konkurrieren und z.B. Vergleiche zwischen normalund<br />
MDT-überexprimierenden Zellen möglich sind. Es müssen aber nicht<br />
zwangsläufig eine Korrelation zwischen Substraten und Inhibitoren der MDT<br />
bestehen (FENG et al. 2008). Deshalb bedeutet das Ausbleiben einer Inhibition des<br />
Calcein-AM-Efflux nicht, dass eine Substanz nicht transportiert wird.<br />
2.8.2 Direkte In-vitro-Modelle<br />
Zu den direkten Methoden gehört beispielsweise der Kumulations-Assay<br />
(auch Uptake-Assay), mit dessen Hilfe und unter Verwendung spezifischer<br />
Inhibitoren die Anreicherung bestimmter Substanzen in Zellen in einem definierten<br />
Zeitraum untersucht werden kann. Sofern ein Stoff von einem Transporterprotein aus<br />
den Zellen heraustransportiert wird, verringert sich die Konzentration in den Zellen.<br />
32
STAND DER FORSCHUNG<br />
Dieser Umstand kann durch Inhibitoren verhindert werden. Ein Nachteil dieser<br />
Methode ist die hohe Permeabilität kleiner lipophiler Substanzen, die mit diesem<br />
Assay nicht erfasst werden können.<br />
Mit den Transport-Assays ist es möglich herauszufinden, ob Substanzen<br />
durch MDT transportiert werden (SCHWAB et al. 2003b). Dazu muss aber die<br />
parazelluläre Diffusion vermieden bzw. ausgeschlossen werden, was durch<br />
konfluente und dichte Zellmonolayer erreicht werden kann. Wie in der Abbildung 2.5<br />
zu sehen ist, werden die Zellen in einem dreidimensionalen Transwell-Modell auf<br />
einer semi-permeablen Membran kultiviert (GROBSTEIN 1953).<br />
Abbildung 2.5: Modell des Transwell-Systems, nach LUNA-TORTÓS et al. (2008).<br />
Das Transwell-System dient der Erkennung der Substrate von MDT. Die Zellen werden auf einer<br />
feinporigen Membran des Kammereinsatzes kultiviert und bilden einen Monolayer mit engen<br />
Verbindungen (Tight junctions) zwischen den Zellen aus. Medium wird in beide Kammern<br />
eingefüllt. Aufgrund der Trennung der apikalen (blutzugewandt) und der basolateralen<br />
(hirnseitig) Kammer, ist ein Durchtritt nur durch die Zellmembran möglich.<br />
Diese Membran unterteilt das System in eine apikale und basolaterale<br />
Kammer. Die Testsubstanz wird in eine der Kammern gegeben (bidirektionaler<br />
Transport-Assay). Proben werden auf der jeweils anderen Seite entnommen. Bei<br />
dieser Variante des Assays kann der Einfluss der passiven und parazellulären<br />
Diffusion einer Substanz nicht ausgeschlossen werden, weshalb die Methode in der<br />
hiesigen Arbeitsgruppe modifiziert wurde. Für den Konzentrationsgleichgewichts-<br />
Assay (Concentration Equilibrium Assay, CETA) wird die Testsubstanz in der<br />
33
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
STAND DER FORSCHUNG<br />
gleichen Konzentration sowohl in die apikale als auch basolaterale Kammer gegeben<br />
und Proben aus beiden entnommen (LUNA-TORTÓS et al. 2008).<br />
Man spricht von einem Transport, wenn sich die Konzentrationen der zu<br />
untersuchenden Substanz zwischen der apikalen und basolateralen Kammer<br />
signifikant unterscheiden. Werden keine Unterschiede zwischen den<br />
Konzentrationen einer Substanz in beiden Kammern nachgewiesen, geht man<br />
zunächst davon aus, dass dieser Transport entweder inhibiert wurde oder die<br />
Testsubstanz nicht von dem untersuchten Transporter transportiert wird (siehe<br />
Abbildung 2.6 B).<br />
A<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
Digoxin (10 nM)<br />
LLC-Zellen<br />
* * * * *<br />
80<br />
apikal<br />
60<br />
basolateral<br />
40<br />
0 120 240 360 480 600<br />
min<br />
B<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
Digoxin (10 nM) + TQD (0,5 µM)<br />
LLC-Zellen<br />
40<br />
0 120 240 360 480 600<br />
min<br />
Abbildung 2.6: Beispielhafte CETAs mit Pgp-überexprimierenden LLC-Zellen +/- Inhibitor von<br />
K. Römermann.<br />
A: Transportversuch mit Digoxin. Die apikale Digoxin-Konzentration steigt an, die basolaterale<br />
Konzentration des Pgp-Substrats sinkt. Die Konzentrationsunterschiede waren signifikant<br />
verschieden. Ein Transport des Pgp-Substrats Digoxin wurde nachgewiesen.<br />
B: Digoxin-Transportversuch nach Zugabe des Pgp-Inhibitors Tariquidar (TQD; 0,5 µM). Die<br />
Konzentrationsunterschiede zwischen apikaler und basolateraler Kammer wurden aufgehoben.<br />
Der Transport wurde inhibiert.<br />
Aber auch beim CETA kann die Diffusion der Testsubstanzen nicht vollständig<br />
eliminiert werden. Beispielsweise sollten Untersuchungen der Dichtigkeit eines<br />
Monolayers durchgeführt werden. Für beide Varianten des Transportversuchs sind<br />
dichte Monolayer eine Voraussetzung. Die Endothelzellen der BHS zeigen diese<br />
Barriere-Eigenschaften in vivo. NICOLAZZO et al. (2006) wiesen aber nach, dass Invitro<br />
BHS-Modelle eine geringere oder gar ausbleibende Expression wichtiger Tight<br />
34
STAND DER FORSCHUNG<br />
junction-Proteine sowie höhere Permeabilitäten zeigen. URICH et al. (2012)<br />
berichteten ebenfalls, dass primäre Hirnkapillarendothelien der Maus außerhalb ihrer<br />
In-vivo-Umgebung ihre einzigartigen Charakteristika verlieren. Deshalb werden<br />
häufig LLC- und MDCK II-Zellen, die aus dem Nierenepithel des Schweins bzw. des<br />
Hundes stammen, verwendet. Diese zeigen aufgrund dichter Monolayer ausreichend<br />
hohe transepitheliale elektrische Widerstände (transepithelial/-endothelial electrical<br />
resistance, TEER) und niedrige Permeabilitäten parazellulärer Marker wie Mannitol<br />
oder Sucrose (LUNA-TORTÓS et al. 2008), weshalb sie für<br />
Transportuntersuchungen geeignet sind.<br />
Parazelluläre polare und folglich nicht lipophile Markersubstanzen (z.B.<br />
Sucrose oder Mannitol) (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010), die aufgrund dieser<br />
Eigenschaften nicht in die Zellen gelangen, sowie der transendotheliale Widerstand,<br />
der auf die Ausbildung der Tight junctions zurückgeführt wird (STANNESS et al.<br />
1997; LUNA-TORTÓS et al. 2008; HATHERELL et al. 2011), stellen Parameter der<br />
Dichtigkeit dar. Einen festgelegten TEER-Wert gibt es nicht, er ist von der Zelllinie<br />
sowie den Bedingungen in den einzelnen Laboren abhängig und somit ein<br />
Erfahrungswert. Für Mannitol und Sucrose gilt: je niedriger die Permeabilität, desto<br />
höher die Dichtigkeit der Zellmembran und der Tight junctions zwischen den Zellen.<br />
Wenn also der TEER-Wert sehr hoch und die Permeabilität der Markersubstanz sehr<br />
gering ist, ist die Wahrscheinlichkeit am höchsten, dass die zu untersuchende<br />
Substanz den Weg durch die Zellen nimmt und ein Transport nachgewiesen werden<br />
kann.<br />
2.8.3 Primärkulturen<br />
Dauerhafte immortalisierte Zellkulturen können im Vergleich zu primären<br />
Zellen des Ursprungsgewebes Veränderungen aufweisen, beispielsweise in der<br />
Expression bestimmter Transporter. Deshalb werden Primärkulturen aus<br />
Hirnkapillarendothelien, die direkt aus dem Gehirn verschiedener Spezies präpariert<br />
und in Kultur gebracht werden können, in Untersuchungen eingesetzt (FRANKE et<br />
al. 2000). Die so gewonnenen Hirnzellen werden nicht immortalisiert, d.h. sie können<br />
sich nicht unbegrenzt teilen und sind demnach nur über einen kurzen Zeitraum für<br />
Experimente verwendbar.<br />
Eine weitere Schwierigkeit besteht in dem offensichtlichen Verlust der<br />
Barriere-Eigenschaften der Hirnkapillarendothelien in vitro. Dieser Zelltyp kann seine<br />
35
STAND DER FORSCHUNG<br />
Charakteristika wie die Ausbildung der Tight junctions und der nahezu vollständig<br />
unterbundenen Permeation von Substanzen nicht nur durch<br />
Immortalisierungsprozesse verlieren (NICOLAZZO et al. 2006). Die Kultivierung der<br />
Primärzellen kann zu Verlusten der BHS-Eigenschaften führen, auch wenn die<br />
Passagenzahl der Zellen gering gehalten wird (URICH et al. 2012).<br />
Hirnkapillarendothelien und deren Eigenschaften sind von ihrer Umgebung abhängig<br />
und dies muss bei der Entwicklung von BHS-Modellen beachtet werden. Aus diesem<br />
Grund werden Kokulturen mit beispielsweise Astrozyten als Modelle der BHS<br />
eingesetzt (NAKAGAWA et al. 2007).<br />
2.8.4 Ko- und Trikulturen<br />
Wenn auch einige Zelllinien für Transport-Assays geeignet sind, können sie<br />
die BHS und ihre Eigenschaften nur zu einem gewissen Teil nachahmen. Ähnlich<br />
verhält es sich mit primären Hirnendothelzellen. Oft werden Tight junctions nicht oder<br />
nur unvollständig ausgebildet oder die Permeabilitäten bestimmter parazellulärer<br />
Marker sind zu hoch (BEREZOWSKI et al. 2004). Deshalb wurden zur besseren<br />
Simulation der In-vivo-Situation und zur Verbesserung der Integrität der<br />
Zellmonolayer Ko- oder Trikulturen mit Astrozyten und/oder Perizyten und den<br />
Endothelzellen untersucht (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003;<br />
HATHERELL et al. 2011). Kokultur-Versuche von Hirnendothelzellen mit Astrozyten<br />
und Perizyten zeigten u.a., dass die Ausbildung der Tight junctions erhöht wird<br />
(DEMEUSE et al. 2002; HAYASHI et al. 2004), was wiederum positiven Einfluss auf<br />
die Dichtigkeit der Zellen hat. Dabei scheint die Kontakt-Kokultur, bei der die<br />
Endothelzellen auf der einen Seite der Membran und die Astrozyten oder Perizyten<br />
auf der anderen Seite kultiviert werden, besser geeignet zu sein als die Nichtkontakt-<br />
Kokultur (ABBOTT 2002). GAILLARD et al. (2000) und GARCIA et al. (2004) fanden<br />
heraus, dass durch die Kontakt-Kokultur mit Astrozyten die Expression von Pgp und<br />
Tight junction-Proteinen wie Occludin heraufreguliert wird.<br />
Trikulturen mit Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten kommen der In-vivo-<br />
Situation noch näher (NAKAGAWA et al. 2007). Außerdem stabilisieren sie die Tight<br />
junctions (SCHIERA et al. 2003) und führten zu den höchsten transendothelialen<br />
Widerständen in diesem Modell (NAKAGAWA et al. 2007). Dies konnten<br />
HATHERELL et al. (2011) bestätigen. Die Kokultur der immortalisierten humanen<br />
36
STAND DER FORSCHUNG<br />
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 mit humanen Astrozyten zeigte im Vergleich<br />
zur Monokultur der Endothelzellen höhere transendotheliale Widerstände.<br />
2.8.5 Humanes dynamisches In-vitro-Bluthirnschranken-Modell<br />
Für Untersuchungen von Epilepsieerkrankungen existieren viele verschiedene<br />
Modelle, sowohl Tier- als auch In-vitro-Modelle. Dennoch gibt es zurzeit kein ideales<br />
Modell der BHS (DELI et al. 2005). Ein Versuchsaufbau, der einem optimalen Modell<br />
sehr nahe kommt, ist das von STANNESS et al. (1996 & 1999) entwickelte humane<br />
dynamische In-vitro-BHS-Modell (humanized dynamic in vitro blood-brain barrier<br />
model, hDIV-BBB), welches von anderen Gruppen weiter optimiert wurde und<br />
Anwendung in Untersuchungen der Epilepsien gefunden hat (JANIGRO et al. 1999;<br />
CUCULLO et al. 2002 & 2007). In diesem Modell werden die Scherkräfte des<br />
Blutstroms der Gehirngefäße nachgestellt, sodass sich Charakteristika der BHS<br />
nahezu vollständig ausbilden. Auf diese Weise kann das Problem der mangelnden<br />
Integrität der Primärkulturen umgangen werden, und Transportversuche können<br />
durchgeführt werden.<br />
Beispielsweise zeigten Cucullo et al. (2007) in Untersuchungen mit<br />
Primärkulturen aus gesundem Hirngewebe und Gewebe pharmakoresistenter<br />
Epilepsiepatienten in Kokultur mit humanen Astrozyten Unterschiede im Transport<br />
des Antiepileptikums Phenytoin. Dabei wurde Phenytoin in Zellen aus epileptischem<br />
Hirngewebe in stärkerem Ausmaß von Pgp transportiert als in den Zellen aus dem<br />
gesunden Gewebe. Dies lässt auf eine erhöhte Pgp-Expression in<br />
pharmakoresistentem epileptischem Gewebe schließen. Allerdings sind auf diese<br />
Weise keine Untersuchungen mit einem hohen Durchsatz möglich. Deshalb sollten<br />
mehrere verschiedene Methoden angewendet werden, um Aussagen darüber treffen<br />
zu können, ob Substanzen die Pgp-Funktion modulieren können (SCHWAB et al.<br />
2003b). Dies ist auch für die immer größer werdende Zahl unterschiedlicher Modelle<br />
wichtig, da sich der Vergleich der Studien, die zur Identifizierung von Substraten der<br />
MDT genutzt werden, durch verschiedene Protokolle und Interpretation der<br />
Ergebnisse, schwierig gestaltet.<br />
37
FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT<br />
3 FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT<br />
Die Folgen von Pharmakoresistenz bei Epilepsien sind erheblich (DEVINSKY<br />
2003; SPERLING 2004; KANNER et al. 2012). Als ein Grund für die<br />
Pharmakoresistenz wird die Überexpression von MDT in der BHS diskutiert, die in<br />
epileptischem Hirngewebe bereits nachgewiesen wurde (TISHLER et al. 1995;<br />
SISODIYA et al. 1999; DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al. 2003).<br />
Vermutungen zufolge könnte das vermehrte Auftreten dieser Transporter in der BHS<br />
u.a. auch durch die Antiepileptika selbst hervorgerufen werden (BAUER et al. 2007;<br />
HARTZ et al. 2008; LOMBARDO et al. 2008).<br />
Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die MDT-Hypothese, die eine der<br />
favorisiertesten Erklärungen für die Pharmakoresistenz darstellt. Ausgangspunkt für<br />
das Promotionsprojekt waren Untersuchungen an Darm- und Leberzellen, in denen<br />
eine Induktion von Pgp durch Antiepileptika nachgewiesen wurde (SCHUETZ et al.<br />
1996; MARTIN et al. 2008). Ich konnte mit In-vitro-Untersuchungen bereits zeigen,<br />
dass die Behandlung mit bestimmten Antiepileptika zu einer Induktion der Pgp-<br />
Funktionalität und Expression in den Rattenhirnendothelzelllinien GPNT und RBE4<br />
führt (NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Daraus ergab sich die Frage, ob Antiepileptika<br />
auch in Hirnkapillarendothelzellen humanen Ursprungs zur Pgp-Induktion führen. Für<br />
die Bearbeitung des Themas wurde die immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3<br />
eingesetzt, die aus reseziertem Gewebe des Temporallappens einer<br />
therapieresistenten Epilepsiepatientin gewonnen wurde (WEKSLER et al. 2005). Mit<br />
diesen Zellen besteht nicht nur die Nähe zum Thema der Pharmakoresistenz bei<br />
Epilepsiepatienten, sondern auch zur MDT-Hypothese, die die Überexpression von<br />
MDT in der BHS für die Pharmakoresistenz verantwortlich macht.<br />
Ein weiterer wichtiger Aspekt, der in diesem Projekt untersucht werden sollte,<br />
war die Etablierung eines In-vitro-BHS-Modells mit humanen Zellen, das sensitiv<br />
genug ist, den Transport von Antiepileptika zu untersuchen. Mehrere Studien<br />
belegten bereits den Transport von Antiepileptika durch Pgp. Der Nachweis erfolgte<br />
u.a. in der hiesigen Arbeitsgruppe in Epithelzellen der Niere, die aufgrund ihrer<br />
Eigenschaften gut für Transportuntersuchungen geeignet sind (LUNA-TORTÓS et al.<br />
2008 & 2009). Allerdings sind kaum Daten aus Studien mit humanem Gewebe bzw.<br />
Zellen vorhanden, da es lange Zeit keine geeigneten BHS-Modelle gab. Zur<br />
Entwicklung neuer und besserer Modelle für die BHS wurden bereits<br />
38
FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT<br />
Untersuchungen an hCMEC/D3-Zellen durchgeführt (WEKSLER et al. 2005;<br />
CUCULLO et al. 2008; POLLER et al. 2008; TAI et al. 2009). Dabei zeigte sich die<br />
mögliche Eignung der hCMEC/D3-Zellen für Transportversuche (POLLER et al.<br />
2008; CARL et al. 2010). Derartige Versuche an Hirnendothelien humanen<br />
Ursprungs bieten eine vielversprechende Möglichkeit zur Untersuchung der<br />
Pharmakoresistenz bei Epilepsien. Deshalb könnten Transportversuche mit den<br />
hCMEC/D3-Zellen, sofern sie sich für diese Methode als geeignet erweisen, einen<br />
großen Wissensfortschritt ermöglichen und zur Klärung beitragen, ob Antiepileptika<br />
auch durch MDT in Hirnendothelzellen humanen Ursprungs transportiert werden.<br />
Zusätzlich zu den Experimenten mit den immortalisierten Zelllinien sollte zur<br />
Gewinnung von Primärkulturen Hirnendothel aus der Ratte entnommen werden.<br />
Diese Primärzellen sollten ebenfalls als Transportmodell eingesetzt werden, um den<br />
Transport von Antiepileptika in primären Zellen zu untersuchen. Durch den Einsatz<br />
von immortalisierten Zelllinien und Primärkulturen sollte unter Berücksichtigung von<br />
Speziesunterschieden untersucht werden, welche Antiepileptika Substrate von MDT<br />
an der BHS sind, und welche in der Lage sind, die Funktion von<br />
Transporterproteinen zu beeinflussen. Aufgrund dieser Kenntnisse könnte eine<br />
gezieltere und effektivere Epilepsiebehandlung möglich sein.<br />
39
MATERIAL UND METHODEN<br />
4 MATERIAL UND METHODEN<br />
Hinweis:<br />
Im Anhang befinden sich die ausführlichen Protokolle der nun im Folgenden<br />
beschriebenen Methoden. Weiterhin sind alle verwendeten Substanzen,<br />
Verbrauchsmaterialien und Geräte samt der jeweiligen Bezugsquelle sowie die<br />
Zusammensetzungen verwendeter Puffer und Lösungen im Anhang aufgelistet.<br />
4.1 Immortalisierte Zelllinien<br />
Für die vorliegende Arbeit wurden drei verschiedene immortalisierte Zelllinien<br />
verwendet (hCMEC/D3, GPNT und RBE4) sowie Primärkulturen aus dem<br />
Rattenhirnendothel.<br />
GPNT- und RBE4-Zellen wurden freundlicherweise von Prof. F. Roux<br />
(INSERM U26, Unité de Neuro-Pharmaco-Nutrition, Hôpital Fernand Widal, Paris,<br />
Frankreich), die hCMEC/D3-Zellen von Dr. P.-O. Couraud (The Cochin Institute:<br />
INSERM (Unit 1016), CNRS (UMR 8104) und Descartes Universität Paris,<br />
Frankreich, UPD (UMR-S 1016)) zur Verfügung gestellt.<br />
4.1.1 Humane Hirnkapillarendothelzellen: hCMEC/D3<br />
Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 (human Cerebral<br />
Microvessel Endothelial Cells) wurde im Zuge einer chirurgischen Entfernung des<br />
epileptischen Fokus aus dem Gewebe des Temporallappens einer<br />
pharmakoresistenten Epilepsiepatientin gewonnen (WEKSLER et al. 2005). Die<br />
Zellen wurden mittels einer sequentiellen lentiviralen Transduktion mit hTERT<br />
(human telomerase catalytic unit) und SV40 T-Antigen transfiziert. Nach folgenden<br />
Klonierungsschritten wurde der Klon hCMEC/D3 für die Entwicklung der Zelllinie<br />
verwendet. Er zeigte die Expression der Endothelial-Marker PECAM-1, ß-Catenin,<br />
ZO-1 und Willebrand-Faktor.<br />
Die Zellen zeigen in Kultur Kontaktinhibition, Charakteristika der BHS wie<br />
Expression von Tight junction-Proteinen sowie der Multidrug-Transporter Pgp, MRP1<br />
und BCRP (WEKSLER et al. 2005). Diese Transporterproteine befähigen die Zellen,<br />
aktiv Substanzen herauszutransportieren. Sie gelten deshalb als geeignetes<br />
Werkzeug für Untersuchungen der Entzündungs- und Infektionsantworten und der<br />
Funktion der BHS (POLLER et al. 2010; FASLER-KAN et al. 2010; DANIELS et al.<br />
2012). Es gibt erste Untersuchungen zur Eignung der hCMEC/D3-Zellen als BHS-<br />
40
MATERIAL UND METHODEN<br />
Modell für Transportuntersuchungen (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). Diese<br />
Anwendung wird aber kontrovers diskutiert (URICH et al. 2012). Weiterhin wurden<br />
bereits Studien zu Ko- oder Trikulturen mit dieser immortalisierten Zelllinie<br />
durchgeführt, die die Optimierung von In-vitro-BHS-Modellen durch die Kultivierung<br />
mit Astrozyten und Perizyten aufzeigen (HATHERELL et al. 2011).<br />
Die Hirnkapillarendothelzellen wurden in folgendem Medium kultiviert:<br />
- EBM-2 Medium<br />
- 5 % (v/v) fetales Kälberserum<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)<br />
- 1 % Chemically defined Lipid Concentrate (1/100)<br />
- 10 mM HEPES (1 M)<br />
- 5 µg/ml Ascorbinsäure<br />
- 1,4 µM Hydrocortison<br />
- 1 ng/ml basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)<br />
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach WEKSLER et al. (2005).<br />
Für die Verwendung in Transport-Assays, für die dichte Monolayer der Zellen<br />
eine Notwendigkeit darstellen, wurden vergleichende Untersuchungen mit Seren<br />
unterschiedlicher Herkunft durchgeführt. Dazu wurden ein nicht-standardisiertes und<br />
ein standardisiertes fetales Kälberserum sowie humanes Serum zur Kultivierung der<br />
Zellen auf den Inserts verwendet. Unter den im Folgenden beschriebenen<br />
Bedingungen für die Transportversuche wurden allerdings keine Unterschiede<br />
festgestellt, sodass die hCMEC/D3-Zellen für Transportstudien mit nichtstandardisiertem<br />
Serum bovinen Ursprungs kultiviert wurden. Welches Serum für die<br />
einzelnen Versuche, die im Abschnitt Ergebnisse dargestellt sind, verwendet wurde,<br />
ist angegeben.<br />
4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT<br />
Diese immortalisierten Zellen stammen von einer gut charakterisierten<br />
Endothelzelllinie (GP8) aus Rattenhirn (GREENWOOD et al. 1996). Diese wurden<br />
mit einem Puromycin-Resistenzgen-enthaltenden Plasmid transfiziert und nach GP8<br />
und der Firma NeuroTech S:A: benannt. Das Zytostatikum Puromycin diente bei<br />
dieser Zelllinie der Selektion Pgp-exprimierender Zellen. Zudem führt es zu einer<br />
verstärkten Pgp-Expression (DEMEUSE et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit<br />
41
MATERIAL UND METHODEN<br />
wurde Puromycin abgesehen von der Behandlung lediglich über die ersten zwei<br />
Passagen dem Medium zugefügt.<br />
RÉGINA et al. (1999) wiesen für diese Endothelzelllinie nach, dass sie<br />
morphologische Kriterien und Eigenschaften der BHS zeigt. Dies und die<br />
Überexpression der Multidrug-Transporter waren bei der Auswahl dieser Zelllinie<br />
ausschlaggebend.<br />
Das zur Kultivierung der GPNT-Zellen verwendete Medium bestand aus:<br />
- MEM + GlutaMAX-I/Ham‘s F-10 + GlutaMAX-I im Verhältnis 1:1<br />
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert; 30 min bei 56 °C<br />
hitzeinaktiviert)<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
- 1 ng/ml bFGF<br />
- 5 µg/ml Puromycin<br />
Das Zytostatikum Puromycin wurde lediglich über die ersten Passagen nach<br />
Auftauen als Mediumszusatz verabreicht und anschließend abgesetzt.<br />
Die Zusammensetzung des Medium wurde mit Modifikationen RÉGINA et al.<br />
(1999) nachempfunden.<br />
4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4<br />
RBE4-Zellen (Rat Brain Endothelial cells) wurden ebenso wie GPNT-Zellen<br />
aus Rattenhirnendothel gewonnen, allerdings handelt es sich hierbei um eine andere<br />
Endothelzelllinie. Diese wurde durch die Transfektion mit einem E1A-Adenovirusenthaltenden<br />
Plasmid immortalisiert (ROUX et al. 1994) und zeigte den Phänotyp<br />
von Endothelien. RBE4-Zellen stellen eine etablierte Zelllinie dar und werden als ein<br />
In-vitro-Modell der BHS verwendet (ROUX et al. 1994). Des Weiteren weisen diese<br />
Zellen Eigenschaften auf, die auch von Hirnendothelien in vivo gezeigt werden<br />
(ROUX & COURAUD 2005; ASCHNER et al. 2006). Die Zellen zeigen ähnliche<br />
Charakteristika wie Primärzellkulturen, z.B. die Expression spezifischer Endothel-<br />
Marker (z.B. Alkalische Phosphatase ALP). Zudem konnte die Expression des<br />
Glukose-Transporters GLUT1 und der Effluxpumpe Pgp für RBE4-Zellen<br />
nachgewiesen werden (BEGLEY et al. 1996; RÉGINA et al. 1998). Beide Transporter<br />
kommen in der BHS vor.<br />
Die RBE4-Zellen wurden in folgendem Medium kultiviert:<br />
- MEM + GlutaMAX-I/Ham’s F-10 + GlutaMAX-I (1:1)<br />
42
MATERIAL UND METHODEN<br />
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht standardisiert; 30 min bei 56 °C<br />
hitzeinaktiviert)<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
- 1 % (v/v) L-Glutamin (200 mM)<br />
- 1 ng/ml bFGF<br />
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach BEGLEY et al. (1996).<br />
Sowohl GPNT- als auch RBE4-Zellen weisen typische Marker der BHS auf.<br />
Aufgrund fehlender oder nur in geringen Maß ausgeprägter parazellulärer<br />
Begrenzungen sind transendotheliale Permeabilitätsversuche und Transport-Assays<br />
nicht möglich (ROUX & COURAUD 2005). GPNT- und RBE4-Zellen können aber für<br />
Kumulations-Assays eingesetzt werden, die die Funktionalität zu untersuchender<br />
Transporter wiedergeben.<br />
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte<br />
Da immortalisierte Zellen Veränderungen im Vergleich zum Ursprungsgewebe<br />
aufweisen können, und diese sich auch auf die Ausbildung der Tight junctions und<br />
somit die Barriere-Eigenschaften auswirken können, werden seit langem<br />
Primärkulturen der Hirnkapillarendothelien verschiedener Spezies als In-vitro-<br />
Modelle der BHS verwendet (FRANKE et al. 2000). Es ist bekannt, dass Astrozyten<br />
durch die Induktion von Tight-junction-Proteinen zu einem dichten Zellmonolayer<br />
beitragen (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003; HATHERELL et al. 2011).<br />
Deshalb wurden Studien zu Kokulturen von Endothelzellen und Astrozyten<br />
durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Primärkulturen des Hirnkapillarendothels,<br />
welche im Weiteren rBCEC (rat Brain Capillary Endothelial Cells) genannt werden,<br />
und der Astrozyten der Ratte eingesetzt.<br />
4.1.4.1 Tierhaltung<br />
Es wurden zwei verschiedene Rattenstämme, CD ® -IGS- und Wistar-Ratten im<br />
Tierstall des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der<br />
<strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> gezüchtet. Die Tiere wurden nach<br />
Geschlechtern getrennt in verschiedenen Käfigen aber im gleichen Tierraum<br />
gehalten. Die initialen Zuchttiere wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland)<br />
bezogen. CD ® -IGS-Ratten entsprechen dabei Sprague-Dawley-Ratten. Bei beiden<br />
43
MATERIAL UND METHODEN<br />
verwendeten Rattenstämmen handelte es sich um Auszuchtstämme. Die für die<br />
Präparation benötigten Tiere (Versuchstiere) stammten aus zwei Generationen der<br />
institutseigenen Zucht. Wasser und Futter in Form von Pellets (Altromin 1324<br />
Standarddiät, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) standen den Tieren ad libitum zur<br />
Verfügung. Einmal wöchentlich wurden die Tiere in neue Käfige mit frischem Einstreu<br />
umgesetzt. Die Auswechslung des Futters und Wassers erfolgte einmal bzw.<br />
zweimal pro Woche. Die Tiere wurden bei einer Lufttemperatur von 20-24 °C und<br />
einer Luftfeuchtigkeit von 50–60 % gehalten. Zwischen 06:00 Uhr und 18:00 Uhr<br />
waren die Tiere einer 12-stündigen Hellphase mit einer Leuchtstärke von 19–30 Lux<br />
in den Makrolonkäfigen ausgesetzt. Es wurden maximal zwei Generationen der<br />
Ratten gezüchtet.<br />
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels<br />
Für die Präparation des Endothelgewebes wurden 2–3 Wochen alte Ratten<br />
verwendet. Die Präparation erfolgte mit leichten Modifikationen nach Protokollen von<br />
RÉGINA et al. (1999) und PERRIÈRE et al. (2005). Pro Präparation wurden<br />
abhängig von Wurfgröße und benötigter Zellzahl 5–16 Tiere nach CO 2 -Narkose<br />
dekapitiert. Die Köpfe wurden kurz in 70 %igen Ethanol getaucht und bis zur<br />
weiteren Aufarbeitung auf Eis gehalten. Alle nun folgenden Schritte fanden unter der<br />
Sterilwerkbank statt. Die Schädel wurden eröffnet. Die Gehirne wurden<br />
herauspräpariert und in eiskalter PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin auf Eis<br />
gesammelt. Das Stammhirn, der Plexus und das Kleinhirn wurden abgetrennt und<br />
die Meningen mittels Pinzette, Filterpapier und Wattestäbchen entfernt. Die Cortices<br />
wurden in eine neue Petrischale mit frischer PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin<br />
überführt. Anschließend wurde die Lösung abgesaugt und die Cortices mit Skalpellen<br />
zu einer homogenen Masse zerkIeinert und für 1,5 h in einem 37 °C warmen<br />
Wasserbad mit 15 ml einer Enzymlösung (DMEM/F-12, Dispase II, DNAse I,<br />
Collagenase II und Penicillin/Streptomycin (Volumina und Konzentrationen siehe<br />
Anhang S. 210) inkubiert. Das Gemisch wurde während der Inkubation mehrere Male<br />
geschwenkt, um einen gleichmäßigen Verdau des Gewebes zu gewährleisten. Zum<br />
Stoppen der Reaktion wurde der Verdau nach der Inkubationszeit mit 20 ml einer<br />
20 % (w/v) Lösung von Bovinem Serumalbumin (BSA) versetzt, auf zwei 50 ml-<br />
Röhrchen verteilt und für 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand,<br />
der u.a. Myelin enthält, wurde dekantiert, die verbliebenen Pellets erneut mit der<br />
44
MATERIAL UND METHODEN<br />
Enzymlösung (5 ml) versetzt, in einem Falcon-Röhrchen gesammelt und 1 h im<br />
Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Einige Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit<br />
wurde eine Nylonmembran (Porendurchmesser = 80 µm) 3x mit je 5 ml DMEM/F-12<br />
Medium gespült. Der Verdau wurde anschließend durch das Nylongewebe filtriert<br />
und die zurückgehaltenen Kapillarzellen 3x vorsichtig mit DMEM/F-12 Medium<br />
gewaschen. Die Zellen wurden dann mit Medium vom Filter gespült und auf 2-3<br />
kleine Zellkulturschalen (A = 28 cm 2 ) à 5 ml verteilt. Anschließend wurde der<br />
Zellsuspension Puromycin in der Konzentration von 4 µg/ml zugefügt und die Zellen<br />
im Brutschrank kultiviert.<br />
Die Zusammensetzung des Mediums wurde Zhang et al. (2006) entnommen.<br />
- EBM-2 Medium<br />
- 20 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
- 1 mM HEPES<br />
- 1 % (v/v) L-Glutamin (Stocklösung: 200 mM)<br />
- 500 ng/ml Hydrocortison.<br />
In diesem Medium wurden die Zellen über die ersten drei Tage kultiviert. Nach<br />
drei Tagen wurden die Zellen mit PBS gespült und im gleichen Medium mit dem<br />
Zusatz von 2 ng/ml bFGF bis zum Erreichen der Konfluenz und der Aussaat für<br />
Transport- und Kumulationsstudien weiter kultiviert.<br />
4.1.4.3 Präparation der Astrozyten<br />
Die Präparation primärer Astrozyten erfolgte mit Modifikationen nach Zhang et<br />
al. 2006. Die Astrozyten wurden aus neonatalen Ratten (P0–P3) gewonnen. Nach<br />
der CO 2 -Narkose der Tiere wurden diese dekapitiert. Die Köpfe wurden mit 70 %igen<br />
Ethanol weitestgehend desinfiziert und anschließend auf Eis gehalten. Die folgenden<br />
Arbeitsschritte fanden unter der Sterilbank statt.<br />
Die Schädel wurden eröffnet. Die Gehirne wurden herauspräpariert,<br />
Stammhirn und Kleinhirn entfernt und in eiskalter PBS + 2 % Penicillin/Streptomycin<br />
auf Eis gesammelt. Anschließend wurden die Meningen und der Hippocampus<br />
entfernt. Die Cortices wurden in ein 15 ml-Röhrchen mit frischer PBS + 2 %<br />
Penicillin/Streptomycin überführt und weiter auf Eis gelagert. Der Puffer wurde<br />
abgesaugt und die Cortices in 10 ml der Dissoziationslösung (DMEM Low Glucose,<br />
10x Trypsin/EDTA-Lösung, HEPES, DNAse I und Penicillin/Streptomycin; Volumina<br />
45
MATERIAL UND METHODEN<br />
und Konzentrationen siehe Anhang S. 212) aufgenommen und mit einer 10 ml-<br />
Pipette homogenisiert. Das Gemisch wurde in einem 37 °C warmen Wasserbad für<br />
30 min inkubiert und dabei regelmäßig geschwenkt. Der Verdau wurde im Folgenden<br />
sorgfältig mit einer 10 ml-Pipette dissoziiert und bei 400xg für 5 min zentrifugiert. Der<br />
Überstand wurde dekantiert, das Pellet in 10 ml des Astrozyten-Kulturmediums<br />
resuspendiert und erneut für 5 min bei 200xg zentrifugiert. Der Überstand wurde<br />
abgesaugt und das Pellet in 1 ml/Gehirn aufgenommen. Die Zellsuspension wurde<br />
zunächst durch ein Nylon-Gewebesieb mit 70 µm filtriert, anschließend erfolgte die<br />
Filtration durch ein feinmaschigeres Sieb (Porendurchmesser 40 µm). Das Filtrat<br />
wurde auf 25 cm 2 -Zellkulturflaschen verteilt (3–4 Gehirne/Flasche) und im<br />
Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag erfolgte die mikroskopische Kontrolle. Wenn<br />
die Astrozyten nahezu konfluent (konfluent = vollständige Bedeckung der<br />
Plattenoberfläche mit Zellen) waren, wurden diese zur Entfernung der<br />
Oligodendrozyten und Mikroglia für einige Stunden bzw. über Nacht bei bis zu 250<br />
Umdrehungen/min im Brutschrank geschüttelt.<br />
Die Astrozyten wurden in nachstehendem Medium kultiviert:<br />
- DMEM Low Glucose<br />
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)<br />
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
Nach drei Tagen wurden die Zellen mit PBS gespült und im gleichen Medium mit<br />
dem Zusatz von 2 ng/ml bFGF bis zum Erreichen der Konfluenz und der Aussaat für<br />
Transport- und Kumulationsstudien weiter kultiviert.<br />
4.2 Kultivierung der Zellen<br />
Sämtliche Arbeitsschritte, welche das Öffnen von Medium- und<br />
Zellkulturgefäßen erforderten, wurden zur Vermeidung von Kontaminationen unter<br />
einer Sterilwerkbank vorgenommen. Des Weiteren wurden alle verwendeten<br />
Chemikalien, Puffer und Lösungen sterilfiltriert oder autoklaviert. Alle Gefäße und<br />
Verbrauchsmaterialien wurden vor der Verwendung unter der Sterilbank mit 70 %<br />
Ethanol desinfiziert.<br />
Die Kultur aller verwendeten Zellen erfolgte in einem CO 2 -Brutschrank bei<br />
einer Temperatur von 37 °C, einer relativen Luftfeuchte von 95 % und einem CO 2 -<br />
Gehalt von 5 %. Sofern Probenentnahmen für den Western Blot erfolgten (siehe<br />
Abschnitt 4.4), wurden die Zellen nach Erreichen der Konfluenz für weitere 5–8 Tage<br />
46
MATERIAL UND METHODEN<br />
in Kultur gehalten, geerntet und bis zur Aufarbeitung im Western Blot bei -20 °C<br />
gelagert.<br />
Für Kumulations- und Transportuntersuchungen wurden die Zellen nach dem<br />
Auftauen maximal 15-mal passagiert. Die immortalisierten Zellen wurden jedoch<br />
frühestens ab der dritten Passage für den Versuch ausgesät. Die Primärzellen<br />
wurden maximal zweimal passagiert bevor sie für Untersuchungen eingesetzt<br />
wurden. Eine Übersicht der der Testsubstanzen und eingesetzten Inhibitoren kann<br />
Tabelle 4.1 (siehe S. 49 f.) entnommen werden.<br />
4.2.1 Passagierung<br />
Der Wechsel des Kulturmediums wurde alle 2-3 Tage vorgenommen. Dies<br />
geschah als bloßer Austausch des Mediums oder nach Erreichen von 80-90 %iger<br />
Konfluenz der Monolayer im Rahmen einer Zellpassagierung.<br />
Hierfür wurde nach Absaugen des Kulturmediums sterile PBS auf die Zellen<br />
gegeben, für ca. 10 min im Brutschrank inkubiert, der Puffer wieder entfernt und 2-3<br />
ml einer 1:5 mit PBS verdünnten Trypsin/EDTA-Lösung (Endkonzentration: 0,1 %<br />
Trypsin, 0,04 % EDTA) auf die Zellen pipettiert und wiederum bis zu 10 min im<br />
Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgten die Aufnahme der sich nun sichtbar<br />
ablösenden Zellen in frischem Medium in einem Falcon-Röhrchen und die 5-minütige<br />
Zentrifugation bei 800xg. Nach Absaugen des Überstands wurde das Zellpellet in<br />
frischem Medium resuspendiert und die Zellsuspension auf neue Kulturgefäße<br />
gegeben. Die Verdünnung der Zellsuspension in Medium erfolgte abhängig von der<br />
Zelllinie im Verhältnis 1:10 bis 1:80. Bis zur nächsten Passage der Zellen erfolgte alle<br />
2-3 Tage ein Mediumswechsel.<br />
Bei allen verwendeten immortalisierten Zelllinien handelt es sich um adhärente<br />
Zellen. Für die Anheftung benötigten alle Zellen vor der Aussaat eine Beschichtung<br />
der Zellkulturgefäße mit Collagen Typ I. Dazu wurde das pulverförmige Collagen<br />
zunächst in steriler 0,2 %iger Essigsäure gelöst, um eine Stocklösung mit einer<br />
Konzentration von 2 mg/ml zu erhalten. Anschließend wurde die Lösung 1:20 (v/v) in<br />
sterilem PBS verdünnt. Die Collagenlösung wurde auf die Schalen pipettiert, für eine<br />
Stunde im Brutschrank inkubiert, wieder abgenommen und unter der Sterilbank<br />
getrocknet. Die Kultivierung der Astrozyten erfolgte auf ebenfalls mit Collagen I<br />
beschichteten Zellkulturgefäßen.<br />
47
MATERIAL UND METHODEN<br />
Die Primärhirnendothelzellen benötigten ebenfalls eine Beschichtung, um sich<br />
an den Zellkulturgefäßen anheften zu können. Collagen Typ IV wurde dazu in A.<br />
bidest. gelöst, sodass eine Stocklösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml<br />
entstand. Diese wurde in 1:10 in A. bidest. verdünnt und auf die Zellkulturschalen<br />
gegeben. Diese wurden 1 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das<br />
Collagen abgenommen und die Schalen wurden unter der Sterilbank getrocknet. Für<br />
Transportstudien mit den primären Zellen wurden die Transwell-Inserts vor der<br />
Aussaat der Zellen mit einem Gemisch aus Collagen Typ IV und Fibronectin (1:2)<br />
beschichtet. Dies erfolgte für 2 h bei 37 °C. Das Gemisch wurde anschließend von<br />
den Transwell-Inserts abgesaugt und diese unter der Sterilwerkbank getrocknet.<br />
4.2.2 Kryokonservierung<br />
Zum Einfrieren wurden die Zellen nach Abtrypsinierung und Zentrifugation<br />
(s.o.) in fetalem Kälberserum, welches mit 10 % DMSO versetzt wurde,<br />
aufgenommen und resuspendiert. Die Zellen einer 78 cm 2 großen Petrischale<br />
wurden dazu in etwa 5 ml Einfriermedium aufgenommen und auf 5 Kryoröhrchen (à 1<br />
ml) verteilt. Anschließend wurden die Röhrchen in einem vorgekühlten Behältnis über<br />
Nacht bei -80 °C gelagert, um am nächsten Tag in einen Flüssigstickstoffbehälter (-<br />
196 °C) für die permanente Lagerung überführt zu werden.<br />
4.2.3 Auftauen der Zellen<br />
Die Kryoröhrchen wurden zu diesem Zweck kurz in einem 37 °C warmen<br />
Wasserbad geschwenkt. Der flüssige Inhalt wurde in ein 15 ml-Röhrchen überführt<br />
und nach Zugabe von 5 ml warmen Medium bei 800xg zentrifugiert. Das Medium<br />
wurde anschließend abgesaugt, die Zellen in 5 ml frischem Medium aufgenommen<br />
und in einer kleinen Petrischale (A = 28 cm 2 ) kultiviert.<br />
4.3 Untersuchung der Funktionalität<br />
Zur Untersuchung der Funktionalität des Multidrug-Transporters Pgp wurden<br />
in der vorliegenden Arbeit zwei Methoden angewendet: der Kumulations-Assay und<br />
der Transport-Assay.<br />
Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über alle verwendeten Substanzen in den<br />
funktionalen Assays, wobei der mögliche Einfluss auf Pgp aufgezeigt wird.<br />
48
MATERIAL UND METHODEN<br />
Tabelle 4.1: Übersicht über verwendete Substanzen zur Behandlung der Zellen für<br />
Kumulations-Assays und der Untersuchung in Transportversuchen.<br />
Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet<br />
Einfluss<br />
auf Pgp<br />
Digoxin K, T DMSO/Opti-<br />
MEM ® 10 nM Glykosid Substrat<br />
Rhodamin123 K, T Ethanol<br />
2 µM<br />
5 µM Fluoreszenzfarbstoff Substrat<br />
10 µM<br />
Verapamil K, T Ethanol/Opti-<br />
MEM ® 10 nM Calciumantagonist Substrat<br />
Dexamethason K A. bidest.<br />
0,5 µM<br />
1 µM<br />
5 µM<br />
Glukokortikoid Induktor<br />
10 µM<br />
Doxorubicin K PBS<br />
0,23 µM<br />
0,46 µM Zytostatikum Induktor<br />
0,92 µM<br />
Glutamat K Medium 100 µM<br />
Erregender<br />
Neurotransmitter<br />
Induktor<br />
Puromycin K Medium<br />
0,5 µM<br />
1 µM<br />
2,65 µM Zytostatikum Induktor<br />
5,3 µM<br />
10,6 µM<br />
Rifampicin K<br />
2,5 µM<br />
A. bidest.<br />
5 µM<br />
(mit NaOH auf<br />
10 µM<br />
pH 12<br />
20 µM<br />
eingestellt)<br />
50 µM<br />
Zytostatikum Induktor<br />
Vincristin K A. bidest.<br />
20 nM<br />
40 nM<br />
Zytostatikum Induktor<br />
49
MATERIAL UND METHODEN<br />
Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet<br />
Einfluss<br />
auf Pgp<br />
Carbamazepin K Ethanol<br />
10 µM<br />
30 µM<br />
50 µM<br />
Antiepileptikum ?<br />
100 µM<br />
Levetiracetam K A. bidest.<br />
100 µM<br />
300 µM<br />
Antiepileptikum Substrat<br />
Phenobarbital K Medium<br />
100 µM<br />
300 µM<br />
Antiepileptikum Substrat<br />
Phenytoin K Ethanol<br />
10 µM<br />
30 µM<br />
50 µM<br />
Antiepileptikum Substrat<br />
100 µM<br />
Topiramat K A. bidest.<br />
30 µM<br />
100 µM Antiepileptikum Substrat<br />
300 µM<br />
Valproat K A. bidest.<br />
50 µM<br />
100 µM Antiepileptikum ?<br />
300 µM<br />
Tariquidar K, T DMSO 0,5 µM Inhibitor Inhibitor<br />
Valspodar Ethanol/Tween<br />
(PSC833) T 80 (9:1)<br />
10 µM Inhibitor Inhibitor<br />
K<br />
T<br />
Substanzen, die im Kumulations-Assay eingesetzt wurden<br />
Substanzen, die im Transport-Assay eingesetzt wurden<br />
Die Substrate Digoxin und Rhodamin 123, die Pgp-Induktoren Dexamethason,<br />
Puromycin und Rifampicin und die Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und<br />
Valproat wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim bezogen, das radioaktiv markierte<br />
Digoxin von Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim, Valspodar von Novartis<br />
Pharma (Nürnberg), Doxorubicin von ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach, Phenobarbital<br />
von Serva, Heidelberg. Tariquidar wurde freundlicherweise von Xenova Ltd.<br />
(Berkshire, UK), Levetiracetam von UCB Pharma (Brüssel, Belgien) und Topiramat<br />
vom R. W. Johnson Research Institute (Pennsylvania, USA) zur Verfügung gestellt.<br />
50
MATERIAL UND METHODEN<br />
Radioaktiv markiertes 3 H-Digoxin wurde mit unmarkiertem Digoxin, welches<br />
zuvor in DMSO gelöst wurde, gemischt und in serumfreiem Medium (Opti-MEM ® )<br />
aufgenommen. Die Endkonzentration betrug 0,1 % DMSO. Verapamil wurde<br />
ebenfalls mit unmarkiertem Verapamil gemischt. Dieses wurde vorher in Ethanol<br />
gelöst und in Opti-MEM ® aufgenommen. Die Endkonzentration des Ethanols betrug <<br />
0,1 %. Sofern Ethanol als Lösungsmittel für einige Antiepileptika eingesetzt wurde,<br />
betrug die Endkonzentration ≤ 0,5 %.<br />
4.3.1 Kumulations-Assay<br />
Der Kumulations-Assay, auch Uptake-Assay genannt, diente in dieser Arbeit<br />
der Überprüfung der Funktionalität von Pgp. Das Prinzip dieser Methode besteht in<br />
der Messung bestimmter markierter Substrate in den Zellen. Bei diesen Stoffen, die<br />
Substrate für Pgp sind, kann es sich um Fluoreszenzfarbstoffe oder auch um<br />
radioaktiv markierte Substrate handeln. Man macht sich hier Fähigkeit des Pgps<br />
zunutze, Substanzen aktiv aus den Zellen zu pumpen. Aus diesem Grund kann<br />
immer nur eine gewisse Menge Substrat von den Zellen aufgenommen werden.<br />
Aussaat der Zellen<br />
Die Zellen wurden für alle Kumulationsversuche so ausgesät, dass sich nach<br />
2-3 Tagen konfluente Monolayer gebildet haben. Die Ablösung der Zellen erfolgte<br />
wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben. Die Kultivierung der Zellen für Kumulations-<br />
Assays erfolgte auf 6Well-Platten mit einem Volumen von 3ml/Well. In zwei<br />
Kumulationsversuchen erfolgte die Aussaat der rBCEC-Zellen auf 12Well-Platten mit<br />
einem Volumen von 1,5 ml Zellsuspension pro Well.<br />
Substanzbehandlung der Zellen<br />
Die Behandlung der Zellen begann am 3. Tag der Konfluenz. Bei jedem<br />
Behandlungszyklus wurden neben den zu testenden Antiepileptika immer eine<br />
Kontrollgruppe und bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren mitgeführt, um<br />
Aussagen zur Sensitivität des Assays machen zu können. Dazu wurden zu Beginn<br />
dieser Versuche verschiedene Induktoren für Pgp in den einzelnen Zelllinien<br />
ausgetestet und die Substanz, die eine reproduzierbare Induktion der Pgp-<br />
Funktionalität erzielte, für weitere Versuche verwendet. Angaben zu den<br />
verwendeten Substanzen und Konzentrationen sind Tabelle 4.1 zu entnehmen.<br />
51
MATERIAL UND METHODEN<br />
Die Dauer der Behandlung betrug 3 Tage. Dabei wurde täglich immer zum<br />
gleichen Zeitpunkt das Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem Medium,<br />
welches die für die jeweilige Behandlungsgruppe bestimmte Substanz enthielt,<br />
versorgt. Die Kontrollgruppen wurden stets nur mit Medium ohne weitere Zusätze<br />
behandelt. Ausnahmen bildeten Versuche, bei denen im Kontrollmedium die Vehikel<br />
(z.B. Ethanol) der zu testenden Antiepileptika oder auch Induktoren mitgeführt<br />
wurden. Wenn zwischen den Kontrollen keine Unterschiede nachweisbar waren,<br />
wurden diese Kontrollgruppen in der Statistik zusammen ausgewertet. DMSO wurde<br />
als Lösungsmittel für die einzelnen Substanzen vermieden, da es ab einem längeren<br />
Behandlungszeitraum induzierend auf die Pgp-Expression wirkt (AMBROZIAK et al.<br />
2010).<br />
Durchführung des Kumulations-Assays<br />
Im Anschluss an die Behandlungsdauer der Zellen (i.d.R. 6 Tage nach<br />
Erreichen der Konfluenz) und nach mikroskopischer Kontrolle der Zellen wurden<br />
diese für den Kumulationsversuch auf ein serumfreies Medium umgestellt (Opti-<br />
MEM ® ), um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verhindern. Dazu<br />
wurde das Behandlungsmedium entfernt und die Zellen für eine Stunde mit Opti-<br />
MEM ® mit und ohne den spezifischen Pgp-Inhibitor Tariquidar (0,5 µM) auf einem<br />
Schüttler inkubiert. Tariquidar sollte in Zellen, die funktionelles Pgp exprimieren, zur<br />
Inhibition dieses Transporters und somit zu einem erhöhten Gehalt des eingesetzten<br />
Substrats in den Zellen führen.<br />
Nach Ablauf dieser Vorinkubation wurde das Medium abgesaugt und durch<br />
Medium mit dem Pgp-Substrat ( 3 H-Digoxin oder Rhodamin 123) ersetzt und für<br />
weitere 2 Stunden inkubiert. In dieser Zeit konnte das Substrat in Abhängigkeit von<br />
der Pgp-Funktionalität unter Behandlung in die Zellen gelangen und dort verbleiben.<br />
Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde der Versuch durch Absaugen des<br />
Mediums und Waschen mit eiskaltem PBS zügig abgestoppt. Die Zellen wurden<br />
dann von den Wells geschabt, mit Lysispuffer (Zusammensetzung siehe Anhang S.<br />
213) aufgeschlossen und nach Zentrifugation der Messung zugeführt. Abhängig vom<br />
Substrat wurde der Zellinhalt mit einem Szintillationszähler (Liquid Scintillator System<br />
LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) oder Fluoreszenzmessgerät (BMG<br />
Labtech GmbH, Offenburg) gemessen.<br />
52
MATERIAL UND METHODEN<br />
Bestimmung der Proteinkonzentration<br />
Der Proteingehalt der Zellen wurde mit Hilfe des Bicinchonsäure-Assays<br />
(Bicinchonicic Acid BCA, Thermo Scientific, Rockford, USA) ermittelt. Dieser beruht<br />
ähnlich wie der Bradford-Assay auf der kolorimetrischen und quantitativen Messung<br />
der Proteinmenge. Dazu wird sich ebenfalls die Biuret-Reaktion zunutze gemacht,<br />
die auf der Reduktion von Kupfer-Ionen in alkalischer Lösung beruht (Cu 2+ Cu + ).<br />
BCA ist ein Chelatbildner. Bei der Bindung von zwei BCA-Molekülen um ein Cu + -Ion<br />
kommt es zu einer Violettfärbung. Dies ist ein wasserlöslicher Komplex, der die<br />
stärkste Absorption bei 562 nm aufweist.<br />
Als Standard für die Ermittlung der Proteinkonzentration der Proben wurde<br />
BSA verwendet. Aus verschiedenen Konzentrationen an BSA-Lösungen wurde eine<br />
Eichkurve erstellt. Standardmäßig wurden alle Proben einmal unverdünnt und 1:2<br />
verdünnt mit einem Volumen von 10 µl auf eine 96Well-Platte aufgetragen. Die<br />
Reaktionslösung aus Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung wurde auf jede<br />
Standardkonzentration und jede Probe aufgetragen (à 200 µl) und für 30 min bei<br />
37 °C dunkel inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte.<br />
Nach Ermittlung der Eichkurve wurden die Konzentrationen der Proben anhand der<br />
Kurve berechnet und in mg/ml angegeben.<br />
Berechnung des Substratgehalts der Proben<br />
Nach der Berechnung der Proteinkonzentration wurde der Substratgehalt auf<br />
diese bezogen. Der Zellinhalt wurde analysiert und die erhaltenen Werte für das<br />
Substrat 3 H-Digoxin als DPM/mg Protein (decays per minute; Zerfallsrate, bezogen<br />
auf den Proteingehalt) und für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als<br />
Fluoreszenz/mg Protein angegeben.<br />
4.3.2 Transport-Assay<br />
Aussaat der Zellen<br />
Die Zellen wurden für Transportversuche auf Polyester- oder Polycarbonat-<br />
Membranen der Hersteller Corning Costar Corporation (Transwell ® ) und Greiner Bio-<br />
One GmbH (ThinCerts ® ) kultiviert. Eine Übersicht einzelner Parameter wie<br />
Porengröße und dergleichen sind der Tabelle 4.2 zu entnehmen. Die Membran-<br />
Inserts der Multiwell-Platten unterteilen die Zellkulturschalen in eine apikale und eine<br />
basolaterale Kammer (siehe Abschnitt 2.8.2, Abbildung 2.5, S. 33) und erlauben so<br />
53
MATERIAL UND METHODEN<br />
die Quantifizierung und den Vergleich der Substratkonzentrationen in beiden<br />
Kammern und lassen Rückschlüsse auf den Transport einer Substanz zu.<br />
Tabelle 4.2: Übersicht zu den Parametern verwendeter Membraneinsätze für die<br />
Transportstudien.<br />
Material<br />
Polyester<br />
Polycarbonat<br />
Polyester<br />
Format<br />
Membrangrößtumsflächdichtkeit<br />
der<br />
Wachs-<br />
Poren-<br />
Sichtbar-<br />
PorenØ<br />
(µm)<br />
(mm) (cm 2 )<br />
(pro cm 2 ) Zellen<br />
Transwell ®<br />
(Corning Costar Corporation)<br />
6Well 24 4,67 0,4 4x10 6 Sichtbar<br />
12Well 12 1,12 0,4 4x10 6 Sichtbar<br />
Schlecht<br />
6Well 24 4,67 0,4 1x10 8 sichtbar<br />
Schlecht<br />
12Well 12 1,12 0,4 1x10 8 sichtbar<br />
ThinCerts ®<br />
(Greiner Bio-One)<br />
Nicht<br />
6Well 24,85 4,254 0,4 1x10 8 sichtbar<br />
12Well 13,85 1,132 0,4 2x10 6 Sichtbar<br />
Die Inserts wurden mindestens eine Stunde vor Aussaat der Zellen mit dem<br />
jeweiligen Medium im Brutschrank inkubiert. Dabei wurden für das 6Well-Format 1,5<br />
ml für die apikale und 2,5 ml Medium für die basolaterale Kammer verwendet. Inserts<br />
im 12Well-Format wurden mit 0,5 ml apikal und 1,5 ml basolateral befüllt. Während<br />
der gesamten Kultivierung wurden diese Volumina für die Inserts beibehalten. Die<br />
Ablösung der Zellen wurde wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben vorgenommen. Die<br />
Zellen wurden für die spätere Vergleichbarkeit vor der Aussaat ausgezählt. Die<br />
Zellzählung erfolgte mit Hilfe einer Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal. Diese weist<br />
eine Zählfläche von 16 mm 2 und eine Tiefe von 0,2 mm auf. Die Zählfläche besteht<br />
aus 16 Großquadraten, die sich jeweils aus 16 Kleinquadraten zusammensetzen. Es<br />
wurde pro Probe ein Volumen von 200 µl ausgezählt. Dazu wurde eine Probe der<br />
Zellsuspension 1:5 mit Medium und Trypanblau verdünnt, wobei stets 40 µl<br />
54
MATERIAL UND METHODEN<br />
Zellsuspension, 120 µl des jeweiligen Kulturmediums und 40 µl Trypanblau<br />
verwendet wurden. Trypanblau hat die Eigenschaft, tote Zellen aufgrund nicht mehr<br />
intakter Zellmembranen blau zu färben und macht es somit möglich, lebende und<br />
tote Zellen voneinander zu unterscheiden. Pro Probe wurden 6 Großquadrate (vier<br />
diagonale und 2 an den gegenüber liegenden Ecken) ausgezählt, dabei wurden<br />
ausschließlich vitale Zellen gezählt. Die Zellzahl/ml wurde mit nachfolgender<br />
Gleichung bestimmt:<br />
gezählte Zellzahl<br />
Zellzahl/ml = x Verdünnungsfaktor (5) x Kammerfaktor (5000)<br />
Anzahl ausgezählter Quadrate<br />
Die Aussaat der hCMEC/D3-Zellen erfolgte mit einer Zellzahl von 50.000<br />
Zellen/cm 2 in einem Volumen von 0,5 ml bzw. 1,5 ml (12Well- bzw. 6Well-Format).<br />
Bei den Primärzellen war die Anzahl der Wells und damit der Umfang des Versuchs<br />
von der Zahl der präparierten Tiere abhängig. Die Zellen, die aus fünf bis sechs<br />
Tieren gewonnen wurden, reichten für 18-24 12Well-Inserts. Die Volumina zur<br />
Aussaat waren die gleichen. Die Zellen bildeten i.d.R. 1–2 Tage nach der Aussaat<br />
konfluente Monolayer und wurden 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz für<br />
Transport-Assays eingesetzt.<br />
Am folgenden Tag wurde die Konfluenz der Zellmonolayer auf den<br />
transparenten Inserts beurteilt und die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen, wobei<br />
nicht angeheftete Zellen entfernt wurden. Alle 2-3 Tage fand ein Mediumswechsel<br />
statt. Um das Ablösen der Zellen durch den Druck der Flüssigkeiten zu vermeiden,<br />
wurde dazu zunächst das Medium der basolateralen Kammer abgesaugt,<br />
anschließend in der apikalen Kammer. Die Zugabe frischen Mediums erfolgte in<br />
derselben Reihenfolge.<br />
Für Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode<br />
wurden die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen auch mit Astrozyten der Ratte kokultiviert.<br />
Dazu wurden zunächst die Astrozyten für die Kontakt-Kokultur auf den Unterseiten<br />
der Membraneinlagen kultiviert. Nach Anheftung dieser Zellen wurden diese noch für<br />
2-3 Tage allein kultiviert. Anschließend erfolgte die Aussaat der<br />
Hirnkapillarendothelien auf der apikalen Seite der Membran. Die Endothelzellen und<br />
Astrozyten wurden mit ihrem jeweiligen Medium kultiviert, auch wenn durch die<br />
Membran eine Vermischung bzw. Verdünnung des jeweiligen Kulturmediums und<br />
55
MATERIAL UND METHODEN<br />
den darin enthaltenen Zusätzen stattfand. Deshalb wurden in einzelnen Versuchen<br />
beide Zelltypen mit dem Medium der jeweiligen Hirnkapillarendothelien kultiviert.<br />
Durchführung des bidirektionalen Transport-Assays<br />
Zur Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 und Digoxin in<br />
hCMEC/D3 und rBCEC wurden bidirektionale Transportstudien durchgeführt. Die<br />
Zellen wurden wie bereits im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ausgesät. Die<br />
Transport-Assays fanden 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz statt. Vor Beginn<br />
des Versuchs wurden die Monolayer mittels Mikroskop auf Unversehrtheit<br />
untersucht. Wie beim Kumulations-Assay erfolgte zunächst die Umstellung der Zellen<br />
auf das serumfreie Medium Opti-MEM ® und die einstündige Vorinkubation der Zellen<br />
mit und ohne Inhibitor bzw. mit und ohne Vehikel des Inhibitors auf dem Schüttler bei<br />
50 Umdrehungen/min. Das Versuchsmedium, das ebenfalls mit Opti-MEM ®<br />
angesetzt wurde, enthielt das entsprechende Substrat bzw. die Testsubstanz sowie<br />
den Inhibitor oder dessen Lösungsmittel. Andere Arbeitsgruppen verwendeten für<br />
ihre Transportstudien den Puffer HBSS, der HEPES (10 mM) und Natriumpyruvat (1<br />
mM) enthielt (CARL et al. 2010). Aus diesem Grund erfolgten weitere<br />
Untersuchungen mit diesem Versuchspuffer.<br />
Zum Ende der Vorinkubation wurde die Messung des transendothelialen<br />
Widerstands vorgenommen. Für Inserts im 6Well-Format erfolgte dies in einer<br />
entsprechend großen Messkammer, für das 12Well-Format mit einer Messpinzette.<br />
Die Messung mit der Pinzette wurde deshalb erforderlich, weil die Messkammer für<br />
das 6Well-Format ausgerichtet ist. Dabei wurde die Messung so durchgeführt, dass<br />
die Pinzette an drei verschiedenen Lokalisationen der Inserts zur basolateralen<br />
Kammer hin eingesetzt und der Mittelwert der drei Messwerte gebildet wurde. Der<br />
TEER wurde bestimmt, indem der Messwert mit der Wachstumsfläche (je nach<br />
Hersteller bzw. Format A=4,67/4,254 bzw. 1,12 cm 2 ) multipliziert und gegebenenfalls<br />
der Mittelwert gebildet wurde.<br />
Für die Inkubation mit der Testsubstanz waren die Volumina je nach Format<br />
apikal: 0,7 bzw. 2 ml und basolateral: 1,5 bzw. 2,7 ml Medium in den Kammern der<br />
12Well- und 6Well-Inserts. Zusätzlich zur TEER-Messung erfolgte die Untersuchung<br />
der Dichtigkeit mittels [ 14 C]-markiertem Mannitol in mindestens einem Insert pro<br />
Zelllinie und Versuchsansatz. Dies diente dazu, die parazelluläre Permeabilität eines<br />
Zellmonolayers zu beurteilen (LUNA-TORTÓS et al. 2008) und sollte einen<br />
56
MATERIAL UND METHODEN<br />
apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (P app ) für Mannitol von der<br />
basolateralen in die apikale Kammer (b-A) von 12 nm/s (nach LUNA-TORTÓS et al.<br />
2008) nicht überschreiten, wobei sich die Einheit aus dem Bezug zur<br />
Wachstumsfläche der Monolayer ergibt. In einigen Transportversuchen wurde die<br />
Permeabilität für Mannitol nicht über die gesamte Versuchsdauer untersucht. Die<br />
Zellen wurden stattdessen am Ende des Versuchs für 60 min mit Mannitol inkubiert.<br />
Anschließend wurde eine Probe entnommen. Eine Berechnung der Steigung ist aus<br />
diesem Grund nicht möglich, weshalb die Angabe für Mannitol dann in %/h erfolgte.<br />
Bei dieser Variante des Transport-Assays wird die Testsubstanz lediglich in<br />
eine der beiden Kammern appliziert. Wurden Inhibitoren mitgeführt, wurden diese in<br />
beide Kammern eingefüllt, dementsprechend wurde das gleiche Volumen des<br />
jeweiligen Lösungsmittels in die Kammern ohne Inhibitor gegeben. Die Entnahmen<br />
der Proben erfolgten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und sind in den Ergebnissen<br />
widergegeben. Die Versuchsdauer betrug aber für die meisten Transport-Assays<br />
entweder 240 oder 360 min, mindestens aber 120 min. Das Probenvolumen für das<br />
6Well-Format betrug immer 100 µl, wobei aus den jeweils kontralateralen Kammern<br />
Ausgleichsvolumina entnommen wurden (apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl). Auf diese<br />
Weise wurden die Flüssigkeitsstände der beiden Kammern gleichgehalten, um den<br />
Druck auf die Zellen zu vermindern. Mannitol hingegen wurde lediglich in die<br />
basolaterale Kammer gegeben, Proben wurden der apikalen Kammer entnommen.<br />
Wenn die Testsubstanzen fluoreszenz-markiert waren, wurde diese direkt zur<br />
Probenentnahme auf eine schwarze 96Well-Platte pipettiert. Handelte es sich um<br />
radioaktiv-markierte Substanzen wurden die Proben in 1,5 ml Eppendorf-Gefäße<br />
pipettiert und bis zur Vorbereitung für die Messung im Szintillationscounter (Liquid<br />
Scintillator System LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) bei +4 °C<br />
gelagert.<br />
Nach Entnahme der letzten Proben wurden die Monolayer erneut<br />
mikroskopisch untersucht und der TEER bestimmt. Sofern radioaktiv markierte<br />
Substanzen eingesetzt wurden, wurde das Medium in entsprechende Behältnisse<br />
umgefüllt und entsorgt.<br />
Die Darstellung der Substanz-Konzentrationen in beiden Kammern erfolgte in<br />
Prozent. Die initiale Konzentration entspricht dabei 100 %. Die Permeabilitäten (P app )<br />
von der basolateralen in die apikale Kammer (b-A) und umgekehrt (a-B) für die<br />
57
MATERIAL UND METHODEN<br />
getesteten Substanzen wurde nach ARTURSSON (1990) berechnet und in nm/s<br />
angegeben.<br />
Gleichung nach ARTURSSON:<br />
P app [nm/s]<br />
=<br />
dQr/dt<br />
A x C 0 x 60<br />
dQr/dt (DPM/min): Steigung der Konzentration über die Zeit in der beprobten Kammer<br />
A: die Wachstumsfläche der Monolayer<br />
C 0 : Initialkonzentration der Substanz zum Zeitpunkt t=0<br />
Der Quotient der Koeffizienten Papp (b-A) und Papp (a-B) entsprach der<br />
Transportratio (TR) einer Substanz. Man spricht von Transport, wenn TR > 1,5 ist.<br />
Ein spezifischer Inhibitor sollte eine deutliche Verminderung der TR im Vergleich zu<br />
den Zellen ohne Inhibitor zeigen.<br />
Durchführung des Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assays<br />
Mit den Pgp-Substraten Digoxin, Rhodamin 123 und Verapamil wurden<br />
ebenfalls Konzentrationsgleichgewichts-Assays (CETA) durchgeführt, um die<br />
Eignung der Zelllinie hCMEC/D3 und der primären rBCEC für Transportversuche<br />
festzustellen. Die Aussaat und Kultivierung erfolgte wie bereits beschrieben. Der<br />
CETA wurde 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Vorinkubation<br />
und Messung der TEER-Werte erfolgte genauso wie für den bidirektionalen<br />
Transport-Assay. Im Unterschied zum bidirektionalen Transport-Assay, wurden die<br />
Testsubstanzen in die apikale sowie in die basolaterale Kammer gegeben. Die<br />
Initialkonzentrationen der beiden Kammern waren gleich. Die Proben wurden<br />
zunächst der basolateralen Kammer entnommen (100 µl), anschließend der apikalen<br />
Kammer mit einem Volumen von 130 μl. Die Versuchsdauer betrug auch hier<br />
maximal 360 min. Abhängig von der Quantifizierungs-Methode des Substrats wurden<br />
die Proben entweder direkt auf schwarze 96Well-Platten pipettiert oder in 1,5 ml-<br />
Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bis zur Aufbereitung bei +4 °C gelagert.<br />
Die Daten wurden sowohl für die apikale als auch die basolaterale Kammer in<br />
Prozent der Initialkonzentration über die Zeit dargestellt (LUNA-TORTÓS et al.<br />
2008). Für die Bestimmung des Transports wurden die Mengen der Substanz in der<br />
apikalen mit der in der basolateralen Kammer verglichen. Es wurde von Transport<br />
58
MATERIAL UND METHODEN<br />
einer Substanz ausgegangen, wenn der Gehalt dieser in den beiden Kammern zu<br />
den einzelnen Zeitpunkten signifikant verschieden war.<br />
Für die Überprüfung des Transports wurden spezifische Inhibitoren eingesetzt,<br />
die den Transport hemmen sollten. Für die Beschreibung des Transports bzw. der<br />
Inhibition wurde die Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) des<br />
Konzentrationsanstiegs in der apikalen Kammer in Prozent gegen die Zeit über der<br />
Initialkonzentration berechnet. Die AUC des nachgewiesenen Transports wurde mit<br />
der AUC der Zellen mit spezifischem Inhibitor verglichen. Ein Transport wurde als<br />
spezifisch bewertet, wenn die AUC/h nach Zugabe des Inhibitors um > 50 %<br />
abnahm.<br />
4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot<br />
Diese Methode dient der Detektion einzelner Proteine aus einem<br />
Proteingemisch aus Zellen oder Geweben. Bei Western Blot-Analysen werden<br />
elektrophoretisch aufgetrennte Proteine aus dem Trenngel auf einen geeigneten<br />
Träger übertragen. Die Bindung der Proteine an eine Membran, i.d.R. Nitrocellulose<br />
oder Polyvinylidenfluorid (PVDF), erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen und<br />
Wasserstoffbrücken. Dabei bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung<br />
erhalten und einzelne Proteine können über das Prinzip der Antigen-Antikörper-<br />
Bindung detektiert werden. Mit Hilfe des Western Blots ist es möglich, Aussagen<br />
über die Expression gesuchter Proteine zu treffen.<br />
Mit dem Western Blot wurde die Expression von Pgp in den genannten<br />
Zelllinien und Primärkulturen nachgewiesen. Neben dem gesuchten Protein Pgp<br />
wurde in allen Proben die Expression von ß-Aktin bestimmt. Das Strukturprotein ß-<br />
Aktin gehört zu den häufigsten Proteinen und kommt in allen eukaryotischen Zellen<br />
vor. Das Protein ß-Aktin diente als Housekeeper für die Normierung der Pgp-<br />
Expression. Housekeeper sind Proteine, die an den grundlegenden Zellprozessen<br />
beteiligt sind und in gleichem Ausmaß in allen Zellen der Kultur exprimiert werden.<br />
So können Aussagen darüber getroffen werden, ob der Gesamtproteingehalt einer<br />
Probe oder allein der Pgp-Gehalt in den Zellen verändert ist.<br />
Für den Western Blot wurden 15-40 µg Proteinlysat pro Probe eingesetzt. Die<br />
Herstellung der Proteinlysate, die Vorbereitung der Proben sowie die weitere<br />
Beschreibung und Durchführung sind im Anhang (siehe S. 218 ff.) einzusehen.<br />
59
MATERIAL UND METHODEN<br />
4.5 Quantifizierung der Substanzen<br />
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader<br />
Bei der Substanz Rhodamin 123 handelt es sich um einen<br />
Fluoreszenzfarbstoff. Die Quantifizierung des Farbstoffs erfolgte mittels<br />
Fluoreszenzmessgerät und der OPTIMA Control Software (BMG Labtech GmbH,<br />
Offenburg). Die Proben der Zelllysate und des Mediums wurden mit einem Volumen<br />
von 50 bzw. 100 µl pipettiert und bis zur Messung abgedeckt bei RT gelagert. Die<br />
Messung erfolgte nach einer Anregung des Rhodamins 123 bei 485 nm und einer<br />
Emission bei 520 nm. Die Daten für die Kumulations-Assays wurden zusätzlich auf<br />
den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe Abschnitt 4.3.1).<br />
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter<br />
Die Substanzen Digoxin und Verapamil waren [ 3 H]-markiert, Mannitol [ 14 C]-<br />
markiert. Auf diese Weise konnten die Substanzen mittels der Messung des<br />
radioaktiven Zerfalls im β-Szintillations-Counter (Liquid Scintillator System LS 5000<br />
TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) quantifiziert werden. Dazu wurden 40 μl der<br />
Medium- oder Zelllysat-Proben der Kumulations- und Transport-Assays in<br />
Szintillationsröhrchen pipettiert und mit 4,5 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt. Die<br />
Proben wurden bis zur Messung etwa eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In<br />
Abhängigkeit vom radioaktiven Isotop erfolgte die Messung der Zerfallsraten mit dem<br />
entsprechenden Programm im β-Counter. Die Daten für die Kumulations-Assays<br />
wurden zusätzlich auf den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe<br />
Abschnitt 4.3.1).<br />
4.6 Auswertung der Daten und Statistik<br />
Sofern nicht anders angezeigt, wurden alle Einzelversuche mit einer<br />
Mindestgruppengröße von n=3 durchgeführt. Sämtliche Berechnungen der<br />
Substratkonzentrationen in den Zellen, der Transportraten und des Proteingehalts<br />
erfolgten mit dem Programm Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim).<br />
Die Daten der Kumulations-Assays sind für alle verwendeten Zelllinien neben<br />
bespielhaften Einzelversuchen auch in einer Zusammenfassung aller Versuche<br />
dargestellt. Die Ergebnisse der Einzelversuche wurden als DPM/mg Protein bzw. als<br />
Fluoreszenz/mg Protein angegeben. Für die zusammenfassende Gesamtdarstellung<br />
60
MATERIAL UND METHODEN<br />
wurden für alle Kontrollgruppen der einzelnen Versuche die Mittelwerte gebildet und<br />
in Prozent umgesetzt. Die Gruppen der behandelten Zellen wurden prozentual auf<br />
die jeweilige Kontrolle bezogen. Anschließend erfolgte die Zusammenfassung aller<br />
Versuche in eine Gesamtdarstellung und –auswertung. Die Einheit ist hierfür als<br />
Prozent (%) zur Kontrolle angegeben. Alle Daten der einzelnen Versuche und<br />
Gesamtdarstellungen sind als Mittelwerte + Standardfehler (SEM) dargestellt.<br />
Die Auswertung der Daten wurde mit dem Programm Prism5 ® (GraphPad<br />
Software Incorporation, San Diego, USA) durchgeführt. Alle Daten der Kumulations-<br />
Assays wurden mit dem Student’s t-Test oder der Varianzanalyse (One-way ANOVA)<br />
analysiert, gefolgt von dem Dunnett’s oder Bonferroni Posthoc-Test. Alle Vergleiche<br />
der Ergebnisse wurden zweiseitig und stets gegen die Kontrolle getestet. Die<br />
Ergebnisse für Tariquidar wurden immer mit dem Student’s t-Test statistisch<br />
ausgewertet, weil es sich hier mit der kürzeren Inkubationszeit von 3 h nicht um eine<br />
Behandlung im Sinne aller anderen Substanzen (72 h) handelt.<br />
Die Ergebnisse der Transport-Assays wurden mit der Varianzanalyse Twoway<br />
ANOVA und dem Posthoc-Test Bonferroni ausgewertet. Für die Evaluierung der<br />
Integrität der Zellmonolayer in den Transportuntersuchungen wurden die Mittelwerte<br />
der TEER-Werte in den einzelnen Graphen angegeben. Signifikante Unterschiede<br />
der vergleichenden Western Blots wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt. P-Werte<br />
< 0,05 wurden als statistisch signifikant erachtet.<br />
61
ERGEBNISSE<br />
5 ERGEBNISSE<br />
5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3<br />
5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen<br />
Für die Charakterisierung der humanen Zellen wurden u.a. die Zellgröße und<br />
die Zellzahl bestimmt. Dazu wurden die ebenfalls immortalisierten<br />
Rattenhirnendothelzelllinien GPNT und RBE4 kultiviert. Diese wurden in früheren<br />
Versuchen der hiesigen Arbeitsgruppe bereits charakterisiert und wurden für<br />
vergleichende Untersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen herangezogen.<br />
Dazu wurden alle drei Zelllinien über 3 Passagen kultiviert, auf 6Well-Platten<br />
ausgesät und am 5. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die Bilder und die<br />
anschließende Zellzählung verwendet. Die Zellzählung wurde dabei wie in Abschnitt<br />
4.3.2 (S. 54 f.) beschrieben durchgeführt.<br />
Abbildung 5.1: Bilder der humanen hCMEC/D3-Zellen (A) im Vergleich mit den<br />
Rattenhirnkapillarendothelzelllinien GPNT (B) und RBE4 (C). Die Bilder wurden mit einer 200x<br />
Vergrößerung aufgenommen. Die GPNT- und RBE4-Zellen sind kleiner und weisen auf der<br />
gleichen Fläche eine etwa 2,5-mal höhere Zellzahl/ml auf als die humanen Zellen (A).<br />
Die humanen Zellen waren nach diesen Bildern durchschnittlich etwa 40-50<br />
µm groß und damit etwa doppelt so groß wie die Zellen der Rattenzelllinie GPNT. Die<br />
GPNT-Zellen zeigten eine rundere Form als die anderen beiden Zelllinien. Beide<br />
Rattenzelllinien (GPNT und RBE4-Zellen) zeigten im Gegensatz zu den hCMEC/D3-<br />
Zellen auf der gleichen Fläche (A = 9,6 cm 2 ) dichter gepackte Zellen. Dies wurde<br />
zusammen mit den Unterschieden in der Zellgröße mit Hilfe der Zellzahlbestimmung<br />
62
ERGEBNISSE<br />
bestätigt. Die kleineren Rattenzellen zeigten auf der gleichen Fläche eine ca. 2,5-mal<br />
höhere Zellzahl als die humanen Zellen.<br />
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen<br />
Die Bestimmung der Expression des MDTs Pgp in hCMEC/D3-Zellen erfolgte<br />
mit der Methode des Western Blots. Der Nachweis wurde mittels eines Protokolls<br />
durchgeführt, das in der hiesigen Arbeitsgruppe für Pgp etabliert wurde und im Detail<br />
im Anhang (siehe S. 218 ff.) nachzulesen ist. Für die Untersuchung der Pgp-<br />
Expression wurden vergleichende Western Blots mit den immortalisierten<br />
Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 durchgeführt. Bei allen drei<br />
verwendeten Zelllinien hCMEC/D3, GPNT und RBE4 wurden die Pgp-Signale, die<br />
sich bei etwa 170 kDa befanden, und Signale für ß-Aktin bei ca. 42 kDa gemeinsam<br />
ausgewertet. Für die statistische Auswertung der Expression von Pgp wurden die<br />
Signale, die mittels Antigen-Antikörperbindung detektiert werden konnten, auf ß-Aktin<br />
normiert.<br />
RBE4- und GPNT-Zellen wurden in den Western Blots mitgeführt, um zu<br />
überprüfen, ob in den Kumulations-Assays ein unterschiedliches Ausmaß des<br />
Rhodamin-Efflux durch Pgp (siehe Abschnitt 5.1.3.1, Abbildung 5.4) auf die<br />
Expression dieses MDTs zurückgeführt werden kann. Mit Hilfe der Western Blots<br />
konnte gezeigt werden, dass die GPNT-Zellen die stärkste Pgp-Expression<br />
aufwiesen. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen exprimierten signifikant weniger Pgp im<br />
Vergleich zu GPNT-Zellen.<br />
63
Pgp-Expression<br />
(%; normiert auf ß-Aktin)<br />
Pgp-Expression<br />
(%; normiert auf ß-Aktin)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
B<br />
300<br />
250<br />
Pgp-Expression<br />
*<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
hCMEC/D3 RBE4 GPNT<br />
C<br />
D<br />
500<br />
Pgp-Expression<br />
520 * *<br />
480<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
hCMEC/D3 GPNT RBE4<br />
Abbildung 5.2: Immunoblots (A & C) von zwei unterschiedlichen Western Blots und<br />
entsprechende graphische Darstellungen der Pgp-Expression (B & D) in den drei<br />
Hirnendothelzelllinien hCMEC/D3 (Mensch), GPNT und RBE4 (beide Ratte). Es wurde jeweils 1<br />
Probe pro Zelllinie 3-mal aufgetragen und die Pgp-Expression auf die des Housekeepers ß-<br />
Aktin normiert. Für die hCMEC/D3-Zellen wurden Zellen der Passagen 29 (A & B) und 33 (C &<br />
D), für GPNT-Zellen die Passagen 29 (A & B) und 30 (C & D) und für die RBE4-Zellen die<br />
Passagen 61 (A & B) und 62 (C & D) verwendet. Beide Western Blots zeigten, dass die drei<br />
Zelllinien Pgp exprimierten. Die quantifizierten Signale der einzelnen Zelllinien (siehe B & D)<br />
wurden als Mittelwerte + SEM angegeben. Die Rattenhirnendothelzelllinie GPNT zeigte im<br />
Vergleich die höchste Pgp-Expression. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen wiesen eine etwa gleich<br />
hohe Expression des MDTs auf, wobei die humanen Zellen tendenziell mehr Pgp exprimierten.<br />
Signifikanzen wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (One-Way ANOVA) und dem<br />
Bonferroni-Posttest ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.<br />
64
ERGEBNISSE<br />
5.1.3 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Kumulations-Assays<br />
Die hCMEC/D3-Zellen wurden in den Passagen 31-43, GPNT-Zellen wurden<br />
von Passage 30–59 und RBE4-Zellen von Passage 61-71 für Kumulationsversuche<br />
verwendet. Die Substanzbehandlung der Zellen erfolgte dabei i.d.R. über 72 h mit<br />
Beginn 3 Tage nach Erreichen der Konfluenz (siehe Abschnitt 4.3.1). Dabei wurde<br />
täglich frisches Medium mit der jeweilig zu testenden Substanz und der<br />
entsprechenden Konzentration vorbereitet und auf die Zellen gegeben. Der<br />
Hemmstoff Tariquidar, der neben bekannten Pgp-Induktoren wie beispielsweise<br />
Dexamethason ebenfalls in jedem Versuch mitgeführt wurde, wurde lediglich für<br />
insgesamt 3 h (1 h Vorinkubation, 2 h Inkubation während des Versuchs) auf vorher<br />
unbehandelten Zellen belassen.<br />
Der Substratgehalt in den Zellen, der mit Hilfe des Kumulations-Assays<br />
gemessen werden kann, stellt ein Maß für den Einfluss von Pgp auf die Kumulation<br />
des Substrats dar. Man spricht von einer Induktion der Funktionalität, wenn der<br />
Substrat-Gehalt in den Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Kontrolle)<br />
abfällt. Ist der Gehalt des Substrats höher als in der Kontrollgruppe, geht man von<br />
einer Hemmung der Transporter-Funktion aus. Der Inhibitor Tariquidar wurde in<br />
jedem Versuch mitgeführt, um die Funktionalität des Transporters zu überprüfen und<br />
sollte Aufschluss darüber geben, ob eine vorhergehende Induktion des Pgps wieder<br />
aufgehoben werden kann.<br />
5.1.3.1 Auswahl des Substrats<br />
Die FDA empfiehlt für Untersuchungen der Pgp-Funktionalität das spezifische<br />
Pgp-Substrat Digoxin. Für die humane Zelllinie hCMEC/D3 wurde deshalb ein<br />
Kumulationsversuch mit radioaktiv-markiertem Digoxin durchgeführt, wobei lediglich<br />
eine Kontrollgruppe und eine Gruppe von Zellen, dessen Efflux durch Tariquidar<br />
gehemmt wurde, miteinander verglichen wurden.<br />
65
ERGEBNISSE<br />
25000<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=6<br />
3 H-Digoxin<br />
(DPM/mg Protein)<br />
20000<br />
15000<br />
10000<br />
5000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abbildung 5.3: Digoxin-Kumulation in einem beispielhaften Versuch mit hCMEC/D3-Zellen.<br />
Tariquidar zeigte in der erprobten Konzentration von 0,5 µM keine Inhibition des Efflux von<br />
Digoxin im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Zellen wurden über 3 Tage täglich mit frischem<br />
Medium versorgt. Der Versuch fand 6 Tage nach Erreichen der Konfluenz statt. Die Inkubation<br />
mit dem Substrat Digoxin erfolgte mit einer Konzentration von 1 µM Digoxin + 10 kBq/ml 3 H-<br />
Digoxin. Die Zellen wurden am Tag des Kumulations-Assays für 3 h mit dem spezifischen<br />
Inhibitor Tariquidar inkubiert. Die Werte sind als Mittelwerte + Standardfehler (SEM) in DPM/mg<br />
Protein angezeigt.<br />
Abkürzung: TQD: Tariquidar.<br />
Aufgrund des ausbleibenden Effekts durch Tariquidar wurden alle nun im<br />
Folgenden beschriebenen Kumulations-Assays mit den hCMEC/D3-Zellen sowie die<br />
vergleichenden Assays mit GPNT- und RBE4-Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff<br />
Rhodamin 123 durchgeführt. In der folgenden Abbildung (5.4) wird deutlich, dass<br />
Rhodamin 123 für die gewählten Versuchsbedingungen als Pgp-Substrat geeignet<br />
ist, da sowohl signifikante Unterschiede im Substratgehalt zwischen dem<br />
dargestellten Pgp-Induktor Dexamethason und den Kontrollgruppen, als auch<br />
zwischen dem Inhibitor Tariquidar und den Kontrollen nachgewiesen werden<br />
konnten.<br />
66
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
300000<br />
200000<br />
100000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=3<br />
*<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
B<br />
GPNT P:34<br />
n=3<br />
300000<br />
*<br />
200000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Dex 1 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
C<br />
300000<br />
200000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
RBE4 P:66<br />
n=3<br />
*<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abbildung 5.4: Vergleichender Kumulations-Assay mit hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen<br />
nach der Behandlung mit dem Pgp-Induktor Dexamethason und dem Inhibitor Tariquidar. Alle<br />
drei Zelllinien exprimierten funktionelles Pgp.<br />
A: Der Efflux von 10 µM Rhodamin 123 wurde durch Dexamethason induziert, Tariquidar zeigte<br />
eine Inhibition der Pgp-Funktionalität.<br />
B & C: Der Substratgehalt der Kontrollgruppen der GPNT- und RBE4-Zellen unterschied sich in<br />
großem Ausmaß. Der Efflux in GPNT-Zellen war höher. Eine Induktion durch Dexamethason<br />
war nicht nachweisbar. Der hohe Rhodamin-Gehalt in RBE4-Zellen wurde durch eine Induktion<br />
des Efflux signifikant verringert. Tariquidar zeigte jeweils eine signifikante Inhibition, der<br />
Substratgehalt im Vergleich zur Kontrolle war erhöht.<br />
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem<br />
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, TQD: Tariquidar.<br />
Die in Abbildung 5.4 dargestellten Versuche zeigten funktionelles Pgp in allen<br />
drei Zelllinien. Tariquidar inhibierte den Efflux von Rhodamin 123. Nach der<br />
Behandlung mit 1 µM Dexamethason war die Pgp-Funktionalität im Vergleich zur<br />
Kontrollgruppe in hCMEC/D3-Zellen und in RBE4-Zellen erhöht, es wurde mehr<br />
67
ERGEBNISSE<br />
Rhodamin 123 aus den Zellen transportiert. Ausnahme bildeten die GPNT-Zellen, in<br />
denen keine induzierende Wirkung nach Dexamethason nachgewiesen werden<br />
konnte.<br />
5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität<br />
Zu Beginn der Versuche wurden zunächst Pgp-Induktoren in den hCMEC/D3-<br />
Zellen getestet. Dies diente dazu, geeignete Substanzen zu finden, die für den<br />
Kumulations-Assay sensitiv genug sind und zusammen mit dem spezifischen Pgp-<br />
Inhibitor Tariquidar zur Überprüfung der Sensitivität des Kumulations-Assays<br />
eingesetzt werden können. Nachdem die Auswahl eines Pgp-Substrats erfolgt war,<br />
wurden hCMEC/D3-Zellen hinsichtlich der Auswirkungen bekannter Pgp-Induktoren<br />
untersucht. Zunächst wurde der Pgp-Induktor Dexamethason (LÖSCHER &<br />
POTSCHKA 2005a) in verschiedenen Konzentrationen getestet. Die nachfolgenden<br />
Graphen zeigen exemplarisch die Effekte in den Kumulations-Assays. Tariquidar ist<br />
als Kontrolle zur Überprüfung des Assays angezeigt.<br />
Da die Ergebnisse für Dexamethason nicht eindeutig waren, wurden weitere<br />
Konzentrationen sowie andere bekannte Pgp-Induktoren wie die Zytostatika<br />
Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin getestet.<br />
68
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=4<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
B<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=3<br />
*<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
C<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=3<br />
Dex 20 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
D<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=3<br />
150000 *<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
p=0,0881<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Dex 5 µM<br />
Dex 10 µM<br />
Puro 0,5 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
E<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC P:32<br />
n=3<br />
Puro 0,5 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
F<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC P:31<br />
n=6<br />
Puro 1 µM<br />
* *<br />
Vin 20 nM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
G<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Dex 1 µM<br />
hCMEC/D3 P:32<br />
n=3<br />
* * *<br />
Dex 5 µM<br />
Dex 10 µM<br />
Rif 20 µM<br />
*<br />
Puro 1 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
H<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:39<br />
n=3<br />
Dox 0,23 µM<br />
Rif 2,5 µM<br />
Abbildung 5.5: Kumulation des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 nach Behandlung mit den<br />
Pgp-Induktoren Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin, Vincristin und dem Pgp-<br />
Inhibitor Tariquidar in acht unabhängigen Versuchen in hCMEC/D3-Zellen. Tariquidar führte in<br />
allen Versuchen zur signifikanten Erhöhung der Kumulation. Dexamethason und Rifampicin<br />
zeigten inkonsistente Effekte. Doxorubicin führte in der gewählten Konzentration nicht zu einer<br />
Induktion des Efflux. Puromycin (1 µM) und Vincristin induzierten den Efflux, der Rhodamin-<br />
Gehalt war im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen reduziert.<br />
Die Zellen wurden ab dem 3. Tag der Konfluenz über 72 h mit den Induktoren behandelt.<br />
Tariquidar wurde erst zu Beginn des Versuchs einer Gruppe von unbehandelten Zellen zugefügt.<br />
Die Versuche wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Versuche<br />
69
ERGEBNISSE<br />
erfolgten unter einer Rhodamin-Konzentration von 10 µM. Die Werte sind als Mittelwerte + SEM<br />
angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Student’s t-Test festgestellt und sind mit<br />
Sternen (p < 0,05) angegeben. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle sind die<br />
p-Werte < 0,1 angegeben.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Puro: Puromycin, Rif: Rifampicin, Vin:<br />
Vincristin, TQD: Tariquidar.<br />
Für alle hier verwendeten Pgp-Induktoren wurden mehrere Konzentrationen<br />
getestet. Sofern die Zellen mit Ablösungen auf eine der Konzentrationen reagierten,<br />
wurden diese nicht graphisch dargestellt und wurden auch in der<br />
zusammenfassenden Darstellung (Abbildung 5.7) nicht berücksichtigt. Es stellte sich<br />
heraus, dass Dexamethason und Rifampicin in einzelnen Versuchen zu einer<br />
Induktion führten (Abbildung 5.5 B & G). Wenn diese Experimente mit den gleichen<br />
und auch weiteren Konzentrationen wiederholt wurden, waren die Effekte oft nicht<br />
reproduzierbar. Puromycin und Vincristin zeigten die robustesten induzierenden<br />
Effekte. Beide Substanzen wurden zusammen mit Doxorubicin und Rifampicin auch<br />
in höheren Konzentrationen (Puromycin 2,65 µM, Vincristin 40 nM, Doxorubicin 0,92<br />
µM und Rifampicin 200, 500 und 1000 µM) getestet, wobei sich während der<br />
Behandlungen Zellen ablösten (Daten nicht dargestellt). Im Kumulations-Assay<br />
konnten zwar in diesen Versuchen Effekte auf den Efflux nachgewiesen werden<br />
(Abbildung 5.7), welche aber aufgrund der Zellablösungen aus der Gesamtwertung<br />
ausgeschlossen und hier nicht dargestellt wurden.<br />
Die Induktion der Pgp-Funktionalität durch Glutamat in der Konzentration von<br />
100 µM wurde bereits in In-vitro-Versuchen mit Rattenhirnkapillaren nachgewiesen<br />
(BAUER et al. 2008). In den Kumulations-Assays mit hCMEC/D3-Zellen war diese<br />
Induktion nicht zu erkennen (Abbildung 5.6), weshalb diese Substanz nicht weiter<br />
eingesetzt wurde.<br />
70
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=3<br />
Glu 100 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
B<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=3<br />
Glu 100 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abbildung 5.6: Rhodamin-Kumulation nach der Behandlung mit 100 µM Glutamat in hCMEC/D3-<br />
Zellen. In keinem der beiden Versuche war eine Induktion des Efflux nachweisbar. Tariquidar<br />
führte zur Inhibition des Efflux. Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Signifikante<br />
Unterschiede im Vergleich Kontrolle vs. Tariquidar wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt und<br />
sind mit einem Stern (p < 0,05) angegeben.<br />
Abkürzungen: Glu: Glutamat, TQD: Tariquidar.<br />
Eine Induktion der Pgp-Funktionalität bedeutet, dass der Substratgehalt im<br />
Vergleich zum Grundtransport (Kontrolle) abfällt, weil durch die induzierende<br />
Wirkung mehr Substrat aus den Zellen transportiert wird. Die dargestellten Versuche<br />
zeigten, dass die Induktoren nur in bestimmten Konzentrationen induzierend auf den<br />
Efflux des Pgp-Substrats Rhodamin 123 wirkten. Keiner der verwendeten Pgp-<br />
Induktoren zeigte in allen Versuchen konsistente Effekte, weshalb i.d.R. mehrere<br />
dieser Substanzen mitgeführt wurden.<br />
Inhibitoren wie Tariquidar führen zu einem Anstieg des Substrats in den<br />
Zellen, weil der Efflux durch Pgp gehemmt wird. Tariquidar zeigte im Vergleich zu<br />
den bekannten Pgp-Induktoren stets eine Inhibition des Efflux, der Rhodamin-Gehalt<br />
in den Zellen war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht.<br />
71
ERGEBNISSE<br />
Zusammenfassung der Effekte bekannter Pgp-Induktoren<br />
In Abbildung 5.7 sind die Einzelversuche mit den Induktoren zur Übersicht in<br />
einem Graphen zusammengefasst. Dazu wurden alle Kontrollgruppen der Versuche,<br />
in denen der jeweilige Induktor eingesetzt wurde, zusammengefasst, die Mittelwerte<br />
berechnet, die Einzelwerte auf diese bezogen und als % angegeben. Die einzelnen<br />
Werte der Substanzgruppen wurden dann auf die jeweilige Kontrolle (= 100 %)<br />
bezogen.<br />
In der Zusammenfassung der Versuche mit Pgp-Induktoren in hCMEC/D3-<br />
Zellen zeigten Dexamethason, Puromycin und Vincristin die vergleichsweise<br />
robustesten Resultate bezüglich der Induktion des Rhodamin-Efflux und führten<br />
folglich zu einer Abnahme des Rhodamin-Gehalts in den Zellen (Abbildung 5.7).<br />
Rifampicin stellte den schwächsten Induktor dar. Letztlich wurden in den folgenden<br />
Versuchen oftmals zwei oder mehr Induktoren bzw. Konzentrationen eines Induktors<br />
mitgeführt. Vier der sechs getesteten Substanzen führten in einer oder mehreren<br />
Konzentrationen zu einem signifikanten Abfall des Substratgehalts in den Zellen, die<br />
Pgp-Funktionalität wurde signifikant induziert. Dabei wurde die Induktion nicht immer<br />
durch die höchste Konzentration erzielt. Die höchsten für Doxorubicin (0,92 µM),<br />
Puromycin (2,65 µM), Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) und Vincristin (40 nM)<br />
untersuchten Konzentrationen zeigten zelltoxische Wirkungen in Form von<br />
Zellablösungen, die teilweise schon ab dem ersten Behandlungstag zu erkennen<br />
waren. Tariquidar stellte einen verlässlichen Inhibitor dar.<br />
In der vergleichenden Betrachtung mit GPNT- und RBE4-Zellen zeigte<br />
Dexamethason in der Konzentration von 1 µM robustere Effekte in hCMEC/D3- und<br />
RBE4-Zellen als in GPNT-Zellen (Abbildung 5.4 bzw. 5.11 A).<br />
72
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
ERGEBNISSE<br />
350<br />
325<br />
300<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
hCMEC/D3 - Induktoren<br />
*<br />
**<br />
** *<br />
** *<br />
40<br />
20<br />
0<br />
91 21 32 15<br />
Kontrolle<br />
Dex 1 µM<br />
Dex 5 µM<br />
Dex 10 µM<br />
Dox 0,23 µM<br />
3 6 12 18 9 6 6 6 3 9 79<br />
Glu 100 µM<br />
Puro 0,5 µM<br />
Puro 1 µM<br />
Rif 2,5 µM<br />
Rif 5 µM<br />
Rif 10 µM<br />
Rif 20 µM<br />
Rif 50 µM<br />
Vin 20 nM<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abbildung 5.7: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in hCMEC/D3-Zellen der Passagen<br />
31-43, in denen Pgp-Induktoren untersucht wurden. Vier der sechs getesteten Induktoren führten<br />
in mindestens einer Konzentration zu einer Induktion des Efflux. Dexamethason, Puromycin und<br />
Vincristin zeigten die robustesten Effekte. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einem<br />
signifikant erhöhten Rhodamin-Gehalt, also zur Inhibition des Efflux. Daten sind als Mittelwerte +<br />
SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen Versuche mit Pgp-Induktoren wurden<br />
zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf diese bezogen. Die Gruppengröße n<br />
ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Oneway<br />
ANOVA (Posthoc Dunnett’s) ermittelt und sind als Sterne (p < 0,05) angezeigt.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Glu: Glutamat, Puro: Puromycin, Rif:<br />
Rifampicin, Vin: Vincristin, TQD: Tariquidar.<br />
73
ERGEBNISSE<br />
5.1.3.3 Modulationen der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika<br />
Im Folgenden werden Versuche mit therapeutisch eingesetzten Antiepileptika<br />
in den humanen Hirnkapillarendothelien hCMEC/D3 gezeigt. Die Antiepileptika<br />
wurden hinsichtlich möglicher induzierender Wirkungen auf die Pgp-Funktionalität<br />
untersucht. In Tabelle 5.1 werden die verwendeten Konzentrationen der<br />
Antiepileptika im Vergleich zu den therapeutischen Plasmakonzentrationen in<br />
Epilepsiepatienten gezeigt. Zudem wurden sie in Bezug zu den therapeutischen<br />
Plasmakonzentrationen in Epilepsiepatienten gesetzt.<br />
Tabelle 5.1 Verwendete Konzentrationen der untersuchten Antiepileptika sowie deren<br />
Bereich der therapeutischen Plasmakonzentrationen in Epilepsiepatienten (nach<br />
PATSALOS et al. 2008).<br />
Antiepileptikum<br />
Therapeutische Plasma-<br />
In der These verwendete<br />
konzentrationen<br />
Konzentrationen (µM)<br />
µg/ml µM<br />
Carbamazepin 4-12 17-51 10-100<br />
Levetiracetam 12-46 70-270 100-300<br />
Phenobarbital 10-40 43-172 100-300<br />
Phenytoin 10-20 40-79 10-100<br />
Topiramat 5-20 15-59 30-300<br />
Valproat 50-100 347-693 50-300<br />
Die verwendeten Konzentrationen der untersuchten Antiepileptika liegen im<br />
Bereich therapeutisch eingesetzter Konzentrationen bei Epilepsiepatienten, teils<br />
darüber. Für Valproat liegen die Konzentrationen unterhalb dieses Bereichs.<br />
74
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
C<br />
E<br />
300000<br />
250000<br />
200000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
200000<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
300000<br />
200000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
n=6<br />
Kontrolle<br />
Kontrolle<br />
Dex 5 µM<br />
hCMEC/D3 P:33<br />
n=3<br />
p=0,0604<br />
Dex 5 µM<br />
n=2<br />
Dex 5 µM<br />
PB 100 µM<br />
PB 300 µM<br />
* *<br />
TPM 30 µM<br />
hCMEC/D3 P:37<br />
n=3<br />
CBZ 100 µM<br />
* *<br />
PHT 10 µM<br />
PHT 30 µM<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
CBZ 100 µM<br />
LEV 100 µM<br />
LEV 300 µM<br />
G<br />
*<br />
TPM 100 µM<br />
PHT 50 µM<br />
* *<br />
VPA 100 µM<br />
VPA 300 µM<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Puro 1 µM<br />
B<br />
D<br />
F<br />
300000<br />
250000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
150000<br />
100000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
125000<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=6<br />
* *<br />
Vin 20 nM<br />
n=6<br />
Kontrolle<br />
Kontrolle<br />
Kontrolle<br />
Dex 5 µM<br />
Dex 10 µM<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=3<br />
* *<br />
CBZ 50 µM<br />
CBZ 100 µM<br />
PB 300 µM<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=3<br />
*<br />
CBZ 100 µM<br />
Dex 10 µM<br />
p=0,0642<br />
PHT 100 µM<br />
TPM 100 µM<br />
TPM 100 µM<br />
TPM 300 µM<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=3<br />
PHT 100 µM<br />
LEV 100 µM<br />
VPA 300 µM<br />
LEV 300 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
150000<br />
*<br />
VPA 50 µM<br />
VPA 100 µM<br />
p=0,0881<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
75
ERGEBNISSE<br />
Abbildung 5.8: Ausgewählte Kumulationsversuche mit Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen nach<br />
der Behandlung mit den Antiepileptika Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin,<br />
Topiramat und Valproat in verschiedenen Konzentrationen (A-G). In allen Versuchen wurden<br />
bekannte Pgp-Induktoren (Dexamethason, Puromycin und Vincristin) und der Pgp-Inhibitor<br />
Tariquidar mitgeführt. Alle Antiepileptika führten in einzelnen Versuchen zu einer Induktion des<br />
Efflux. Diese Effekte konnten oft nicht wiederholt werden. Carbamazepin zeigte die robustesten<br />
Induktionen. Tariquidar führte in allen Experimenten zu einer Inhibition des Rhodamin-Efflux.<br />
Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Die statistische Auswertung wurde mit dem<br />
Student’s t-Test vorgenommen. Signifikante Unterschiede sind mit Sternen (p < 0,05)<br />
gekennzeichnet. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle sind die p-Werte < 0,1<br />
angegeben.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Puro: Puromycin, Vin: Vincristin, CBZ: Carbamazepin, LEV:<br />
Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin, TPM: Topiramat, VPA: Valproat, TQD:<br />
Tariquidar.<br />
Die einzelnen Versuche mit den sechs untersuchten Antiepileptika<br />
Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat in<br />
verschiedenen Dosierungen ließen kein eindeutiges Ergebnis erkennen. Von den<br />
sechs untersuchten Therapeutika zeigte Carbamazepin die robustesten Effekte (5.8<br />
B, C & D). In der niedrigeren Konzentration von 50 µM zeigten sich Tendenzen zu<br />
einer Induktion, in der höheren Dosierung von 100 µM führte diese Substanz zur<br />
signifikanten Induktion von Pgp in hCMEC/D3-Zellen. Für Phenytoin wurden<br />
Tendenzen zur Induktion erst bei den höheren Konzentrationen sichtbar (100 µM; 5.8<br />
D). Eine Ausnahme bildete dabei die niedrigste Dosierung (10 µM), für die ein<br />
inhibitorischer Effekt nachgewiesen wurde (Abbildung 5.8 C). Für Phenobarbital war<br />
in einem einzelnen Versuch eine Induktion nachweisbar. Der Effekt war aber nicht<br />
reproduzierbar (Abbildung 5.8 A & B). Für Levetiracetam (5.8 E & F), Topiramat (5.8<br />
A, B & D) und Valproat (5.8 D, E & G) galt das Gleiche, einzelne Induktionen ließen<br />
sich nicht erneut nachweisen. In einem einzelnen Kumulations-Assay zeigte Valproat<br />
auch eine Tendenz zur Inhibition des Efflux (5.8 E). Des Weiteren wurde die<br />
Behandlung für Valproat einmalig auf 6 Tage ausgedehnt. Es waren aber keine<br />
Unterschiede im Vergleich zur 3-tägigen Behandlung nachweisbar. Für keines der<br />
untersuchten Antiepileptika war eine Abhängigkeit von der Passage der Zellen zu<br />
erkennen.<br />
Tariquidar zeigte in allen Versuchen eine Inhibition des Efflux, der<br />
Substratgehalt war im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht.<br />
76
ERGEBNISSE<br />
Zusammenfassung möglicher induzierender Effekte durch Antiepileptika<br />
Abbildung 5.9 zeigt eine Zusammenfassung der Einzelversuche mit<br />
Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen. Dazu wurden für alle Versuche, in denen<br />
Antiepileptika getestet wurden, die Mittelwerte der einzelnen Kontrollgruppen<br />
berechnet, die Einzelwerte auf diese bezogen und als % angegeben. Die einzelnen<br />
Werte der Substanzgruppen wurden dann auf die jeweilige Kontrolle (= 100 %)<br />
bezogen.<br />
Carbamazepin zeigte in fast allen Einzelversuchen signifikante Effekte. Nach<br />
der Normierung war ein induzierender Effekt nachweisbar, Carbamazepin zeigte im<br />
Vergleich zur Kontrolle einen verringerten Substratgehalt. Für Valproat (300 µM)<br />
konnte in der Zusammenfassung ebenfalls eine Induktion des Rhodamin-Efflux<br />
nachgewiesen werden. Für die anderen Antiepileptika Levetiracetam, Phenobarbital,<br />
Phenytoin und Topiramat waren keine induzierenden Effekte nachweisbar. In<br />
einzelnen Konzentrationen sind allerdings Tendenzen zur Induktion erkennbar. Sie<br />
zeigten aber unter den gewählten Bedingungen keine Unterschiede zur Kontrolle.<br />
Tariquidar führte in allen Versuchen zu einem signifikant erhöhten Rhodamin-Gehalt,<br />
also zur Inhibition des Efflux. Es bleibt festzuhalten, dass einige Antiepileptika unter<br />
den gewählten Kultur- und Versuchsbedingungen zur Induktion von Pgp führten.<br />
77
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
ERGEBNISSE<br />
120<br />
hCMEC/D3 - Antiepileptika<br />
100<br />
80<br />
*<br />
*<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Kontrolle<br />
91 6 30 6<br />
CBZ 50 µM<br />
CBZ 100 µM<br />
LEV 100 µM<br />
LEV 300 µM<br />
11 3 9 3 3 3 12 3 12 6 6 10 15<br />
PB 100 µM<br />
PB 300 µM<br />
PHT 10 µM<br />
PHT 30 µM<br />
PHT 50 µM<br />
PHT 100 µM<br />
TPM 30 µM<br />
TPM 100 µM<br />
TPM 300 µM<br />
VPA 50 µM<br />
VPA 100 µM<br />
VPA 300 µM<br />
Abbildung 5.9: Zusammenfassung der Kumulations-Assays mit therapeutisch eingesetzten<br />
Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen der Passagen 31-43. Carbamazepin (100 µM) und Valproat<br />
(300 µM) führten zu einer Induktion des Rhodamin-Efflux. Nach der Behandlung mit<br />
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin und Topiramat waren keine induzierenden Effekte<br />
nachweisbar. Tariquidar führte in allen Versuchen zur Inhibition des Efflux (nicht gezeigt). Die<br />
Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Für die Auswertung wurden die Kontrollen der<br />
Versuche, in denen Antiepileptika mitgeführt wurden, zusammengefasst und in % angegeben.<br />
Einzelne Werte der Substanzgruppen wurden auf die Kontrolle des jeweiligen Versuchs bezogen.<br />
Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede<br />
wurden mit einer One-way ANOVA (Posthoc Dunnett’s) ermittelt und sind als Sterne (p < 0,05)<br />
angezeigt.<br />
Abkürzungen: CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin,<br />
TPM: Topiramat, VPA: Valproat.<br />
In den Tabellen 5.2 und 5.3 sind noch einmal alle Ergebnisse aus den<br />
Kumulations-Assays zusammengefasst. Die Daten zu den Induktoren stammen aus<br />
dem unter Abbildung 5.7 gezeigten Graphen. Auswirkungen der Antiepileptika-<br />
Behandlung entsprechen dem Graphen der Abbildung 5.9.<br />
78
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.2: Übersicht der Ergebnisse aus Kumulations-Assays mit dem Substrat<br />
Rhodamin 123 nach der Behandlung mit Pgp-Induktoren in hCMEC/D3-Zellen (nach<br />
Abbildung 5.7).<br />
Pgp-Induktor Konzentration Effekt<br />
1 µM -<br />
Dexamethason<br />
5 µM +<br />
10 µM +<br />
Doxorubicin 0,23 µM -<br />
Glutamat 100 µM -<br />
Puromycin<br />
0,5 µM +<br />
1 µM +<br />
2,5 µM -<br />
5 µM Inhibition!<br />
Rifampicin<br />
10 µM Inhibition!<br />
20 µM -<br />
50 µM +<br />
Vincristin 20 nM +<br />
+ Induktion - Induktion nicht nachweisbar<br />
79
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.3: Übersicht der Ergebnisse aus Kumulations-Assays mit dem Substrat<br />
Rhodamin 123 nach der Behandlung mit Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen (nach<br />
Abbildung 5.9).<br />
Antiepileptikum Konzentration Effekt<br />
Carbamazepin<br />
Levetiracetam<br />
Phenobarbital<br />
50 µM -<br />
100 µM +<br />
100 µM -<br />
300 µM -<br />
100 µM -<br />
300 µM -<br />
10 µM -<br />
Phenytoin<br />
30 µM -<br />
50 µM -<br />
100 µM -<br />
30 µM -<br />
Topiramat<br />
100 µM -<br />
300 µM -<br />
50 µM -<br />
Valproat<br />
100 µM -<br />
300 µM +<br />
+ Induktion - Induktion nicht nachweisbar<br />
Die Abbildungen 5.7 und 5.9 und die Tabellen 5.2 und 5.3 machen deutlich, dass<br />
bekannte Pgp-Induktoren und einzelne Antiepileptika in der Lage sind, die Pgp-<br />
Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen zu modulieren.<br />
80
ERGEBNISSE<br />
5.1.3.4 Einfluss des Serums während des Kumulationsversuchs<br />
Für den Kumulationsversuch wurden die Zellen für die Dauer des Versuchs (3<br />
Stunden) auf ein serum- und wachstumsfaktorfreies Versuchsmedium (Opti-MEM ® )<br />
umgestellt, um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat Rhodamin 123<br />
auszuschließen. Die unter den Abbildungen 5.4, 5.5 und 5.8 dargestellten Versuche<br />
zeigten keine einheitlichen Effekte der einzelnen Substanzen. Zudem führten<br />
einzelne Induktoren (Doxorubicin, Puromycin und Vincristin) zu Zellablösungen<br />
während der Behandlung. Zur Untersuchung, ob das im Versuchsmedium fehlende<br />
Serum einen Einfluss hat, wurden einzelne Versuche mit Serum-versetztem Opti-<br />
MEM ® durchgeführt (nicht dargestellt). Dabei wurde die gleiche Serumkonzentration<br />
wie im Kulturmedium der hCMEC/D3-Zellen verwendet. In diesen Versuchen wurden<br />
keine Unterschiede zur Modulation der Pgp-Funktionalität zwischen dem<br />
Versuchsmedium mit und ohne Serum nachgewiesen. Veränderungen in Bezug auf<br />
Messbarkeit und Beeinflussung der Funktionalität des MDT Pgp konnten nicht<br />
festgestellt werden, weshalb nach dem üblichen Protokoll verfahren wurde, in dem<br />
für den Versuch die Umstellung der Zellen auf serumfreies Medium erfolgte.<br />
5.1.3.5 Hydrocortison und dessen Einfluss auf den Efflux<br />
Die hCMEC/D3-Zellen wurden nach dem Protokoll von Dr. P.-O. Couraud mit<br />
1,4 µM Hydrocortison kultiviert. Dieser Mediumszusatz soll zu einer Erhöhung der<br />
Dichtigkeit, die für Transportversuche notwendig ist, beitragen. Für<br />
Kumulationsversuche sind dichte Monolayer nicht notwendig. Hydrocortison kann<br />
das Zellwachstum mindern, sodass beispielsweise weniger Zellen mit den<br />
Testsubstanzen inkubiert werden und sich dies auf die Resultate der Kumulations-<br />
Assays auswirken kann. Zudem ist für Hydrocortison bekannt, dass es die<br />
Funktionalität Pgps induziert (MAINES et al. 2005). Um die Effekte von Hydrocortison<br />
abschätzen zu können, wurden hCMEC/D3-Zellen ab der Aussaat für die Versuche<br />
mit und ohne Hydrocortison kultiviert und für zwei Kumulationsversuche mit dem<br />
Pgp-Induktor Dexamethason und verschiedenen Antiepileptika behandelt.<br />
81
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
800000.0<br />
400000.0<br />
120000<br />
100000<br />
80000<br />
60000<br />
40000<br />
20000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Vergleich + und - Hydrocortison<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=3<br />
Dex 1 µM<br />
PB 300 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Kontrolle<br />
*<br />
*<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
PB 300 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
+ Hydrocortison - Hydrocortison<br />
B<br />
800000.0<br />
400000.0<br />
250000<br />
200000<br />
150000<br />
100000<br />
50000<br />
0<br />
p=0,0889<br />
Kontrolle<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
Vergleich + und - Hydrocortison<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=3<br />
CBZ 50 µM<br />
LEV 100 µM<br />
PB 100 µM<br />
*<br />
p=0,0758<br />
*<br />
+ Hydrocortison<br />
*<br />
PHT 50 µM<br />
TPM 30 µM<br />
VPA 300 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
Kontrolle<br />
*<br />
*<br />
Dex 1 µM<br />
CBZ 50 µM<br />
LEV 100 µM<br />
PB 100 µM<br />
*<br />
- Hydrocortison<br />
p=0,069<br />
PHT 50 µM<br />
TPM 30 µM<br />
VPA 300 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
*<br />
*<br />
Abbildung 5.10: Rhodamin-Kumulation in hCMEC/D3-Zellen. Es sind die Ergebnisse aus zwei<br />
Versuchen dargestellt, wobei im ersten nur der Pgp-Induktor Dexamethason und das<br />
Antiepileptikum Phenobarbital untersucht wurden. Im zweiten Experiment wurden fünf weitere<br />
Antiepileptika (Carbamazepin, Levetiracetam, Phenytoin, Topiramat und Valproat) getestet.<br />
A: Die Zellen ohne Hydrocortison zeigten eine Induktion Pgp-Funktionalität nach<br />
Dexamethason und eine Inhibition nach Phenobarbital.<br />
B: Dexamethason und Phenytoin wirkten induzierend auf den Efflux in Zellen ohne<br />
Hydrocortison. Für Valproat und Topiramat war eine Inhibition bzw. eine Tendenz zur Inhibition<br />
nachweisbar. Die Behandlung mit Topiramat führte zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität.<br />
82
ERGEBNISSE<br />
Die Linie, die in beiden Graphen zu sehen ist, weist auf die Rhodamin-Kumulation nach dem<br />
Standardprotokoll hin, in dem die Zellen mit Hydrocortison kultiviert wurden. Sie soll den<br />
Unterschied zwischen den beiden Gruppen verdeutlichen.<br />
In beiden Versuchen inhibierte Tariquidar den Efflux in allen Zellen (+ und – Hydrocortison).<br />
Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich<br />
zur Kontrolle sind die p-Werte < 0,1 angegeben. Signifikante Unterschiede nach dem Student’s<br />
t-Test sind mit Sternen angegeben (p < 0,05).<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital,<br />
PHT: Phenytoin, TPM: Topiramat, VPA: Valproat, TQD: Tariquidar.<br />
Die in Abbildung 5.10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hydrocortison<br />
einen Einfluss auf die Sensitivität der Zellen hat. Zellen, die ohne Hydrocortison im<br />
Medium kultiviert wurden, reagierten nach der Behandlung mit bekannten Pgp-<br />
Induktoren und Antiepileptika empfindlicher. Effekte waren eher nachzuweisen als<br />
bei der Kultivierung mit Hydrocortison. Diese Empfindlichkeit zeigte sich auch in der<br />
weiteren Kultivierung der Zellen. Die Zellen schienen langsamer zu wachsen und<br />
zeigten sich generell empfindlicher gegenüber Mediumswechsel und anderen<br />
Veränderungen. Im zweiten vergleichenden Versuch bezüglich des Hydrocortisons<br />
(Abbildung 5.10 B) waren zudem Unterschiede in der Grundfunktionalität (Kontrolle)<br />
von Pgp zu erkennen. Die Zellen ohne Hydrocortison wiesen einen höheren<br />
Rhodamin-Gehalt auf (p < 0,001). Dies kann auf eine geringere Pgp-Funktionalität<br />
zurückgeführt werden, die mit einer geringeren Inhibition durch Tariquidar<br />
einhergehen sollte. Die Behandlung mit Tariquidar verursachte aber in den Zellen<br />
ohne Hydrocortison eine im Vergleich mit Hydrocortison signifikant erhöhte Inhibition<br />
(p < 0,0026 bzw. p < 0,003). Diese Versuche zeigten, dass Hydrocortison die Pgp-<br />
Funktionalität induzierte.<br />
Im ersten Versuch wurde zusätzlich der Pgp-Induktor Doxorubicin (0,92 µM)<br />
untersucht (nicht dargestellt). In dieser Konzentration kam es mit und ohne<br />
Hydrocortison zu Zellablösungen, wobei die Zellen ohne Hydrocortison eine höhere<br />
Empfindlichkeit auf Doxorubicin zeigten. Aus diesem Grund wurde Doxorubicin in<br />
dieser Konzentration von der Auswertung ausgeschlossen.<br />
Die Ergebnisse nach der Behandlung mit Antiepileptika blieben von der<br />
Kultivierung mit und ohne Hydrocortison unbeeinflusst. Die modulatorischen Effekte<br />
zeigten auch ohne den Zusatz von Hydrocortison im Medium variable Ergebnisse.<br />
83
ERGEBNISSE<br />
5.1.3.6 Vergleichende Untersuchungen der Pgp-Funktion in<br />
Rattenhirnendothelien<br />
Im Vergleich mit den Rattenzelllinien GPNT und RBE4 wurde die Wirkung des<br />
Hydrocortisons im Medium der hCMEC/D3-Zellen erneut deutlich. Sowohl RBE4- als<br />
auch GPNT-Zellen wurden ohne Hydrocortison kultiviert. Beide Zelllinien zeigten<br />
stärkere induzierende Effekte nach der Behandlung mit den bekannten Pgp-<br />
Induktoren Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin und Rifampicin (Abbildung 5.11)<br />
so wie es für die hCMEC/D3-Zellen nach der Kultivierung ohne Hydrocortison<br />
festzustellen war.<br />
Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin und Rifampicin führten in den<br />
gewählten Konzentrationen zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität. In RBE4-Zellen<br />
induzierten Dexamethason und Rifampicin in geringeren Konzentrationen als in<br />
hCMEC/D3-Zellen (Abbildung 5.7). Außer den Induktoren wurden in den<br />
immortalisierten Rattenhirnendothelzellen ebenfalls die Antiepileptika Carbamazepin,<br />
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat in verschiedenen<br />
Konzentrationen bezüglich ihrer modulierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität<br />
untersucht.<br />
84
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
B<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
250<br />
200<br />
0<br />
150<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Kontrolle<br />
Dex 1 µM<br />
GPNT-Zellen<br />
Pgp-Induktoren<br />
*<br />
49 40<br />
* *<br />
47 3 33 3<br />
Dex 0,5 µM<br />
Dex 1 µM<br />
*<br />
Dox 0,92 µM<br />
*<br />
Puro 10,6 µM<br />
*<br />
Rif 10 µM<br />
*<br />
4 10 4 40<br />
RBE4-Zellen<br />
Pgp-Induktoren<br />
* * * *<br />
Dox 0,23 µM<br />
Dox 0,46 µM<br />
Puro 2,65 µM<br />
Puro 5,3 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Rif 2,5 µM<br />
Rif 5 µM<br />
Rif 10 µM<br />
Rif 50 µM<br />
*<br />
3 3 3 3 3 3 3 33<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abbildung 5.11: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in GPNT- (A) und RBE4-Zellen (B)<br />
der Passagen 30-59 bzw. 61-71 nach der Behandlung mit Pgp-Induktoren. Die vier getesteten<br />
Induktoren führten zu einer Induktion des Efflux. Dexamethason, Doxorubicin und Puromycin<br />
zeigten die robustesten Effekte. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einer Inhibition des<br />
Efflux. Daten sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen Versuche mit Pgp-<br />
Induktoren wurden zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf diese bezogen.<br />
Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede<br />
wurden mit einer One-way ANOVA und dem Dunnett’s Posthoc-Test festgestellt und sind mit<br />
Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Puro: Puromycin, Rif: Rifampicin, TQD:<br />
Tariquidar.<br />
85
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
Rhodamin 123 (% Kontrolle)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
120<br />
GPNT-Zellen<br />
Antiepileptika<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
B<br />
20<br />
0<br />
220<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
49 3 6 6 6 6 6 6 6 3 6 6 15 18 6 6<br />
Kontrolle<br />
CBZ 10 µM<br />
Kontrolle<br />
CBZ 10 µM<br />
CBZ 30 µM<br />
CBZ 50 µM<br />
CBZ 100 µM<br />
LEV 100 µM<br />
LEV 300 µM<br />
* *<br />
PB 100 µM<br />
PB 300 µM<br />
PHT 10 µM<br />
PHT 30 µM<br />
PHT 50 µM<br />
RBE4-Zellen<br />
Antiepileptika<br />
CBZ 30 µM<br />
CBZ 50 µM<br />
CBZ 100 µM<br />
LEV 100 µM<br />
LEV 300 µM<br />
PB 100 µM<br />
PB 300 µM<br />
PHT 10 µM<br />
PHT 30 µM<br />
PHT 50 µM<br />
TPM 30 µM<br />
TPM 100 µM<br />
VPA 100 µM<br />
VPA 300 µM<br />
41 6 3 6 6 6 12 11 11 6 6 6 7 7 9 6<br />
*<br />
*<br />
TPM 30 µM<br />
TPM 100 µM<br />
VPA 100 µM<br />
VPA 300 µM<br />
Abbildung 5.12: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in GPNT- (A) und RBE4-Zellen (B)<br />
der Passagen 30-59 bzw. 61-71 nach der Behandlung mit Antiepileptika. Zwei der sechs<br />
getesteten Antiepileptika führten zu einer Induktion des Efflux. Carbamazepin (10 und 50 µM) und<br />
Topiramat (100 µM) zeigten in RBE4-Zellen die robustesten induzierenden Effekte, Valproat (300<br />
µM) inhibierte die Pgp-Funktionalität. Der Efflux in GPNT-Zellen wurde durch die getesteten<br />
Antiepileptika nicht beeinflusst. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einer Inhibition des<br />
86
ERGEBNISSE<br />
Efflux (nicht gezeigt). Daten sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen<br />
Versuche mit Antiepileptika wurden zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf<br />
diese bezogen. Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante<br />
Unterschiede wurden mit einer One-way ANOVA und dem Dunnett’s Posthoc-Test festgestellt<br />
und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
Abkürzungen: CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin,<br />
TPM: Topiramat, VPA: Valproat.<br />
Für die sechs untersuchten Antiepileptika waren die Effekte in GPNT- und<br />
RBE4-Zellen ebenfalls moderat. In GPNT-Zellen führte keines der getesteten<br />
Antiepileptika zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität. In RBE4-Zellen wurde der<br />
Efflux nach der Behandlung mit Carbamazepin (10 und 50 µM) und Topiramat (100<br />
µM) induziert.<br />
5.1.3.7 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp<br />
Abschließend kann man sagen, dass die immortalisierte humane Zelllinie<br />
hCMEC/D3 funktionelles Pgp aufweist. Die Funktionalität dieses Transporterproteins<br />
konnte durch bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren beeinflusst werden. Trotz<br />
des variablen Bilds bezüglich der getesteten Antiepileptika konnte mit Kumulations-<br />
Assays gezeigt werden, dass diese Substanzen wenn auch im geringen Ausmaß in<br />
der Lage sind, die Funktion des Transporterproteins Pgp zu modifizieren. Für<br />
einzelne Konzentrationen der Antiepileptika, die tendenziell modulatorischen Effekte<br />
auf die Pgp-Funktion zeigten (z.B. Levetiracetam und Phenobarbital), waren die<br />
Gruppengrößen recht klein (Abbildung 5.9). Mit weiteren Versuchen zur Erhöhung<br />
der Gruppengrößen könnten diese Tendenzen geklärt werden.<br />
Verschiedene Faktoren, die sich auf den Efflux in hCMEC/D3-Zellen<br />
auswirken können, wurden untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die<br />
Mediumkomponente Hydrocortison während der Kultivierung und v.a. während der<br />
Behandlung mit Induktoren und Antiepileptika einen entscheidenden Einfluss auf das<br />
Ausmaß der Pgp-Funktionalität und der Modulation dieser hat.<br />
87
ERGEBNISSE<br />
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays<br />
Der Transport-Assay, der mit Hilfe des Transwell-Systems durchgeführt wird,<br />
dient der Erkennung von Substraten von Multidrug-Transportern. Zunächst wurden<br />
die Transportversuche nach dem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll<br />
durchgeführt; d.h. die sensitivere Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)<br />
wurde der bidirektionalen Methode vorgezogen. Um zu klären, ob die<br />
Versuchsbedingungen oder auch die Kultivierung der Zellen einen Einfluss auf den<br />
Nachweis eines Transports haben, wurden verschiedene Aspekte wie zum Beispiel<br />
die Dichtigkeit der Zellmembranen untersucht bzw. verändert. Zu diesem Zweck<br />
wurden TEER-Werte bestimmt und die Mannitol-Permeabilität der Zellmembranen<br />
untersucht.<br />
Ausgehend von der Hypothese, dass in einem dichten Zellmonolayer mit<br />
aktivem Pgp ein asymmetrischer Transport (von basolateral nach apikal) eines Pgp-<br />
Transports nachgewiesen und dieser durch einen Pgp-Inhibitor gehemmt werden<br />
kann, wurden die bekannten Pgp-Substrate Digoxin, Verapamil und Rhodamin 123 in<br />
den humanen Zellen getestet.<br />
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen<br />
Das Ausmaß der Dichtigkeit des Zellmonolayers und der Tight junctions wird<br />
zum einen durch den TEER-Wert, zum anderen durch die parazelluläre Permeabilität<br />
polarer Substanzen wie Mannitol bestimmt. Die Widerstand der BHS in vivo zeigt<br />
Werte bis zu 2000 Ω*cm 2 (LATERRA & GOLDSTEIN 2000). In In-vitro-<br />
Untersuchungen mit humanen Hirnkapillarendothelien wurden in Abhängigkeit der<br />
Präparation Werte zwischen 20 und 1400 Ω*cm 2 beschrieben (GRANT et al. 1998).<br />
Des Weiteren wurden beispielsweise in Monolayern von Nierenepithelzellen (LLC-<br />
Zellen), die regelmäßig für Transportstudien eingesetzt werden (POLLI et al. 2001;<br />
GARBERG et al. 2005; BALTES et al. 2007a & 2007b; LUNA-TORTÓS et al. 2008,<br />
2009 & 2010; KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010; ZHANG et al. 2010), im 6Well-<br />
Format i.d.R. TEER-Werte von durchschnittlich 800 Ω*cm 2 für LLC-Wildtypzellen<br />
gemessen. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen für diese Zellen in einem Bereich von<br />
ca. 4-6 nm/s (LÖSCHER et al. 2011). Um einen Eindruck der Dichtigkeit der<br />
hCMEC/D3-Zellen zu bekommen, wurden in einer Verlaufsuntersuchung über einen<br />
88
TEER (*cm 2 )<br />
ERGEBNISSE<br />
Zeitraum von sieben Tagen die TEER-Werte konfluenter Monolayer von hCMEC/D3-<br />
Zellen auf 6Well-Inserts bestimmt.<br />
Für diese Untersuchung, die am Tag 1 nach Erreichen der Konfluenz begann,<br />
wurden zwei verschiedenen Membraneinlagen der genannten Firmen Corning Costar<br />
Corporation und Greiner Bio-One GmbH sowie zwei Seren unterschiedlicher<br />
Herkunft verwendet. Laut einer Studie von POLLER et al. (2008) beeinflusst<br />
humanes Serum im Medium die Dichtigkeit der Zellschicht der humanen Zellen.<br />
Verlauf des Widerstands in hCMEC/D3-Zellen<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
72 96 120 144 168 192 216<br />
Stunden<br />
Corning humanes Serum Greiner humanes Serum<br />
Corning bovines Serum Greiner bovines Serum<br />
Abbildung 5.13: Bestimmung des Verlaufs der TEER-Werte für Membraneinlagen der Firmen<br />
Corning und Greiner sowie zwei Seren unterschiedlicher Herkunft in hCMEC/D3-Zellen auf<br />
6Well-Inserts. Die Messung begann am 1. Tag der Konfluenz. Die TEER-Werte verhielten sich<br />
über die ersten 5 Tage (120 h) relativ gleich, wobei die Zellen auf den Corning-Inserts generell<br />
höhere TEER-Werte aufwiesen. Ab Tag 5 zeigten die Zellen auf Corning-Membraneinlagen, die<br />
mit bovinem Serum kultiviert wurden, einen leichten Anstieg bis Tag 8 (ca. 192 h).<br />
Unterschiede zwischen humanem und bovinem Serum konnten nicht gezeigt werden. Die<br />
Zellen wurden am Tag 7 nach Erreichen der Konfluenz für einen Transport-Assay mit Digoxin<br />
eingesetzt. Der TEER wurde vor Beginn der Inkubation und nach Entnahme der letzten Proben<br />
bestimmt. Alle untersuchten Gruppen zeigten am Versuchsende einen Anstieg des TEERs (=<br />
letzter Probenzeitpunkt). Ein Transport von Digoxin war nicht nachweisbar. Die Werte sind als<br />
Mittelwerte angezeigt.<br />
Die Messung ergab unabhängig von Material oder Serum gleich niedrige<br />
TEER-Werte, die ihr Maximum am Tag 8 nach der Aussaat auf den Membran-Inserts<br />
89
ERGEBNISSE<br />
erreichten. Es fiel auf, dass die Zellen auf Corning-Inserts in diesen Untersuchungen<br />
stets höhere TEER-Werte zeigten. Im anschließenden Transportversuch war ein<br />
Transport von Digoxin auf diesen Membraneinlagen (Corning) nicht zu erkennen. Für<br />
weitere Transport-Assays wurden die Zellen weiterhin an Tag 7 spätestens an Tag<br />
10 der Konfluenz für den Transportversuch verwendet. Die Messung des<br />
Membranwiderstands als auch die Überprüfung der Mannitol-Permeabilität erfolgte<br />
weiterhin für jeden einzelnen Versuch vor und nach der Inkubation mit dem<br />
jeweiligen Substrat. In den Transport-Assays, in denen mit humanem Serum<br />
kultivierte Zellen untersucht wurden, zeigten im Vergleich zum bovinen Serum keine<br />
höheren TEER-Werte, die auf dichtere Zellschichten hinweisen. Aus diesem Grund<br />
wurden die Zellen für weitere Versuche mit bovinem Serum kultiviert. Die<br />
Permeabilitäten für Mannitol lagen zwischen 60-90 nm/s und waren damit<br />
mindestens 5-mal höher als die festgelegte Grenze von 12 nm/s (nach LUNA-<br />
TORTÓS et al. 2008) in LLC-Zellen.<br />
Weder die Kultivierung der Zellen noch die Transport-Assays schienen durch<br />
den Faktor Serum stark beeinflusst zu werden, denn die Mannitol-Permeabilitäten<br />
waren für die getesteten Seren etwa gleich hoch (61,5-89,7 nm/s). Des Weiteren<br />
zeigten sich nur leichte Unterschiede zwischen den transendothelialen<br />
Widerständen.<br />
90
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
humanes Serum<br />
hCMEC/D3 P:32<br />
n=3<br />
B<br />
bovines Serum<br />
hCMEC/D3 P:32<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
apikal<br />
basolateral<br />
150<br />
125<br />
100<br />
100<br />
75<br />
TEER: 21,3 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
75<br />
TEER: 21,3 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
C<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
bovines Serum<br />
LLC-Zellen<br />
* * * * *<br />
TEER: 208,6 *cm 2<br />
40<br />
0 120 240 360 480 600<br />
min<br />
Abbildung 5.14: CETA zur Untersuchung des Transports von Digoxin (10 nM) in hCMEC/D3-<br />
Zellen in Abhängigkeit des Serums (A & B) und im Vergleich mit LLC-Zellen (C) (K.<br />
Römermann). Konzentrationsveränderungen in den Kammern wurden über 6 h bzw. 10 h auf<br />
Membranen der Firma Greiner bzw. Corning im 6Well-Format gemessen. Die Zellen wurden am<br />
10. bzw. 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transport-Assay eingesetzt. Die Mannitol-<br />
Permeabilitäten für das humane Serum zeigten Werte von 62 nm/s und für das bovine Serum<br />
87,5 nm/s. Die Widerstände der Zellmonolayer lagen bei 21,3 Ω*cm 2 . Die Widerstände der LLC-<br />
Zellen zeigten Werte von 208,6 Ω*cm 2 , die Mannitol-Permeabilität war < 12 nm/s. Die Daten sind<br />
als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikanzen wurden mit einer Two-way ANOVA und dem<br />
Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.<br />
Die in Abbildung 5.14 dargestellten Versuche wurden mit Zellen durchgeführt,<br />
deren Kultivierung auf Greiner-Membraneinlagen erfolgte. Weitere<br />
Transportversuche mit Digoxin auf Membraneinlagen der Firma Corning ließen<br />
ebenfalls keinen asymmetrischen Transport dieser Substanz erkennen. Mit den<br />
Substanzen Verapamil und Rhodamin 123, bei denen es sich auch um Pgp-<br />
Substrate handelt, wurden das humane und das bovine Serum ebenfalls untersucht.<br />
91
ERGEBNISSE<br />
Für das Substrat Rhodamin 123 wurden in diesem Zusammenhang zusätzlich<br />
Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner miteinander verglichen (Daten<br />
nicht gezeigt). Aber auch in diesen Experimenten war es nicht möglich, einen<br />
Transport durch Pgp nachzuweisen. Die TEER-Werte in diesem nicht dargestellten<br />
Versuchen lagen in einem Bereich von 19,9–47,6 Ω*cm 2 . Dabei zeigten die<br />
Zellmonolayer, die mit dem humanen Serum kultiviert wurden, in den einzelnen<br />
Versuchen geringere Widerstände und höhere Mannitol-Permeabilitäten als die der<br />
Gruppe mit bovinem Serum. Humanes Serum hatte unter den hier beschriebenen<br />
Bedingungen scheinbar keinen Einfluss auf die Dichtigkeit der Monolayer und<br />
demzufolge auf die Detektion des Transports der Substrate Digoxin, Verapamil und<br />
Rhodamin 123 (Abbildung 5.15).<br />
In den LLC-Zellen, deren Kultivierung mit bovinem Serum erfolgte, wurden<br />
etwa 8-mal höhere TEER-Werte gemessen. Die Mehrheit anderer Arbeitsgruppen<br />
verwendet zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen ebenfalls bovines Serum. Aus<br />
diesem Grund entschieden wir uns ebenfalls für das bovine Serum zur weiteren<br />
Kultivierung der humanen Zellen für Transport-Assays.<br />
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays<br />
Die FDA empfiehlt für Studien, die den Transport durch Pgp bzw. die<br />
Funktionalität des MDTs untersuchen, die Substanz Digoxin. Diese wurde in der<br />
hiesigen Arbeitsgruppe in einer Konzentration von 10 nM in einem Gemisch mit<br />
radioaktiv markierten Digoxin verwendet. Für die Untersuchungen der Eignung der<br />
humanen Zellen für Transport-Assays wurde deshalb zunächst Digoxin verwendet.<br />
Der Nachweis eines asymmetrischen Digoxin-Transports in monokultivierten<br />
hCMEC/D3-Zellen war unabhängig vom Ursprung des Serums nicht möglich<br />
(Abbildung 5.14). Auch nach Untersuchung weiterer Parameter, wie zum Beispiel<br />
Membranmaterial, Mediumkomponenten oder Format der Membraneinlagen, konnte<br />
ein Transport von Digoxin nicht nachgewiesen werden.<br />
Deshalb wurden anschließend Verapamil, ebenfalls in einem Gemisch mit der<br />
radioaktiv markierten Substanz, und der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 für<br />
Transportversuche als Pgp-Substrat eingesetzt. In Abbildung 5.15 ist zur besseren<br />
Vergleichbarkeit der drei verwendeten Pgp-Substrate ein weiterer Versuch mit<br />
Digoxin dargestellt. In diesem Experiment konnte erneut kein asymmetrischer<br />
Transport festgestellt werden.<br />
92
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Digoxin<br />
% Verapamil<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150<br />
125<br />
Digoxin (10 nM)<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
apikal<br />
basolateral<br />
n=3<br />
B<br />
150<br />
125<br />
100<br />
Verapamil (10 nM)<br />
hCMEC/D3 P:33<br />
n=3<br />
TEER: 21,3 *cm 2<br />
100<br />
75<br />
TEER: 26,9 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
75<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
C<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
D<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
150<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* *<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* * *<br />
TEER: 22,1 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
TEER: 17,0 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
Abbildung 5.15: Verschiedene Transportuntersuchungen zu Digoxin (10 nM), Verapamil<br />
(10 nM) und Rhodamin 123 (2 µM) in hCMEC/D3-Zellen. Der Transport wurde über 6 h auf<br />
Membranen im 6Well-Format des Herstellers Greiner beobachtet. Die Zellen wurden in Medium<br />
mit bovinem Serum kultiviert und am 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch<br />
verwendet. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen 72–89 nm/s. Die Widerstände waren<br />
für alle vier gezeigten Versuche annähernd gleich. Ein Transport von Digoxin und Verapamil<br />
konnte nicht nachgewiesen werden. Für Rhodamin 123 war ein Transport über die ersten 60<br />
min (C) bzw. 90 min (D) des Versuchs nachweisbar. Im weiteren Verlauf dieser beiden Versuche<br />
mit Rhodamin 123 war ein asymmetrischer Transport nicht mehr festzustellen. Die Werte sind<br />
als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Two-way ANOVA<br />
und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet. Die<br />
Unterschiede zwischen den Verapamil-Konzentrationen in beiden Kammern (B) wurden nicht<br />
gekennzeichnet. Die basolaterale Konzentration war höher als die in der apikalen Kammer,<br />
weshalb nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen wurde.<br />
93
ERGEBNISSE<br />
Für Digoxin sowie auch für Verapamil konnte kein Transport nachgewiesen<br />
werden. Für Rhodamin 123 hingegen konnte in einem Experiment ein Transport<br />
dieser Substanz über die ersten 60 min festgestellt werden (5.15 C). Dieser war aber<br />
nach den folgenden Probenzeitpunkten nicht mehr nachweisbar. In einem einzelnen<br />
Versuch, der unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, konnte erneut ein<br />
Transport von Rhodamin 123 in den ersten 90 min nachgewiesen werden (5.15 D).<br />
In weiteren Wiederholungen dieses Experiments mit monokultivierten humanen<br />
Zellen war der Nachweis eines Transports nicht mehr möglich (Daten nicht gezeigt).<br />
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze<br />
Des Weiteren wurde der Einfluss der Zusammensetzung des Mediums<br />
untersucht. Das Medium und v.a. der zeitliche Ablauf einzelner Medien zur<br />
Kultivierung und zur Versorgung der Zellen ab Erreichen der Konfluenz wurde den<br />
Protokollen anderer Arbeitsgruppen nachempfunden. Besonders der Zusatz der<br />
Substanz Simvastatin (aus der Gruppe der Statine, lipidsenkend) in der<br />
Konzentration von 1 nM sollte großen Einfluss auf die Dichtigkeit der Zellmembran<br />
haben und wurde nach dem Protokoll von P.-O. Couraud dem Medium einen Tag vor<br />
dem Transportversuch zugefügt Dennoch ließ sich das in den durchgeführten<br />
Transport-Assays nicht zeigen. Es wurden Versuche mit und ohne den Zusatz von 1<br />
nM Simvastatin (1 Tag vor dem Versuch) durchgeführt. Ein entscheidender Einfluss<br />
auf den Transport war nicht zu erkennen.<br />
Zusätzlich zu Simvastatin wurden verschiedene Medien zur Kultivierung der<br />
humanen Zellen getestet. Zum einen wurde ein Basalmedium, welches mit Serum,<br />
Hydrocortison, Antibiotika, Lipidkonzentrat und einem Wachstumsfaktor (bFGF)<br />
versetzt wurde, verwendet. Dies entsprach dem normalen Kulturmedium, welches<br />
auf Seite 42 beschrieben ist. Zum anderen wurde dieses Kulturmedium mit den<br />
bereits genannten Inhaltsstoffen sowie noch weiteren Wachstumsfaktoren (Vascular<br />
Endothelial Growth Factor VEGF, Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1, Epidermal<br />
Growth Factor EGF) versetzt. Eine weitere, reduzierte Variante des Mediums wurde<br />
verwendet, sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben. Dieses Medium enthielt<br />
weniger Serum (2,5 %) und Wachstumsfaktoren (nur bFGF) und sollte die möglichen<br />
Wechselwirkungen des Kulturmediums mit den Versuchssubstanzen verringern.<br />
Dennoch hatten die Komponenten des Mediums und deren Konzentrationen keinen<br />
Einfluss auf das Ergebnis des Transport-Assays (Daten nicht gezeigt). Alle<br />
94
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
Zusammensetzungen der getesteten Medien sind im Anhang (siehe S. 215)<br />
aufgeführt.<br />
A<br />
+ 1 nM Simvastatin<br />
hCMEC/D3 P:37<br />
n=5<br />
B<br />
- Simvastatin<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=5<br />
150<br />
125<br />
apikal<br />
basolateral<br />
150<br />
125<br />
100<br />
100<br />
75<br />
TEER: 17,9 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
75<br />
TEER: 40,2 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
Abbildung 5.16: Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 (2 µM) in Abhängigkeit der<br />
Substanz Simvastatin. Der Transport wurde über 6 h auf Corning-Membranen im 6Well-Format<br />
beobachtet. Die Zellen wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch<br />
verwendet. Die Monolayer, die Simvastatin vor dem Versuchen erhielten, zeigten eine Mannitol-<br />
Permeabilität von 98 nm/s. Ohne Simvastatin lag die Permeabilität bei 75 nm/s. Die Zellen, die<br />
kein Simvastatin erhielten, zeigten 2-mal höhere Widerstände. Ein Transport von Rhodamin 123<br />
war nicht nachweisbar. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.<br />
Die verschieden hohen Konzentrationen an Rhodamin 123 in beiden Kammern (B) wurden<br />
nicht gekennzeichnet, weil die basolaterale Konzentration höher als die in der apikalen<br />
Kammer war. Aus diesem Grund wurde nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen.<br />
Ein Faktor, der ebenfalls Einfluss auf den Nachweis eines Transports haben<br />
kann, ist das Versuchsmedium. Dazu wurde zunächst das Versuchsmedium Opti-<br />
MEM ® getestet, welches weder Serum noch Wachstumsfaktoren enthielt. Dieses<br />
Medium wird in Transportversuchen mit anderen Zelllinien in der hiesigen<br />
Arbeitsgruppe standardmäßig eingesetzt. Ein Transport von Digoxin und Rhodamin<br />
123 in hCMEC/D3-Zellen konnte aber mit dem Medium Opti-MEM ® nicht<br />
nachgewiesen werden.<br />
Weiterhin wurde der sogenannte HBSS-Puffer für Transport-Assays<br />
verwendet (nach CARL et al. 2010). Diesem Puffer wurde kein Serum, sondern<br />
lediglich 1 mM Natriumpyruvat als Energiequelle und 10 mM HEPES als<br />
Puffersubstanz (u.a. Gewährleistung der Aufrechterhaltung der Enzymstrukturen und<br />
95
ERGEBNISSE<br />
-funktionen, Unabhängigkeit der Zellen vom pH-Wert) zugefügt. In zwei einzelnen<br />
Versuchen konnte auf diese Weise ein Transport von Rhodamin 123 festgestellt<br />
werden (Abbildung 5.15 C & D). Diese Ergebnisse waren aber auf 6Well-<br />
Membraneinlagen nicht reproduzierbar.<br />
5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials<br />
Ein weiterer beeinflussender Faktor ist das Material der Membraneinlagen, auf<br />
denen die Zellen für die Transportversuche kultiviert werden. Bisher wurden in der<br />
Arbeitsgruppe Membraneinlagen der Firma Corning verwendet. Aufgrund von<br />
Lieferproblemen wurde der Herstellungsprozess der Membranen geändert, was<br />
Einfluss auf die Versuchsergebnisse hatte. Es wurde notwendig, Membranen<br />
verschiedener Hersteller zu untersuchen. Für die humanen Zellen wurden<br />
Membraneinlagen der Firma Greiner und des bisherigen Herstellers Corning<br />
miteinander verglichen.<br />
Auffällig war, dass die Membraneinlagen der Firma Greiner (gleiche<br />
Porengröße, aber höhere Porendichte) für die hCMEC/D3-Zellen stets niedrigere<br />
TEER-Werte zeigten als die von Corning (siehe Abschnitt 5.1.4.1), obwohl die<br />
Mannitol-Permeabilität für beide Hersteller ähnlich hoch war. Einmalig wurden auch<br />
Membraneinlagen der Firma Millipore verwendet. Die Membran-Inserts der Firma<br />
Greiner schienen laut diesen Transport-Assays zur Untersuchung des Transports in<br />
hCMEC/D3-Zellen geeigneter zu sein. Dieser Versuch wurden unter den gleichen<br />
und auch leicht modifizierten Bedingungen mehrere Male wiederholt, dennoch<br />
konnte dieses Ergebnis nicht reproduziert werden. Nach diesen Versuchen kann<br />
keinem der Membraneinlagen-Hersteller ein Vorzug für Transportversuche der<br />
Konzentrationsgleichgewichtsmethode gegeben werden.<br />
96
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Greiner Inserts<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=5<br />
B<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:34<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
100<br />
apikal<br />
basolateral<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
* * TEER: 22,1 *cm 2<br />
75<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
TEER: 46,7 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
C<br />
150<br />
Millipore Inserts<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=3<br />
125<br />
100<br />
75<br />
TEER: 22,5 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.17: CETA mit 2 µM Rhodamin 123. Es wurde der Einfluss des<br />
Membranmaterials verschiedener Hersteller untersucht. Alle Gruppen erhielten am Tag vor<br />
dem Versuch 1 nM Simvastatin. Der Transport wurde über 6 bzw. 4 h auf Membranen im 6Well-<br />
Format beobachtet. Die Zellen wurden am 7. bzw. 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die<br />
Versuche verwendet. Die Monolayer auf Greiner-Inserts zeigten trotz niedrigeren Widerstands<br />
einen Transport von basolateral nach apikal innerhalb der ersten Stunde des Assays. Die<br />
Mannitol-Permeabilität in den Transportversuchen mit Rhodamin 123 zeigte einen Wert von 77<br />
nm/s, für die Monolayer auf Millipore-Inserts 112 nm/s. Ein Transport des Substrats Rhodamin<br />
123 war mit Inserts der Hersteller Corning und Millipore nicht festzustellen. Die Werte sind als<br />
Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und<br />
dem Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.<br />
Die ersten Transportexperimente wurden mit dem Material Polyester<br />
durchgeführt. In den Abschnitten 5.1.4.6 (Einfluss des Formats der<br />
Membraneinlagen) und 5.1.4.7 (Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit<br />
Astrozyten) ist neben einem anderen Format auch der Vergleich zwischen zwei<br />
97
ERGEBNISSE<br />
verschiedenen Materialien (Polyester und Polycarbonat) dargestellt, auf den genauer<br />
unter den genannten Punkten eingegangen wird.<br />
5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay<br />
Die ersten Versuche wurden mittels der<br />
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA), die sich für den Nachweis des<br />
Transports von Antiepileptika als sensitiver erwiesen hat, durchgeführt. Dies führte<br />
aber nur bedingt zum Nachweis eines asymmetrischen Transports, weshalb weitere<br />
Transportversuche mit der bidirektionalen Methode durchgeführt wurden. Andere<br />
Arbeitsgruppen, die Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen<br />
durchführen, verwenden ausschließlich den bidirektionalen Assay (POLLER et al.<br />
2008; CARL et al. 2010). Daher wurde dieser zum Vergleich mit dem CETA<br />
angewandt. Es wurde nur die Substanz Rhodamin 123 als Substrat eingesetzt.<br />
Digoxin wurden unter diesen Bedingungen nicht untersucht. Wenn die Transportratio<br />
einen Wert von mindestens 1,5 aufweist, spricht man von einem Transport.<br />
Mit der bidirektionalen Methode gelang es nicht, einen eindeutigen<br />
asymmetrischen Transport nachzuweisen. In Abbildung 5.18 A war ein geringer<br />
asymmetrischer Transport zu erkennen, der allerdings eine Transportrate von nur 1,2<br />
aufwies. Alle Transportraten für die hCMEC/D3-Zellen zeigten niedrigere Werte als<br />
1,5. Obwohl in diesem Zusammenhang Medien mit einem unterschiedlichem<br />
Ausmaß an Mediumszusätzen (v.a. Wachstumsfaktoren) getestet wurden, ließ dies<br />
keinen Einfluss erkennen. Die Mannitol-Permeabilität war stets höher als der<br />
Grenzwert von 12 nm/s. Es fiel auf, dass die Greiner-Membraneinlagen eine höhere<br />
Transportrate aufwiesen, aber die TEER-Werte niedriger ausfielen. Dies ist mit den<br />
Ergebnissen der Transportversuche nach der CETA-Methode vergleichbar. Deshalb<br />
wurde für weitere Transportversuche die Konzentrationsgleichgewichtsmethode<br />
angewandt.<br />
98
% Rhodamin 123<br />
% Digoxin<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
C<br />
100<br />
80<br />
60<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Greiner Inserts<br />
hCMEC/D3 P:32<br />
n=6<br />
TR: 1,2<br />
TEER: 20,6 *cm 2<br />
* * * *<br />
b-A<br />
a-B<br />
0<br />
0 15 30 45 60 75 90 105 120<br />
min<br />
100<br />
80<br />
60<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:36<br />
n=2<br />
TR: 1,12<br />
TEER: 49,0 *cm 2<br />
0<br />
0 15 30 45 60 75 90 105 120<br />
min<br />
*<br />
B<br />
D<br />
100<br />
80<br />
60<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Corning Inserts<br />
hCMEC/D3 P:35<br />
n=1<br />
TR: 1,04<br />
TEER: 53,2 *cm 2<br />
0<br />
0 15 30 45 60 75 90 105 120<br />
min<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
Corning Inserts; LLC-Wt<br />
Digoxin<br />
n=3<br />
TR: 3,8<br />
TEER: 378,8 *cm 2<br />
*<br />
* * * *<br />
0<br />
0 120 240 360 480 600<br />
min<br />
Abbildung 5.18: Bidirektionale Transport-Assays mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen<br />
(A-C) und Beispiel eines bidirektionalen Transports von Digoxin in LLC-Wildtyp (Wt)-Zellen von<br />
C. Luna-Tortós (D). Der Transport-Assay wurde über einen Zeitraum von 2 h (A-C) bzw. 6 h (D)<br />
auf Membranen im 6Well-Format der Hersteller Greiner (A) und Corning (B-D) durchgeführt. Die<br />
Zellen wurden am 7. bzw. 8. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch eingesetzt. Die<br />
Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 17,4 %/h (A), 11,4 %/h (B), und 9,9 (C) %/h. Die<br />
Widerstände für die hCMEC/D3-Zellen zeigten Werte von 20–53 Ω*cm 2 . Für den unter C<br />
gezeigten Versuch wurde Medium mit mehr Wachstumsfaktoren für die Zellkultivierung<br />
verwendet. Für A und B wurden die Zellen mit dem unter Material und Methoden beschriebenen<br />
Medium kultiviert. Die Transportratio lag für die unter A-C dargestellten Versuche < 1,5. Ein<br />
Transport von Rhodamin 123 konnte nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis eines<br />
asymmetrischen Transports von Digoxin (TR: 3,8) konnte in den LLC-Zellen erbracht werden.<br />
Der TEER lag bei 378,3 Ω*cm 2 .<br />
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den<br />
Digoxin-Konzentrationen in den beiden Kammern wurden mittels Two-way ANOVA und dem<br />
Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05).<br />
Abkürzung: TR: Transportratio<br />
99
ERGEBNISSE<br />
5.1.4.6 Einfluss des Formats der Membraneinlagen<br />
Das Format der Transwell-Inserts könnte ebenfalls einen Einfluss auf den<br />
Transportnachweis haben. Ein teilweiser Transport von Rhodamin 123 auf größeren<br />
Membranen im 6Well-Format (Fläche in Abhängigkeit vom Hersteller: 4,254 bzw.<br />
4,67 cm 2 ; siehe Tabelle 4.2) wurde nur in zwei einzelnen Versuchen nachgewiesen.<br />
Die hCMEC/D3-Zellen wurden deshalb auf 12Well-Membranen kultiviert, die eine<br />
kleinere Wachstumsfläche aufwiesen (1,12 cm 2 ; siehe Tabelle 4.2). Die Membranen<br />
bestanden aus Polyester (PET) bzw. Polycarbonat (PC) und stammten von Corning.<br />
Unabhängig vom Membranmaterial zeigten die Zellen im 12Well-Format wesentlich<br />
höhere TEER-Werte, die sich in einem Bereich von ca. 120 bis 165 Ω*cm 2 bewegten<br />
(siehe auch Tabelle 5.4, S. 107 ff.).<br />
Mit der Kultivierung der Zellen auf Membraneinlagen mit einer kleineren<br />
Wachstumsfläche konnte ein asymmetrischer Transport des Fluoreszenzfarbstoffs<br />
Rhodamin 123 in den humanen Zellen mit der CETA-Methode nachgewiesen<br />
werden. Der Vergleich der beiden verwendeten Formate der Membran-Inserts ist in<br />
der nachfolgenden Abbildung 5.19 dargestellt.<br />
5.1.4.7 Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit Astrozyten<br />
Ein weiterer Faktor, der Einfluss auf die Eignung der humanen Zellen im<br />
Transwell-Modell nehmen kann, ist die Kokultur mit Astrozyten. Dazu wurden die<br />
Astrozyten auf der Unterseite (der basolateralen Kammer zugewandt) der<br />
Membranen im 12Well-Format kultiviert, die humanen Hirnkapillarzellen wie gewohnt<br />
auf der Membran. Die nachfolgende Abbildung zeigt den Vergleich von<br />
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen auf 6- und 12Well-Membranen sowie den<br />
Vergleich zwischen Mono- und Kokultur dieser Zellen mit Astrozyten.<br />
100
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150<br />
125<br />
Monokultur, 6Well (PET)<br />
hCMEC/D3 P:31<br />
n=3<br />
apical<br />
basolateral<br />
B<br />
150<br />
125<br />
Monokultur, 12Well (PET)<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
* * *<br />
*<br />
*<br />
100<br />
100<br />
75<br />
TEER: 29,6 *cm 2<br />
50<br />
0 30 60 90 120<br />
min<br />
75<br />
TEER: 119,0 *cm 2<br />
50<br />
0 30 60 90 120 150 180 210 240<br />
min<br />
C<br />
Kokultur, 12Well (PET)<br />
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7<br />
n=6<br />
D<br />
Kokultur, 12Well (PC)<br />
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
100<br />
* * *<br />
150<br />
125<br />
100<br />
*<br />
*<br />
*<br />
* *<br />
75<br />
TEER: 155,2 *cm 2<br />
50<br />
0 30 60 90 120 150 180 210 240<br />
min<br />
75<br />
TEER: 162,6 *cm 2<br />
50<br />
0 30 60 90 120 150 180 210 240<br />
min<br />
Abbildung 5.19: Zwei vergleichende Transport-Assays (CETA) mit monokultivierten (A & B) und<br />
kokultivierten hCMEC/D3-Zellen (C & D) und 2 µM Rhodamin. Die Kultivierung der Zellen<br />
erfolgte auf Membraneinlagen der Firma Corning im 6Well-Format (A) bzw. 12Well-Format (B-<br />
D). Die Membranen bestanden aus Polyester (A-C) bzw. aus Polycarbonat (D). Die Zellen<br />
wurden an Tag 10 und 7 nach Erreichen der Konfluenz für den Transport-Assay verwendet.<br />
Veränderungen der Rhodamin-Konzentration in der apikalen und basolateralen Kammer<br />
wurden über 2 h (A) bzw. 4 h (B-D) beobachtet. Die TEER-Werte waren im Vergleich zu denen<br />
monokultivierter hCMEC/D3-Zellen auf Membraneinlagen im 6Well-Format etwa 4-mal erhöht (A<br />
& B). Die Mannitol-Permeabilitäten lagen für die Monokultur auf 12Well-Membraneinlagen (B)<br />
bei 366,5 nm/s und für die Kokultur auf Polyethylen-Membraneinlagen (C) bei 24 nm/s. Die<br />
kokultivierten Zellen auf Polycarbonat-Membraneinlagen (D) zeigten eine Mannitol-<br />
Permeabilität von 191,5 nm/s. Für den unter A dargestellten Versuch wurde Mannitol nicht<br />
untersucht. Die mit Astrozyten kokultivierten humanen Zellen auf 12Well-Membraneinlagen<br />
wiesen höhere TEER-Werte und i.d.R. niedrigere Mannitol-Permeabilitäten als monokultivierte<br />
Zellen auf.<br />
Ein Transport von Rhodamin 123 (2 µM) in monokultivierten hCMEC/D3-Zellen und deren<br />
Kokultur mit Astrozyten konnte gezeigt werden (B-D). Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM<br />
101
ERGEBNISSE<br />
angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und dem Bonferroni-<br />
Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.<br />
Mit der Kultur der humanen Zellen auf 12Well-Membraneinlagen konnte ein<br />
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden. Diese<br />
Kultivierung ging mit einer Erhöhung des TEER-Werts einher. Die Kokultur mit<br />
Astrozyten führte zu einer erneuten Steigerung des TEER-Werts sowie einer<br />
niedrigeren Mannitol-Permeabilität. Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin<br />
123 wurde festgestellt. Die Permeabilität für Mannitol wurde für die monokultivierten<br />
Zellen auf 6Well-Membraneinlagen (5.19 A) nicht untersucht. Die Mannitol-<br />
Permeabilitäten der kokultivierten Zellen zeigten starke Schwankungen, wobei keine<br />
Korrelationen mit den TEER-Werten festgestellt wurden. Der Widerstand zeigte 4-7-<br />
fach erhöhte Werte für die kokultivierten Zellen. Die Konzentrationsveränderungen<br />
verliefen außerdem gleichmäßiger über die Versuchsdauer und zeigten keinen<br />
Abfall. Die Unterschiede des Substratgehalts zwischen apikaler und basolateraler<br />
Kammer fielen für die Membranen aus Polycarbonat deutlicher aus. Des Weiteren<br />
zeigten die Monolayer der Zellen auf den Membran-Inserts aus Polycarbonat höhere<br />
TEER-Werte.<br />
Der Transport von Digoxin konnte in monokultivierten hCMEC/D3-Zellen nicht<br />
nachgewiesen werden. Der Nachweis für Rhodamin-Transport in diesen Zellen<br />
wurde mit der Kokultur mit Astrozyten möglich. Deshalb wurde Digoxin ebenfalls in<br />
den kokultivierten humanen Zellen untersucht.<br />
102
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Digoxin (10 nM), Monokultur<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
B<br />
Digoxin (10 nM), Kokultur<br />
hCMEC/D3 P:4 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
apical<br />
basolateral<br />
150<br />
125<br />
100<br />
100<br />
75<br />
TEER: 127,4 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
75<br />
TEER: 159,8 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.20: Transport-Assays (CETA) mit 10 nM Digoxin in mono- und kokultivierten<br />
hCMEC/D3-Zellen. Die Zellen wurden auf Membraneinlagen (Corning) im 12Well-Format<br />
kultiviert und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transportversuch eingesetzt.<br />
Konzentrationsveränderungen wurden über einen Zeitraum von 4 h beobachtet. Die TEER-<br />
Werte waren im Vergleich zu denen monokultivierter hCMEC/D3-Zellen höher. Die Mannitol-<br />
Permeabilität lag bei einem Wert von 366 nm/s für die monokultivierten Zellen, für die Kokultur<br />
lag diese bei 191 nm/s. Ein Transport von Digoxin konnte nicht gezeigt werden. Die Daten sind<br />
als Mittelwerte ± SEM angegeben.<br />
Die Steigerung des TEER durch die Kultivierung der humanen<br />
Hirnkapillarendothelien auf kleineren Membran-Inserts und deren Kokultur mit<br />
Astrozyten konnte mit diesem Transportversuch bestätigt werden. Ein Transport von<br />
Digoxin wurde nicht nachgewiesen.<br />
5.1.4.8 Überprüfung des Transports durch Pgp<br />
Der Transport von Rhodamin 123 konnte in kokultivierten und teilweise in<br />
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen nachgewiesen werden. Ob dieser Transport<br />
spezifisch war und auf die Funktionalität von Pgp zurückzuführen war, wurde mit<br />
spezifischen Pgp-Inhibitoren wie zum Beispiel Valspodar (PSC833) und Tariquidar<br />
überprüft. Die Zellen wurden dazu zeitgleich mit dem Substrat Rhodamin 123 und<br />
dem Inhibitor inkubiert. Wenn die Konzentrationsveränderungen in den Kammern<br />
des Transwell-Systems durch spezifischen Transport von Pgp hervorgerufen wurden,<br />
sollte der Transport durch die Inhibitoren gehemmt werden. Die nachfolgende<br />
Abbildung zeigt beispielhafte Versuche, in denen der Transport von Rhodamin<br />
festgestellt wurde und Inhibitoren zur Überprüfung des Transports mitgeführt wurden.<br />
103
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
* * *<br />
apikal<br />
basolateral<br />
*<br />
AUC/h: 785,3<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
*<br />
TEER: 119,0 *cm 2<br />
B<br />
150<br />
125<br />
100<br />
75<br />
*<br />
+ PSC833 (10 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30<br />
n=3<br />
*<br />
*<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
*<br />
AUC/h: 760<br />
TEER: 131,3 *cm 2<br />
Veränderung<br />
der AUC/h<br />
- 3,2 %<br />
C<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
D<br />
+ PSC833 (10 µM)<br />
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15<br />
n=3<br />
150<br />
125<br />
100<br />
* * *<br />
* *<br />
150<br />
125<br />
100<br />
*<br />
*<br />
* * *<br />
- 44,1 %<br />
75<br />
AUC/h: 716,3<br />
TEER: 162,6 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
75<br />
AUC/h: 400,3<br />
TEER: 164,9 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
E<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7<br />
n=6<br />
F<br />
+ TQD (0,5 µM)<br />
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7<br />
n=5<br />
150<br />
125<br />
100<br />
* * *<br />
150<br />
125<br />
100<br />
- 56,9 %<br />
75<br />
AUC/h: 147,4<br />
TEER: 155,2 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
75<br />
AUC/h: 63,5<br />
TEER: 163,1 *cm 2<br />
50<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.21: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen in<br />
Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–F) auf Transwell-Inserts im<br />
12Well-Format (Corning). Die Experimente wurden über eine Dauer von 4 h durchgeführt. Die<br />
Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat (A–D) und Polyester (E & F) kultiviert<br />
und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Graph A, C und E<br />
zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen von Rhodamin 123 gemessen<br />
104
ERGEBNISSE<br />
wurden. Unter B, D und F sind Versuche dargestellt, in denen die Inhibition des Substrats<br />
durch Hemmstoffe Valspodar (PSC833) und Tariquidar (TQD) untersucht wurde. Alle<br />
Experimente zeigten einen asymmetrischen Transport von Rhodamin 123. Die Inhibition des<br />
Rhodamin-Transports konnte nicht oder nur teilweise nachgewiesen werden. Die AUC<br />
verringerte sich um maximal 56,9 % im Vergleich zum Transport (B, D und F). Für die<br />
monokultivierten Zellen (A & B) wurden niedrigere TEER-Werte gemessen als für die<br />
kokultivierten Zellen. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 366,5 nm/s für die<br />
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen (A & B). Für die mit Astrozyten kokultivierten Zellen wurden<br />
Mannitol-Permeabilitäten von 191,5 nm/s (C & D) bzw. 24 nm/s (E & F) festgestellt.<br />
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer<br />
Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05)<br />
angezeigt.<br />
Die Abbildung 5.21 zeigt, dass der asymmetrische Transport von Rhodamin<br />
123 nicht vollständig durch die spezifischen Pgp-Inhibitoren PSC833 und Tariquidar<br />
gehemmt wurde. Die Graphen B, D und F zeigen jeweils die Ergebnisse nach<br />
Inkubation mit den Inhibitoren. Dabei fielen die Konzentrationsunterschiede zwischen<br />
den Kammern zwar niedriger aus als ohne Inhibitor (C & E), aber sie waren<br />
zumindest für Abbildung 5.21 B & D noch signifikant. Der Transport-Assay (unter<br />
Graph E dargestellt) zeigte leichte Konzentrationsunterschiede zwischen der<br />
apikalen und basolateralen Kammer, die auf einen Transport von Rhodamin 123<br />
hinweisen. Dieser Transport wurde durch die Zugabe von 0,5 µM Tariquidar<br />
vollständig aufgehoben. Der jeweilige Netto-Transport pro Stunde, der als Fläche<br />
unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) angegeben ist, sollte nach Zugabe<br />
eines Inhibitors um mindestens 50 % verringert sein. Die AUC zeigte nach der<br />
Inkubation mit den Inhibitoren niedrigere Werte als ohne, der Netto-Transport/h sank<br />
um 44,1-56,9 % (D & F). Einmalig verringerte sich die AUC um 3,2 % (B). Die AUC<br />
fiel für die Transportversuche auf Polyester-Membranen (E & F) geringer aus als für<br />
die Polycarbonat-Inserts (A-D).<br />
Die Mannitol-Permeabilitäten für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen lagen<br />
bei 366,5 nm/s, damit waren diese im Vergleich zu den kokultivierten Zellen etwa 2-<br />
(C & D) bzw. 15-fach erhöht (E & F).<br />
105
ERGEBNISSE<br />
5.1.4.9 Integrität der Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität<br />
Die folgende Tabelle 5.4 gibt eine Übersicht zu allen gemessenen TEER-<br />
Werten und Mannitol-Permeabilitäten der Transportversuche nach der bidirektionalen<br />
und CETA-Methode in hCMEC/D3-Zellen. Es fiel zunächst auf, dass die Zellen auf<br />
Corning-Inserts im 6Well-Format etwa 2-mal höhere TEER-Werte zeigten als auf den<br />
anderen verwendeten Membran-Inserts (Greiner und Millipore). Dies galt für beide<br />
angewandten Methoden der Transport-Assays. Bezüglich der Seren waren keine<br />
großen Unterschiede zu verzeichnen. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten für<br />
dieses Format keine nennenswerten Unterschiede.<br />
Besonders auffällig waren die verschiedenen hohen TEER-Werte und<br />
Mannitol-Permeabilitäten zwischen Membran-Inserts im 6- und 12Well-Format. Die<br />
Widerstände der kleineren Membranen waren ca. 5- bis 7-mal höher, gleichzeitig<br />
erhöhten sich die Mannitol-Permeabilitäten um etwa das Doppelte oder sogar<br />
Dreifache der 6Well-Membraneinlagen, was keinen Rückschluss auf dichtere<br />
Membranen im 12Well-Format zulässt. Allerdings führte die Kokultur der hCMEC/D3-<br />
Zellen mit Astrozyten bei der Verwendung von 12Well-Membranen zu einer<br />
Erhöhung der TEER-Werte und einer Erniedrigung der Mannitol-Permeabilitäten. Die<br />
Werte für Mannitol waren trotz dessen höher als im Vergleich mit den größeren<br />
6Well-Membraneinlagen.<br />
106
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.4: Übersicht der TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten in Bezug auf<br />
Literaturdaten und die untersuchten Parameter Membranhersteller, -material und –<br />
format, Serum und Kokultur in Transportversuchen mit hCMEC/D3-Zellen dieser<br />
These.<br />
Daten der Literatur<br />
Zelllinie/<br />
Zellen<br />
Serum<br />
Kokultur<br />
TEER<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Parazelluläre<br />
Permeabilität<br />
(nm/s)<br />
Referenz<br />
hCMEC/D3<br />
Bovin<br />
Nein<br />
40<br />
Sucrose: 27,5<br />
WEKSLER et al. 2005<br />
hCMEC/D3<br />
Bovin<br />
70<br />
Sucrose: 2,81<br />
CUCULLO et al. 2008<br />
hCMEC/D3<br />
Human<br />
Nein<br />
k. A.<br />
Sucrose: 15,8<br />
POLLER et al. 2008<br />
hCMEC/D3<br />
Human<br />
Nein<br />
50-70<br />
k. A.<br />
VU et al. 2009<br />
hCMEC/D3<br />
Bovin<br />
Nein<br />
k. A.<br />
Mannitol: 24,7<br />
CARL et al. 2010<br />
hCMEC/D3<br />
Human<br />
Nein/Ja<br />
43/63<br />
k. A.<br />
HATHERELL et al. 2011<br />
hCMEC/D3<br />
Bovin<br />
Nein<br />
10<br />
k. A.<br />
LOPEZ-RAMIREZ et al.<br />
2012<br />
hCMEC/D3<br />
Human<br />
Nein<br />
15-30<br />
k. A.<br />
URICH et al. 2012<br />
LCC<br />
Bovin<br />
Nein<br />
800<br />
Mannitol: 4-6<br />
LÖSCHER et al. 2011<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Ja<br />
169-500<br />
Fluorescein: 1,87<br />
PERRIÈRE et al. 2005<br />
(Ratte)<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Nein<br />
400-700<br />
Mannitol: 18<br />
FRANKE et al. 2000<br />
(Schwein)<br />
107
ERGEBNISSE<br />
-format<br />
Corning,<br />
Polyester,<br />
6Well<br />
Membranmaterial/<br />
Daten der These<br />
Serum Kokultur<br />
Mannitol- Mannitol-<br />
TEER<br />
Asymmetr.<br />
Permeabilität Permeabilität<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Transport<br />
(nm/s)<br />
(%/h)<br />
Human Nein 39,7 85,7 24,8 -<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Bovin Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Ja<br />
Ja<br />
Ja<br />
51,4<br />
46,7<br />
39,2<br />
46,7<br />
32,7<br />
46,7<br />
40,2<br />
32,7<br />
32,7<br />
29,6<br />
28,0<br />
38,1<br />
51,4<br />
53,7<br />
53,7<br />
51,4<br />
49,0<br />
51,4<br />
43,2<br />
49,0<br />
37,4<br />
37,4<br />
32,7<br />
62,5<br />
n.d.<br />
78,9<br />
75,3<br />
152,9<br />
69,6<br />
75,0<br />
n.d.<br />
n.d.<br />
10,1<br />
n.d.<br />
11,0<br />
14,0<br />
16,5<br />
10,4<br />
11,8<br />
n.d.<br />
n.d.<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
13,7<br />
-<br />
13,7<br />
-<br />
11,4<br />
-<br />
8,2<br />
-<br />
8,2<br />
-<br />
10,4<br />
-<br />
10,4<br />
-<br />
9,9<br />
-<br />
9,9<br />
-<br />
12,3<br />
-<br />
12,3<br />
-<br />
13,0<br />
-<br />
13,0<br />
-<br />
86,9<br />
15,1<br />
-<br />
42,4 ± 8,2 85,9 ± 28,2 11,8 ± 2,1<br />
35,5<br />
88,6<br />
14,0<br />
-<br />
29,9<br />
77,5<br />
13,7<br />
-<br />
44,8<br />
107,9<br />
11,5<br />
-<br />
36,7 ± 6,1 91,3 ± 12,6 13,1 ± 1,1<br />
Gesamt 41,7 ± 8,2 87,5 ± 24,7 11,9 ± 2,1<br />
Alle<br />
41,7 ± 8,1 87,3 ± 23,6 12,5 ± 3,3<br />
Seren<br />
108
ERGEBNISSE<br />
Serum<br />
Kokultur<br />
TEER<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Membranmaterial/<br />
-format<br />
Mannitol-<br />
Permeabilität<br />
(nm/s)<br />
Mannitol-<br />
Permeabilität<br />
(%/h)<br />
Asymm.<br />
Transport<br />
Nein<br />
21,3<br />
61,5<br />
34,6<br />
-<br />
Human<br />
Nein<br />
Nein<br />
21,3<br />
19,9<br />
83,4<br />
83,4<br />
22,4<br />
22,4<br />
-<br />
-<br />
20,8 ± 0,7 76,1 ± 10,3 26,5 ± 5,8<br />
Nein<br />
26,9<br />
89,9<br />
10,7<br />
-<br />
Nein<br />
21,3<br />
89,7<br />
17,0<br />
-<br />
Nein<br />
21,3<br />
77,2<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
88,1<br />
17,0<br />
-<br />
Nein<br />
21,3<br />
71,5<br />
16,5<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
254,8<br />
30,3<br />
-<br />
Nein<br />
22,1<br />
77,2<br />
13,6<br />
(+)<br />
Greiner,<br />
Nein<br />
17,0<br />
92,5<br />
18,5<br />
(+)<br />
Polyester,<br />
Nein<br />
17,1<br />
64,5<br />
19,7<br />
-<br />
6Well<br />
Bovin<br />
Nein*<br />
17,0<br />
n.d.<br />
n.d.<br />
-<br />
Nein<br />
17,4<br />
98,4<br />
21,0<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
84,5<br />
19,0<br />
-<br />
Nein<br />
21,3<br />
71,5<br />
16,5<br />
-<br />
Nein<br />
20,6<br />
#<br />
17,4<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
n.d<br />
n.d<br />
-<br />
Nein*<br />
17,0<br />
n.d.<br />
n.d<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
91,4<br />
18,7<br />
-<br />
Nein<br />
17,0<br />
85,0<br />
20,6<br />
-<br />
19,0 ± 2,8 95,4 ± 45,2 18,3 ± 4,2<br />
Alle<br />
Seren<br />
19,3 ± 2,7 92,0 ± 41,9 19,8 ± 5,5<br />
Millipore,<br />
Nein<br />
22,5<br />
112,0<br />
21,1<br />
-<br />
Polyester,<br />
Bovin<br />
Nein*<br />
22,5<br />
112,0<br />
21,1<br />
-<br />
6Well<br />
22,5 ± 0 112,0 ± 0 21,0 ± 0<br />
Gesamt 6Well Nein 31,5 ± 13,0 90,1 ± 37,7 15,7 ± 5,8<br />
Gesamt 6Well Ja 36,7 ± 6,1 91,3 ± 12,6 13,1 ± 1,1<br />
Gesamt 6Well 31,9 ± 12,8 90,2 ± 35,9 15,5 ± 5,6<br />
109
ERGEBNISSE<br />
Serum<br />
Kokultur<br />
TEER<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Membranmaterial/<br />
-format<br />
Mannitol-<br />
Permeabilität<br />
(nm/s)<br />
Mannitol-<br />
Permeabilität<br />
(%/h)<br />
Asymm.<br />
Transport<br />
Nein<br />
127,4<br />
366,5<br />
35,7<br />
-<br />
Nein*<br />
136,5<br />
366,5<br />
35,7<br />
-<br />
Nein<br />
39,2<br />
78,9<br />
5,6<br />
-<br />
Corning,<br />
Polyester,<br />
12Well +<br />
Bovin<br />
Ja<br />
Ja*<br />
Ja<br />
101,0 ± 43,9 270,6 ± 135,6 25,7 ± 14,2<br />
159,8<br />
191,5<br />
27,8<br />
165,8<br />
191,5<br />
27,8<br />
155,2<br />
112,0<br />
21,1<br />
-<br />
-<br />
+<br />
Ja*<br />
163,1<br />
112,0<br />
21,1<br />
-<br />
161,0± 4,0 151,8 ± 39,8 24,5 ± 3,4<br />
Gesamt 135,3 ± 41,4 202,7 ± 110,6 25,0 ± 9,6<br />
Nein<br />
119,0<br />
366,5<br />
35,7<br />
+<br />
Corning,<br />
Polycarbonat,<br />
12Well +<br />
Bovin<br />
Nein*<br />
Ja<br />
Ja*<br />
131,3<br />
366,5<br />
35,7<br />
125,2 ± 6,2 366,5 ± 0 35,7 ± 0<br />
162,6<br />
191,5<br />
27,8<br />
164,9<br />
191,5<br />
27,8<br />
163,8 ± 1,2 191,5 ± 0 27,8 ± 0<br />
+<br />
+<br />
+<br />
Gesamt 144,5 ± 19,8 279,0 ± 87,5 31,8 ± 4,0<br />
Gesamt 12Well Nein 110,7 ± 36,2 309,0 ± 115,0 29,7 ± 12,0<br />
Gesamt 12Well Ja 161,9 ± 3,5 165,0 ± 37,5 25,6 ± 3,2<br />
Gesamt 12Well 138,6 ± 35,4 230,4 ± 109,2 27,4 ± 8,7<br />
k. A. keine Angaben n.d. Messung nicht durchgeführt<br />
+ asymmetrischer Transport - kein asymmetrischer Transport<br />
(+) asymmetrischer Transport nicht über gesamte Versuchsdauer messbar<br />
* Messung nach Zugabe eines Inhibitors (Tariquidar oder Valspodar)<br />
#<br />
nur eine Probe zur Bestimmung der Mannitol-Permeabilität entnommen; eine<br />
Steigung konnte deshalb nicht berechnet werden; Angabe in (%/h); keine<br />
Berücksichtigung in MW und Standardabweichung<br />
Die meisten Daten für die Mannitol-Permeabilität wurden in nm/s angegeben, wobei<br />
die Längeneinheit Bezug zur jeweiligen Wachstumsfläche nimmt. Letztlich befanden sich alle<br />
diese Daten in einem Bereich von 15,5-27,4 %/h (Gesamt 6- und 12Well) Wobei der<br />
Grenzwert bei 1 %/h liegt, der nicht überschritten werden sollte (LUNA-TORTÓS et al. 2008).<br />
110
ERGEBNISSE<br />
5.1.4.10 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen<br />
Für die Untersuchung des Transports in hCMEC/D3-Zellen wurden viele<br />
verschiedene Parameter untersucht und modifiziert. Es wurde deutlich, dass ein<br />
asymmetrischer Transport der radioaktiv markierten Substanzen Digoxin und<br />
Verapamil nicht detektierbar war. Der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 hingegen<br />
wurde aktiv von Pgp von der basolateralen in die apikale Kammer transportiert.<br />
Die Ergebnisse für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen waren aber<br />
inkonsistent. Lediglich in zwei von 35 einzelnen Versuchen nach der<br />
Konzentrationsgleichgewichtsmethode konnte der Transport von Rhodamin 123 auf<br />
6Well-Membranen der Firma Greiner nachgewiesen werden, obwohl die Zellen auf<br />
Corning-Membranen höhere transendotheliale Widerstände zeigten (Corning: 41,7 ±<br />
8,2 Ω*cm 2 ; Greiner: 19,3 ± 2,7 Ω*cm 2 ). Die Kultivierung der humanen Zellen auf<br />
kleineren Inserts (12Well-Format; Hersteller: Corning) führte zu einem Anstieg des<br />
TEER, der mit einer höheren Mannitol-Permeabilität einherging (6Well: TEER: 31,9 ±<br />
12,8 Ω*cm 2 und P app(Mannitol) : 90,2 ± 35,9 nm/s; 12Well: TEER: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2<br />
und P app(Mannitol) : 230,4 ± 109,2 nm/s).<br />
Mit der Kokultivierung der Endothelzellen mit Astrozyten ließ sich der TEER<br />
nochmals steigern (Monokultur: 110,7 ± 36,2 Ω*cm 2 vs. Kokultur 161,9 ± 3,5 Ω*cm 2 )<br />
und die Mannitol-Permeabilität sank (Monokultur: 309,0 ± 115,0 Ω*cm 2 vs. Kokultur:<br />
165,0 ± 37,5 nm/s). Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte<br />
detektiert werden. Dabei wurden die größten Konzentrationsunterschiede zwischen<br />
der apikalen und basolateralen Kammer für Membraneinlagen aus Polycarbonat<br />
(Corning) festgestellt. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen stets weit über der<br />
festgelegten Grenze von 12 nm/s (nach LUNA-TORTÓS et al. 2008), unabhängig<br />
vom Material der Membran-Inserts und vom Serum waren die Werte durchschnittlich<br />
für das 6Well-Format etwa 8-mal und für das 12Well-Format ca. 18-mal höher als der<br />
Grenzwert (siehe Tabelle 5.4). Deshalb muss man davon ausgehen, dass die<br />
Monolayer der hCMEC/D3-Zellen keine ausreichende Integrität aufwiesen und<br />
demzufolge der Transport von Antiepileptika nicht untersucht wurde.<br />
Der asymmetrische Rhodamin-Transport konnte mit den Pgp-Inhibitoren<br />
Valspodar und Tariquidar nur in einem von insgesamt acht durchgeführten<br />
Versuchen mit Inhibitoren vollständig gehemmt werden (Abbildung 5.21 F). Die AUC<br />
verringerte sich im Vergleich ohne Inhibitor um über 50 %.<br />
111
ERGEBNISSE<br />
In der Tabelle 5.5 sind alle Resultate der Transport-Assays, die mit der CETA-<br />
Methode untersucht wurden, zusammengefasst und sollen eine Übersicht der<br />
getesteten Parametern geben, die zum Einsatz der hCMEC/D3-Zellen für Transport-<br />
Assays modifiziert wurden. Ein asymmetrischer Transport der Substanzen Digoxin<br />
und Verapamil konnte nicht festgestellt werden. Für Rhodamin 123 konnte aktiver<br />
Pgp-vermittelter asymmetrischer Transport in hCMEC/D3-Zellen nachgewiesen<br />
werden.<br />
Diese Übersicht macht deutlich, dass die für die Untersuchung des Transports<br />
von Antiepileptika notwendigen Bedingungen mit den hCMEC/D3-Zellen nicht<br />
gefunden wurden. Einzelne Ergebnisse sind in den Abschnitten 5.1.4.1 bis 5.1.4.8<br />
nachzulesen.<br />
112
Inhibition des Transports<br />
+ asymmetrischer Transport nachgewiesen - asymmetrischer Transport nicht nachweisbar<br />
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.5: Übersicht der untersuchten Parameter für Transport-Assays mit der humanen Zelllinie hCMEC/D3. In den<br />
Experimenten wurden mehr Parameter variiert als hier angeben sind. Die für die Optimierung der Transportversuche mit<br />
den humanen Zellen relevanten Aspekte sind in der Tabelle angezeigt.<br />
Pgp-Substrat<br />
Membranfilter<br />
Hersteller Material<br />
Format Kokultur<br />
Asymmetrischer<br />
Transport<br />
113<br />
Digoxin<br />
10 nM<br />
Rhodamin 123<br />
2 µM<br />
Verapamil<br />
10 nM<br />
- unvollständig<br />
AUC/h: 760 (- 3,2 %)<br />
unvollständig<br />
AUC/h: 400,3 (- 44,1 %)<br />
- -<br />
Polyester 6Well<br />
Corning<br />
+ - -<br />
Polycarbonat 12Well<br />
- - -<br />
+ - -<br />
Greiner Polyester<br />
6Well - - -<br />
12Well nicht untersucht<br />
Polyester 6Well<br />
- - -<br />
+ - -<br />
+<br />
-<br />
Corning<br />
AUC/h: 785,3<br />
Polycarbonat 12Well<br />
+<br />
+<br />
AUC/h: 716,3<br />
147,4<br />
63,5 (- 56,9 %)<br />
Greiner Polyester<br />
6Well - + nicht untersucht<br />
12Well nicht untersucht<br />
Corning<br />
Polyester<br />
Polycarbonat<br />
6Well/12Well nicht untersucht<br />
6Well - - nicht untersucht<br />
Polyester<br />
Greiner<br />
12Well nicht untersucht<br />
Polycarbonat nicht untersucht
ERGEBNISSE<br />
5.2 Primärkulturen des Hirnendothels der Ratte (rBCEC)<br />
Die immortalisierte Zelllinie hCMEC/D3 wurde im Hinblick auf ihre Eignung als<br />
BHS-Modell untersucht. Aufgrund möglicher Veränderungen dieser Zellen durch die<br />
fehlende natürliche Umgebung zu anderen Zelltypen wie z.B. Astrozyten und<br />
Perizyten, den Immortalisierungsprozess und der unzureichenden Dichtigkeit des<br />
Monolayers, wurden zum Vergleich Zellen des Hirnkapillarendothels zweier<br />
Rattenstämme (CD ® -IGS und Wistar) präpariert und Primärkulturen hergestellt. Die<br />
CD ® -IGS-Ratten werden im Weiteren nur mit der Abkürzung CD bezeichnet. Diese<br />
wurden vorrangig in Transport-Assays eingesetzt. Die Funktionalität des MDT Pgp<br />
wurde aber auch in einzelnen Kumulationsversuchen untersucht.<br />
Es wurden zwei Rattenstämme für die Präparation verwendet, um anhand<br />
möglicher Unterschiede bei der Präparation, Kultivierung und der im Weiteren<br />
beschriebenen Versuche den geeigneteren Stamm für Primärkulturen und die<br />
Fragestellung finden zu können.<br />
5.2.1 Pgp-Expression in rBCEC-Zellen: Western Blot<br />
Die Pgp-Expression in den primären Rattenhirnendothelzellen aus Wistar-<br />
Ratten wurde in zwei unterschiedlichen Passagen untersucht, Passage 1 und 3. Die<br />
Pgp-Signale der Zellen wurden ebenfalls auf den Housekeeper ß-Aktin normiert.<br />
Primärkulturen können nicht beliebig oft passagiert werden, da sie im Laufe<br />
der Kultivierungsdauer ihre typischen Eigenschaften wie z.B. die Expression von<br />
Transportern verlieren können. Deshalb wurden die rBCEC-Zellen nur mit den<br />
Passagen 1 und 2 in Kumulations- und Transportversuchen eingesetzt. Der Western<br />
Blot, der die Pgp-Expression in den Passagen 1 und 3 untersuchte, zeigte, dass die<br />
Expression von Pgp in der höheren Passage der primären Hirnendothelzellen um<br />
etwa die Hälfte reduziert war.<br />
114
Pgp-Epression<br />
(%; normiert auf ß-Aktin)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
B<br />
Pgp-Expression in rBCEC-Zellen<br />
60 *<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
Passage 1 Passage 3<br />
Abbildung 5.22: Ergebnis eines Western Blots mit primären Rattenhirnendothelzellen des<br />
Stamms Wistar. Die Expression wurde in zwei verschiedenen Passagen der Zellen untersucht<br />
und entsprechend graphisch dargestellt. Pro Passage wurde je 1 Probe 3-mal aufgetragen und<br />
die Pgp-Expression auf die des Housekeepers ß-Aktin normiert. In beiden Passagen der<br />
rBCEC-Zellen wurde die Pgp-Expression nachgewiesen. Zellen der Passage 3 exprimierten<br />
signifikant weniger Pgp.<br />
Die quantifizierten Signale der Proteine Pgp und ß-Aktin (siehe A) wurden als Mittelwerte +<br />
SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt und sind<br />
mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05).<br />
5.2.2 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Kumulations-Assays<br />
Mit dem Kumulations-Assay wurde in rBCEC-Zellen die Funktionalität des<br />
MDTs Pgp untersucht. Dies sollte auch für diese Zellen klären, ob Antiepileptika zu<br />
einer Induktion der Pgp-Funktionalität führen. Für diese Experimente wurden Zellen<br />
der Passagen 1 und 2 verwendet. Dazu wurden die Zellen mit den Pgp-Induktoren<br />
Dexamethason und Puromycin sowie mit ausgewählten Antiepileptika behandelt. Die<br />
Behandlung mit den Substanzen erfolgte hier ebenfalls ab dem 3. Tag nach<br />
Erreichen der Konfluenz für 72 h. Das Medium mit der jeweiligen Substanz wurde<br />
täglich erneuert. Tariquidar, welches als Pgp-Inhibitor diente, wurde erst mit<br />
Versuchsbeginnn einer vorher unbehandelten Gruppe an Zellen hinzugefügt und<br />
lediglich über 3 h auf diesen belassen. Für die Kumulationsversuche wurde als<br />
Substrat Rhodamin 123 in der Konzentration von 2 µM eingesetzt.<br />
115
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
200000<br />
150000<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=6<br />
*<br />
B<br />
200000<br />
150000<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=3<br />
*<br />
100000<br />
100000<br />
50000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
TQD 0,5 µM<br />
50000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Dex 10 µM<br />
*<br />
Puro 1 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abb. 5.23: Kumulations-Assays in primären Hirnendothelzellen der Ratte (Wistar und CD). Die<br />
Aussaat der Zellen erfolgte auf Multiwell-Platten im 12Well-Format.<br />
Der Multidrug-Transporter Pgp war in diesen Primärzellen funktionell. Der Vergleich beider<br />
Stämme zeigte, dass Pgp in Zellen der Wistar-Ratten zu einem stärkeren Efflux des Substrats<br />
Rhodamin 123 führte.<br />
A: Der Pgp-Inhibitor Tariquidar führte zu einer Hemmung des Efflux von Rhodamin 123 aus den<br />
Zellen.<br />
B: Die Zellen wurden über einen Behandlungszeitraum von drei Tagen mit den Pgp-Induktoren<br />
Dexamethason und Puromycin behandelt. Puromycin (1 µM) induzierte die Pgp-Funktionalität,<br />
der Gehalt an Rhodamin 123 verringerte sich im Vergleich zu den nicht behandelten<br />
Kontrollzellen. Dexamethason (10 µM) zeigte keinen Einfluss auf den Efflux durch Pgp.<br />
Tariquidar inhibierte Pgp und führte zu einer signifikant höheren Substratkonzentration in den<br />
Zellen.<br />
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem<br />
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Puro: Puromycin, TQD: Tariquidar.<br />
Die Kumulationsversuche zeigten, dass in den Primärzellen der Ratte beider<br />
Stämme funktionelles Pgp vorhanden war, welches durch Inhibitoren und Induktoren<br />
beeinflusst werden konnte. In exemplarischen Experimenten wurden deshalb die<br />
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin bezüglich ihrer Wirkung auf Pgp<br />
untersucht. Die Konzentrationen von jeweils 100 µM wurden gewählt, weil diese in<br />
hCMEC/D3-Zellen zur Induktion des Pgp-Efflux führten bzw. Tendenzen zu einer<br />
induzierenden Wirkung nachgewiesen wurden (Abbildung 5.8 B, C & D und 5.9).<br />
116
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
Rhodamin 123<br />
(Fluoreszenz/mg Protein)<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
rBCEC P:2 (Wistar)<br />
n=3<br />
100000<br />
80000<br />
60000<br />
40000<br />
20000<br />
*<br />
*<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Dex 10 µM<br />
CBZ 100 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
B<br />
150000<br />
100000<br />
80000<br />
60000<br />
40000<br />
20000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
rBCEC P:2 (Wistar)<br />
n=3<br />
200000<br />
*<br />
*<br />
Puro 1 µM<br />
*<br />
PHT 100 µM<br />
TQD 0,5 µM<br />
C<br />
200000<br />
150000<br />
100000<br />
80000<br />
60000<br />
40000<br />
20000<br />
0<br />
Kontrolle<br />
rBCEC P:2 (CD)<br />
n=3<br />
*<br />
Puro 1 µM<br />
*<br />
PHT 100 µM<br />
*<br />
TQD 0,5 µM<br />
Abb. 5.24: Kumulationsversuche mit den Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin in rBCEC<br />
auf 6Well-Platten. Beide Antiepileptika wurden in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt<br />
und hatten wie der Inhibitor Tariquidar eine signifikant inhibitorische Wirkung auf den Efflux<br />
durch Pgp. Die Ausgangsfunktionalität (Kontrolle) von Pgp der Zellen aus CD-Ratten war im<br />
vergleichenden Experiment höher als die der Zellen des Wistar-Stamms.<br />
A: Kumulations-Assay in Zellen des Rattenstamms Wistar. Der Pgp-Induktor Dexamethason<br />
zeigte im Vergleich zur Kontrolle keine Veränderung des Rhodamin-Efflux. Carbamazepin und<br />
Tariquidar führten zu einer signifikanten Inhibition des Efflux.<br />
B & C: Für den Vergleich des Efflux in Hirnendothelzellen der Rattenstämme Wistar und CD<br />
wurden die Zellen mit dem Pgp-Induktor Puromycin (1 µM) und dem Antiepileptikum Phenytoin<br />
behandelt. Puromycin führte zu einer signifikanten Induktion des Efflux. Phenytoin inhibierte<br />
die Pgp-Funktionalität, der Gehalt an Rhodamin 123 in den Zellen war im Vergleich zur<br />
Kontrolle erhöht. Tariquidar zeigte den gleichen Effekt, aber in einem stärkeren Ausmaß als<br />
Phenytoin.<br />
117
ERGEBNISSE<br />
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem<br />
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, CBZ: Carbamazepin, PHT: Phenytoin, Puro: Puromycin,<br />
TQD: Tariquidar.<br />
Die Experimente unter Abbildung 5.24 dienten der Klärung der Fragestellung,<br />
ob Antiepileptika ebenfalls zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität in primären<br />
Endothelzellen führen. Die Funktionalität von Pgp in diesen Zellen konnte mit diesen<br />
Versuchen erneut bestätigt werden. Der bekannte Induktor Puromycin und der Pgp-<br />
Inhibitor Tariquidar beeinflussten den Grundtransport des Transporters. Die<br />
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin führten jeweils in der Konzentration von<br />
100 µM zu einem erhöhten Rhodamin-Gehalt in den Zellen, sie inhibierten den Efflux<br />
von Rhodamin 123 in den primären Zellen.<br />
Erste Kumulationsversuche mit diesen Primärkulturen zeigten einen höheren<br />
Basis-Efflux des Pgp-Substrats Rhodamin 123 in Zellen aus Wistar-Ratten<br />
(Abbildung 5.23). Dieser Effekt kehrte sich in folgenden Versuchen um, sodass<br />
Endothelzellen der CD-Ratten einen höheren Grundtransport des MDTs Pgp<br />
aufwiesen. Diese Effekte waren inkonsistent.<br />
Zusammenfassend ist zu sagen, dass der Vergleich der Primärkulturen aus<br />
CD- und Wistar-Ratten zu keinem eindeutigen Ergebnis geführt hat. Es bleibt<br />
festzuhalten, dass die Zellen der CD-Ratten sich besser an die Oberflächen der<br />
Zellkulturmaterialien anhefteten und ein schnelleres Wachstum zeigten. In den Zellen<br />
beider Stämme konnte funktionelles Pgp nachgewiesen werden, welches durch Pgp-<br />
Induktoren und –Inhibitoren beeinflusst werden konnte. Das Ausmaß des Rhodamin-<br />
Grundtransports durch Pgp unterschied sich aber in beiden Stämmen und schwankte<br />
stark. Weshalb Zellen aus Hirnendothel der Wistar-Ratten zunächst einen höheren<br />
Efflux des Rhodamins aufwiesen und in weiteren Experimenten dann die Zellen aus<br />
CD-Ratten, ließ sich mit der noch geringen Anzahl an Versuchen nicht klären.<br />
Im Gegensatz zu der immortalisierten Zelllinie hCMEC/D3 inhibierten die<br />
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin in der Konzentration von 100 µM, die<br />
außerhalb des therapeutischen Bereichs beim Menschen liegt (siehe Tabelle 5.1, S.<br />
74) den Efflux durch Pgp in primären Hirnkapillarendothelzellen beider verwendeter<br />
Rattenstämme. Diese Effekte in den rBCEC bedürfen weiterer Experimente und<br />
118
ERGEBNISSE<br />
zusätzlicher Konzentrationen, um die Wirkung von Antiepileptika in den<br />
Primärkulturen abzuklären.<br />
5.2.3 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Transport-Assays<br />
Das Hauptaugenmerk für die primären Hirnendothelzellen der Ratte lag auf<br />
den Transportversuchen. Es sollte geklärt werden, wie sich Primärkulturen im<br />
Transwell-Modell verhalten und ob diese möglicherweise besser als In-vitro-BHS-<br />
Modell geeignet sind als die immortalisierten humanen hCMEC/D3-Zellen. Des<br />
Weiteren sollte im Hinblick auf mögliche Unterschiede zwischen den Spezies<br />
Mensch und Ratte untersucht werden, ob und welche Antiepileptika Substrate des<br />
MDTs Pgp in diesen Zellen sind. Zu diesem Zweck wurden die Zellen auf<br />
Membraneinlagen kultiviert. In der Regel wurden dazu Membran-Inserts im 12Well-<br />
Format verwendet, weil auf diese Weise mit den Zellen einer Präparation zum einen<br />
eine höhere Anzahl an Wells in den Versuchen erzielt wurde. Zum anderen konnten<br />
mehr Faktoren wie Substrate, Inhibitoren, Dichtigkeit der Zellmonolayer usw.<br />
untersucht werden. In einzelnen Transport-Assays wurden auch 6Well-<br />
Membraneinlagen verwendet, um beide Formate miteinander vergleichen zu können.<br />
Hinweise zur Wachstumsfläche, Porendichte und –größe können der Tabelle 4.2 (S.<br />
54) entnommen werden.<br />
Die Primärkulturen der Hirnendothelzellen der Ratte wurden nur für<br />
Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode eingesetzt. Wie<br />
auch für die hCMEC/D3-Zellen wurden verschiedene Parameter wie Substrat,<br />
Format und Hersteller der Membraneinlagen sowie die Kokultur mit Astrozyten<br />
untersucht.<br />
In der Tabelle 5.7 wurden alle untersuchten Parameter zusammengefasst.<br />
5.2.3.1 Auswahl des Substrats<br />
Bei den Transportversuchen mit den hCMEC/D3-Zellen schien der<br />
Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als Pgp-Substrat besser geeignet zu sein.<br />
Infolgedessen wurden in ersten Experimenten Rhodamin 123 eingesetzt. Dabei<br />
wurde die gleiche Konzentration (2 µM) wie bei den humanen immortalisierten Zellen<br />
verwendet. Um zu klären, ob weitere Pgp-Substrate wie Digoxin und Verapamil<br />
durch Pgp in rBCEC transportiert werden, wurden diese ebenfalls untersucht.<br />
119
ERGEBNISSE<br />
Obwohl die TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten für alle unter Abbildung<br />
5.25 dargestellten Versuche vergleichbar waren, konnte in rBCEC-Zellen der<br />
Rattenstämme CD und Wistar nur ein Transport von Rhodamin 123 (2 µM) detektiert<br />
werden. Dabei zeigten diese Zellen ähnlich hohe TEER-Werte wie die humanen<br />
Zellen hCMEC/D3 auf Membraneinlagen im 12Well-Format. Zellen, die aus CD-<br />
Ratten gewonnen wurden, zeigten einen gleichmäßigeren Konzentrationsverlauf als<br />
die Zellen des anderen Stamms. Die Mannitol-Permeabilitäten waren alle mindestens<br />
20-mal höher als die Grenze von 12 nm/s. Der Nachweis eines asymmetrischen<br />
Transports von Digoxin und Verapamil war unter den genannten Konzentrationen<br />
und Bedingungen nicht möglich.<br />
120
% Verapamil<br />
% Verapamil<br />
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=4<br />
B<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=4<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
apikal<br />
basolateral<br />
TEER: 162,5 *cm 2<br />
* * *<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
*<br />
TEER: 140,1 *cm 2<br />
* * *<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
C<br />
Digoxin (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=4<br />
D<br />
Digoxin (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=4<br />
400<br />
400<br />
350<br />
350<br />
300<br />
300<br />
250<br />
250<br />
200<br />
TEER: 134,2 *cm 2<br />
150<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
200<br />
TEER: 142,2 *cm 2<br />
150<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
E<br />
Verapamil (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=6<br />
F<br />
Verapamil (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=6<br />
400<br />
400<br />
350<br />
300<br />
TEER: 149,5 *cm 2<br />
350<br />
300<br />
TEER: 127,3 *cm 2<br />
250<br />
250<br />
200<br />
200<br />
150<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
150<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
Abbildung 5.25: Vergleichende Transport-Assays nach der<br />
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA) mit den Substraten Rhodamin 123 (A & B),<br />
Digoxin (C & D) und Verapamil (E & F) in monokultivierten Primärkulturen des<br />
Hirnkapillarendothels aus CD- und Wistar-Ratten auf Membraneinlagen im 12Well-Format<br />
(Corning). Für Rhodamin 123 konnte ein asymmetrischer Transport in den rBCEC<br />
nachgewiesen werden.<br />
121
ERGEBNISSE<br />
Die Mannitol-Permeabilitäten waren für alle getesteten Substrate vergleichbar. Die Zellen aus<br />
CD-Ratten zeigten sehr hohe Werte zwischen 275 und 332 nm/s (A, C & E), für Primärzellen aus<br />
Wistar-Ratten lagen diese bei 248–311 nm/s (B, D & F). Der TEER-Werte waren bei allen<br />
Experimenten ähnlich hoch. Die Wistar-Zellen zeigten tendenziell etwas niedrigere<br />
Widerstände.<br />
Die Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat des Herstellers Corning kultiviert<br />
und 4-11 Tage nach Erreichen der Konfluenz für die Versuche verwendet. Die Werte sind als<br />
Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit der Two-way ANOVA und<br />
dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.<br />
5.2.3.2 Einfluss des Membranformats und –formats<br />
Das Membranformat<br />
Die rBCEC-Zellen wurden für die Transport-Assays fast ausschließlich auf<br />
1,12 cm 2 großen Membranen (12Well-Format) kultiviert, um die primären Zellen für<br />
möglichst viele Experimente nutzen zu können. Sofern genug Zellmaterial zur<br />
Verfügung stand, erfolgte die Aussaat der Zellen für einzelne Versuche aber auch<br />
auf größeren Membran-Inserts, um sich ein Bild davon zu machen, wie die Zellen<br />
sich auf diesen Membranen verhalten.<br />
Die primären Rattenzellen zeigten auf den größeren Membraneinlagen im<br />
6Well-Format etwa 2-fach niedrigere TEER-Werte als auf den kleineren Membran-<br />
Inserts aber 4-mal so hohe Werte wie die humanen Zellen. Bezüglich dieses<br />
Parameters fiel auf, dass die Zellen aus CD-Ratten oftmals höhere TEER-Werte<br />
aufwiesen. Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 oder Digoxin konnte<br />
unter den gewählten Bedingungen (Membraneinlagen im 6Well-Format) nicht<br />
nachgewiesen werden.<br />
122
% Digoxin<br />
% Digoxin<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
180<br />
160<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=1<br />
apikal<br />
basolateral<br />
B<br />
180<br />
160<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=1<br />
140<br />
120<br />
TEER: 81,7 *cm 2<br />
140<br />
120<br />
TEER: 79,4 *cm 2<br />
100<br />
100<br />
80<br />
80<br />
60<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
60<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
C<br />
Digoxin (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=1<br />
D<br />
Digoxin (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (Wistar)<br />
n=1<br />
180<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
TEER: 88,7 *cm 2<br />
160<br />
140<br />
120<br />
TEER: 140,1 *cm 2<br />
100<br />
100<br />
80<br />
80<br />
60<br />
60<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.26: Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)<br />
mit den Substraten Rhodamin 123 (A & B) und Digoxin (C & D) in primären<br />
Hirnkapillarendothelien aus CD- und Wistar-Ratten auf Membraneinlagen im 6Well-Format. Für<br />
keines der Substrate war ein asymmetrischer Transport nachweisbar. Mit der unter D gezeigten<br />
Ausnahme waren die TEER-Werte ähnlich hoch. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen<br />
85 und 97 nm/s.<br />
Der Konzentrationsverlauf wurde über 4 h beobachtet. Die Kultivierung der Zellen erfolgte auf<br />
Polycarbonat-Membraneinlagen (Corning). Die Versuche wurden 4 bzw. 6 Tage nach Erreichen<br />
der Konfluenz durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.<br />
Das Membranmaterial<br />
Das Material, aus dem die Membranen für die Transwell-Inserts hergestellt<br />
werden, kann auf die Detektion eines Transports Einfluss nehmen. Für die<br />
Transportversuche mit den Primärkulturen des Hirnkapillarendothels wurden<br />
Polyester-Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner Bio-One verwendet.<br />
Diese bestehen zwar aus dem gleichen Material, zeigen aber eine unterschiedliche<br />
123
% Rhodamin 123<br />
% Digoxin<br />
ERGEBNISSE<br />
Porendichte. Dazu wurden einzelne Experimente, die mit dem Substrat Rhodamin<br />
123 durchgeführt wurden, miteinander verglichen.<br />
A<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
*<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=4<br />
apikal<br />
basolateral<br />
*<br />
TEER: 213,5 *cm 2<br />
* *<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
B<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
60<br />
40<br />
20<br />
Digoxin (10 nM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=4<br />
TEER: 217,9 *cm 2<br />
0<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.27: Transportversuche in rBCEC aus CD-Ratten der Passage 1 mit Rhodamin 123<br />
(A) und Digoxin (B) 12Well-Membraneinlagen des Herstellers Greiner. Rhodamin 123 wurde von<br />
Zellen asymmetrisch von basolateral nach apikal transportiert. Ein Transport von Digoxin<br />
konnte nicht nachgewiesen werden. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen bei 131 bzw. 177 nm/s.<br />
Die TEER-Werte bewegten sich in einem Bereich von 213,5–217,9 Ω*cm 2 .<br />
Proben wurden über den Zeitraum von 4 h entnommen. Die Zellen wurden auf Greiner-<br />
Membraneinlagen (Polyester) kultiviert. Die Transport-Assays wurden am 6. Tag nach<br />
Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.<br />
Unterschiede wurden mit der Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und<br />
Signifikanzen sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.<br />
Unabhängig vom Membranmaterial bzw. dessen Herstellungsprozess erfolgte<br />
der Nachweis eines asymmetrischen Transports von Rhodamin 123. Ein Transport<br />
von Digoxin konnte nicht detektiert werden. Es fiel auf, dass im Gegensatz zu den<br />
Versuchen mit hCMEC/D3-Zellen die Membraneinlagen der Firma Greiner mit der<br />
gleichen Porengröße höhere TEER-Werte gemessen wurden als für die Transwell-<br />
Inserts von Corning. Die Mannitol-Permeabilität schien ebenfalls beeinflusst, es<br />
wurden niedrigere Werte als für die humanen hCMEC/D3-Zellen gemessen.<br />
5.2.3.3 Die Kokultivierung der rBCEC-Zellen mit Astrozyten<br />
Die Primärkulturen des Rattenhirnendothels zeigten von Beginn an höhere<br />
TEER-Werte als die hCMEC/D3-Zellen. Allerdings zeigte sich auch bei diesen Zellen<br />
eine im Vergleich mit z.B. den immortalisierten Nierenepithelzellen LLC und MDCK II<br />
124
ERGEBNISSE<br />
(LLC: 4,3 ± 0,5 nm/s, MDCK II. 3,3 ± 0,49 nm/s; LÖSCHER et al. 2011) und primären<br />
porcinen Hirnkapillarendothelzellen (17-18 nm/s; FRANKE et al. 1999 & 2000) sehr<br />
hohe Mannitol-Permeabilität, die aber im Unterschied zu den immortalisierten<br />
humanen Zellen immer noch um etwa die Hälfte reduziert war.<br />
Um zu überprüfen, ob die Kokultur mit Astrozyten Einfluss auf die Parameter<br />
TEER und Mannitol-Permeabilität für die Primärkulturen des Hirnkapillarendothels<br />
der Ratte hat, wurden die primären Hirnendothelzellen beider Stämme mit Astrozyten<br />
kokultiviert. Für Kokultur-Versuche erfolgte die Aussaat der Astrozyten auf der<br />
Unterseite der Membran. Die Endothelzellen wurden auf der apikalen Seite der<br />
Membraneinlagen kultiviert.<br />
Die Kokultivierung der Rattenhirnendothelien mit Astrozyten, die ebenfalls aus<br />
der Ratte stammten, führte zum Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-<br />
Transports. Dabei blieb der transendotheliale Widerstand unbeeinflusst. Eine<br />
Steigerung durch die Astrozyten war nicht erkennbar. Auffällig war, dass die<br />
Messungen erneut höhere Werte für die Membran-Inserts von Greiner ergaben. Die<br />
Mannitol-Permeabilitäten der Zellen schwankten für beide Stämme. Der Mittelwert<br />
lag bei 174,1 nm/s (siehe Tabelle 5.6, Gesamt 12Well Kokultur). Oft verhielt es sich<br />
so, dass die Mannitol-Permeabilitäten mit den TEER-Werten korrelierten. Je<br />
niedriger die Mannitol-Permeabilität, desto höhere TEER-Werte wurden gemessen<br />
(5.28 B & D, siehe auch Tabelle 5.6).<br />
125
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Corning Inserts, Stamm CD<br />
rBCEC P:1 + Astrozyten P:7<br />
n=4<br />
B<br />
Greiner Inserts, Stamm CD<br />
rBCEC P:1 + Astrozyten P:7<br />
n=5<br />
180<br />
160<br />
140<br />
apical<br />
basolateral<br />
* * * *<br />
180<br />
160<br />
140<br />
* * *<br />
*<br />
120<br />
120<br />
100<br />
TEER: 177,1 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
100<br />
TEER: 229,0 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
C<br />
160<br />
Corning Inserts, Stamm Wistar<br />
rBCEC P:1 + Astrozyten P:4<br />
n=6<br />
*<br />
*<br />
180<br />
*<br />
*<br />
D<br />
180<br />
160<br />
Greiner Inserts, Stamm Wistar<br />
rBCEC P:2 + Astrozyten P:13<br />
n=4<br />
TEER: 219,8 *cm 2<br />
140<br />
120<br />
100<br />
TEER: 126,2 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
140<br />
120<br />
100<br />
* * * *<br />
*<br />
0 60 120 180 240 300 360<br />
min<br />
Abbildung 5.28: Transportversuche in rBCEC aus CD- und Wistar-Ratten in Kokultur mit<br />
Astrozyten. Als Substrat wurde Rhodamin 123 in der Konzentration von 2 µM eingesetzt.<br />
Signifikante Konzentrationsunterschiede wurden in allen Versuchen festgestellt. Ein<br />
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte nachgewiesen werden. Der<br />
transendotheliale Widerstand lag zwischen 126,2 und 229,0 Ω*cm 2 . Die Permeabilität für<br />
Mannitol zeigte Werte von 214,3 nm/s (A), 142,1 nm/s (B), 319 nm/s (C), 122,2 nm/s (D). Dabei<br />
zeigten die Zellen mit niedrigeren Mannitol-Permeabilitäten die höheren TEER-Werte (B & D).<br />
Die Zellen wurden auf Polyester-Membraneinlagen im 12Well-Format der Hersteller Corning<br />
und Greiner kultiviert. Der Transport wurde über 4 h (A-C) bzw. 6 h (D) untersucht. Die<br />
Transportversuche erfolgten am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz. Daten sind als<br />
Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede zwischen den Konzentrationen der<br />
apikalen und basolateralen Kammer wurden mit der Two-way ANOVA und dem Bonferroni-<br />
Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
126
ERGEBNISSE<br />
Die Experimente zur Kokultivierung untersuchten nicht nur Rhodamin 123,<br />
sondern auch Digoxin. Allerdings konnte auch unter diesen Bedingungen kein<br />
Digoxin-Transport nachgewiesen werden, weshalb die dazugehörigen Graphen nicht<br />
dargestellt wurden. In einem einzelnen Versuch wurde der Transport des<br />
Antiepileptikums Phenytoin untersucht. Es war kein signifikanter Transport zu<br />
erkennen (Daten nicht gezeigt).<br />
5.2.3.4 Geeignete Pgp-Inhibitoren zur Überprüfung des Transports<br />
In den rBCEC-Zellen wurde ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123<br />
sowohl in Monokultur als auch in Kokultur mit Astrozyten nachgewiesen. Um zu<br />
klären, ob dieser Transport spezifisch durch Pgp erfolgte, wurden die Zellen<br />
zusätzlich zum Substrat Rhodamin 123 mit den spezifischen Pgp-Inhibitoren<br />
Tariquidar und Valspodar (PSC833) inkubiert. Wenn es sich um einen Pgpspezifischen<br />
Transport handelt, führen diese Substanzen zu einer Inhibition des<br />
Transports und Konzentrationsunterschiede zwischen der apikalen und basolateralen<br />
Kammer werden aufgehoben.<br />
127
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
A<br />
Rhodamin 123 (2 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=4<br />
B<br />
+ TQD (0,5 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD)<br />
n=1<br />
Veränderung<br />
der AUC/<br />
180 apical basolateral<br />
180<br />
160<br />
AUC/h: 406,5<br />
TEER: 213,5 *cm 2<br />
160<br />
AUC/h: 543<br />
TEER: 234,8 *cm 2<br />
140<br />
120<br />
* * * *<br />
140<br />
120<br />
+ 33,6 %<br />
100<br />
100<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
C<br />
160<br />
140<br />
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur<br />
rBCEC P:1 (Wistar) + Astrozyten P:4<br />
n=6<br />
*<br />
*<br />
180<br />
*<br />
*<br />
D<br />
180<br />
160<br />
140<br />
+ TQD (0,5 µM), Kokultur<br />
rBCEC P:1 (Wistar) + Astrozyten P:4<br />
n=5<br />
*<br />
*<br />
*<br />
- 52,2 %<br />
120<br />
120<br />
100<br />
AUC/h: 192,3 TEER: 126,2 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
100<br />
AUC/h: 91,9 TEER: 133,4 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
E<br />
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur<br />
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7<br />
n=4<br />
F<br />
+ PSC833 (10 µM), Kokultur<br />
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7<br />
n=1<br />
180<br />
180<br />
160<br />
140<br />
* * * *<br />
160<br />
140<br />
+ 30,6 %<br />
120<br />
120<br />
100<br />
AUC/h: 328 TEER: 177,1 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
100<br />
AUC/h: 428,3 TEER: 188,5 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
128
% Rhodamin 123<br />
% Rhodamin 123<br />
ERGEBNISSE<br />
G<br />
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur<br />
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7<br />
n=5<br />
H<br />
+ PSC833 (10 µM)<br />
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7<br />
n=1<br />
Veränderung<br />
der AUC/h<br />
180<br />
160<br />
140<br />
* * *<br />
*<br />
180<br />
160<br />
140<br />
- 6,3 %<br />
120<br />
120<br />
100<br />
AUC/h: 463 TEER: 229,0 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
100<br />
AUC/h: 434 TEER: 197,9 *cm 2<br />
0 60 120 180 240<br />
min<br />
Abbildung 5.29: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in rBCEC-Zellen der<br />
Rattenstämme CD und Wistar in Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–<br />
H). Der Transport wurde über einen Zeitraum von 4 h beobachtet. Die Zellen wurden auf 12Well-<br />
Membraneinlagen der Firmen Greiner (A, B, G & H) und Corning (C-F) kultiviert. Die<br />
Experimente wurden 4-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Graphen A, C, E<br />
und G zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen des Substrats Rhodamin<br />
123 gemessen wurden. Unter B, D, F und H sind Transport-Assays dargestellt, die die Inhibition<br />
des Transports durch Tariquidar (TQD) und Valspodar (PSC833) untersuchten.<br />
In allen Versuchen erfolgte der Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-Transports. Die<br />
Inkubation mit den Inhibitoren Tariquidar und Valspodar zeigte keine oder nur wenige<br />
Veränderungen im Konzentrationsverlauf des Substrats. Der Rhodamin-Transport konnte nicht<br />
inhibiert werden. Die Messung der Mannitol-Permeabilität ergab Werte für A und B mit 153,7<br />
nm/s, C und D: 319 m/s, E und F: 214,3 nm/s und für G und H: 142,1 nm/s.<br />
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer<br />
Two-way ANOVA (Posthoc Bonferroni) ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.<br />
Die hier dargestellten Graphen zu Transportexperimenten (Abbildung 5.29) mit<br />
Primärkulturen des Rattenhirnendothels zeigen, dass der Rhodamin-Transport<br />
mittels der spezifischen Pgp-Inhibitoren Tariquidar und Valspodar nicht gehemmt<br />
werden konnte (Graph B, F & H). Die Inhibition durch Tariquidar in Graph D schien<br />
erst nach etwa 120 min einzutreten. Für den letzten Probenzeitpunkt waren keine<br />
signifikanten Konzentrationsunterschiede mehr feststellbar und die AUC sank um<br />
52,2 %. Allerdings konnte dies nicht reproduziert werden. Bei den Graphen B und H<br />
könnten ähnliche Effekte wie für D vermutet werden, da auch hier die<br />
Konzentrationsunterschiede zum letzten Zeitpunkt abnahmen. Konkrete Angaben<br />
können aber dazu nicht gemacht werden, da für die unter B, F und H dargestellten<br />
129
ERGEBNISSE<br />
Versuche mit einer Gruppengröße von n=1 gearbeitet wurde. Es bleibt festzuhalten,<br />
dass keiner der eingesetzten Inhibitoren in den gewählten Konzentrationen in der<br />
Lage war, den Pgp-vermittelten Transport von Rhodamin 123 vollständig in allen<br />
Versuchen zu hemmen. In zwei von vier Versuchen erhöhten sich die AUC nach<br />
Zugabe eines Pgp-Inhibitors (Abbildung 5.29 B & F). Lediglich in Graph 5.29 D<br />
verringerte sich die AUC um > 50 % nach Zugabe des Inhibitors Tariquidar. Ein<br />
Unterschied zwischen Mono- und Kokultur bzw. Corning- und Greiner-<br />
Membraneinlagen war nicht zu erkennen.<br />
5.2.3.5 Integrität primärer Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-<br />
Permeabilität<br />
In Tabelle 5.7 wurden alle gemessenen TEER-Werte und Mannitol-<br />
Permeabilitäten der Transportuntersuchungen mit rBCEC-Zellen beider verwendeter<br />
Rattenstämme (CD und Wistar) zusammengefasst. Es wurde deutlich, dass es auch<br />
für die Primärzellen einen Unterschied machte, ob diese auf kleinen 12Well-<br />
Membranen oder größeren 6Well-Membranen kultiviert wurden. Mit der Kultur der<br />
rBCEC-Zellen auf 12Well-Membranen wurden höhere TEER-Werte gemessen.<br />
Gleichzeitig erhöhte sich aber auch die Permeabilität für Mannitol um das etwa das<br />
Dreifache. Unterschiede wurden des Weiteren zwischen den Membranherstellern<br />
Corning und Greiner (Vergleich 12Well-Format) und den Rattenstämmen CD und<br />
Wistar deutlich. Wurden die primären Zellen auf Greiner-Membranen kultiviert<br />
erhöhte sich der TEER und die Mannitol-Permeabilität sank. Im Vergleich der Zellen<br />
aus CD- und Wistar-Ratten fiel auf, dass für die Monolayer der CD-Ratten höhere<br />
TEER-Werte und niedrigere Mannitol-Permeabilitäten gemessen wurden.<br />
130
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.6: Übersicht der TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten in Bezug auf die<br />
untersuchten Parameter in Transportversuchen (CETA) mit rBCEC-Zellen. Zur<br />
besseren Vergleichbarkeit sind hier auch Daten aus der Literatur aufgeführt.<br />
Daten der Literatur<br />
Zelllinie/<br />
Zellen<br />
Serum<br />
Kokultur<br />
TEER<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Parazelluläre<br />
Permeabilität<br />
(nm/s)<br />
Referenz<br />
hCMEC/D3<br />
Human<br />
Nein<br />
15-30<br />
k. A.<br />
URICH et al. 2012<br />
LCC-Wt<br />
Bovin<br />
Nein<br />
800<br />
Mannitol: 4-6<br />
LÖSCHER et al. 2011<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Ja<br />
169-500<br />
Fluorescein: 1,87<br />
PERRIÈRE et al. 2005<br />
(Ratte)<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Auch<br />
bis 600<br />
k. A.<br />
HUTAMEKALIN et al. 2008<br />
(Ratte)<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Nein<br />
400-700<br />
Mannitol: 18<br />
FRANKE et al. 2000<br />
(Schwein)<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Nein<br />
bis 1800<br />
Sucrose: 0,2<br />
NITZ et al. 2003<br />
(Schwein)<br />
Primärkultur<br />
Bovin<br />
Auch<br />
130<br />
Fluorescein: 1,6-17,6<br />
GAILLARD & DE BOER 2000<br />
(Rind)<br />
Primärkultur<br />
Equin<br />
Nein<br />
60-80<br />
k. A.<br />
LEE 2004<br />
(Rind)<br />
131
ERGEBNISSE<br />
Daten der These<br />
Stamm<br />
Membranmaterial/<br />
-format<br />
Kokultur<br />
TEER<br />
(Ω*cm 2 )<br />
Mannitol<br />
(nm/s)<br />
Mannitol<br />
(%/h)<br />
Asymm.<br />
Transport<br />
Corning,<br />
Nein<br />
88,7<br />
n.d.<br />
n.d.<br />
-<br />
Polyester,<br />
Nein<br />
81,7<br />
85,3<br />
8,7<br />
-<br />
6Well<br />
85,2 ± 3,5 85,3 ± 0 8,7 ± 0<br />
Nein<br />
134,2<br />
331,6<br />
24,5<br />
-<br />
Nein*<br />
147,1<br />
331,6<br />
24,5<br />
-<br />
Nein<br />
173,4<br />
214,3<br />
12,9<br />
-<br />
Nein*<br />
162,8<br />
214,3<br />
12,9<br />
-<br />
Nein<br />
162,5<br />
288,4<br />
21,1<br />
+<br />
Corning,<br />
Polyester,<br />
12Well<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein*<br />
136,5<br />
149,0<br />
149,5<br />
141,9<br />
287,2<br />
287,2<br />
274,8<br />
274,8<br />
22,3<br />
22,3<br />
21,0<br />
21,0<br />
+<br />
n.a. (n=1)<br />
-<br />
-<br />
150,8 ± 12,3 278,2 ± 39,7 20,3 ± 4,1<br />
Ja<br />
177,1<br />
214,3<br />
12,9<br />
+<br />
CD<br />
Ja*<br />
188,5<br />
214,3<br />
12,9<br />
n.a. (n=1)<br />
Greiner,<br />
Polyester,<br />
12Well<br />
182,8 ± 5,7 214,3 ± 0 12,9 ± 0<br />
Gesamt 138,8 ± 27,7 259,0 ± 69,0 19,1 ± 5,2<br />
Nein 217,9<br />
153,7<br />
11,2<br />
Nein* 219,5<br />
153,7<br />
11,2<br />
Nein 219,7<br />
142,1<br />
7,2<br />
Nein* 225,5<br />
142,1<br />
7,2<br />
Nein 213,5<br />
146,7<br />
7,5<br />
Nein* 234,8<br />
146,7<br />
7,5<br />
221,8 ± 6,8 147,5 ± 4,8 8,6 ± 1,8<br />
Ja<br />
229,0<br />
142,1<br />
7,2<br />
Ja*<br />
197,9<br />
142,1<br />
7,2<br />
Ja<br />
212,5<br />
146,7<br />
7,5<br />
213,1 ± 12,7 143,6± 2,2 7,3 ± 0,1<br />
Gesamt 218,9 ± 10,1 146,2 ± 4,5 8,2 ± 1,6<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
n.a. (n=1)<br />
+<br />
n.a. (n=1)<br />
+<br />
CD Gesamt 12Well Nein 179,2 ± 36,3 225,9 ± 71,1 15,6 ± 6,6<br />
CD Gesamt 12Well Ja 201,0 ± 18,2 171,9 ± 34,7 9,5 ± 2,7<br />
CD Gesamt 12Well 184,6 ± 34,1 212,4 ± 68,1 14,1 ± 6,5<br />
132
ERGEBNISSE<br />
Stamm<br />
Membranmaterial/<br />
Kokultur<br />
TEER Mannitol Mannitol Asymm.<br />
(Ω*cm 2 ) (nm/s) (%/h) Transport<br />
-format<br />
Corning,<br />
Polyester,<br />
Nein<br />
Nein<br />
140,1<br />
79,4<br />
n.d.<br />
96,5<br />
n.d.<br />
10,5<br />
-<br />
-<br />
6Well<br />
109,8 ± 30,4 96,5 ± 0 10,5 ± 0<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
Nein<br />
Nein*<br />
Nein<br />
142,2<br />
143,0<br />
140,1<br />
131,4<br />
144,5<br />
127,3<br />
304,9<br />
304,9<br />
311,2<br />
309,9<br />
309,9<br />
248,1<br />
25,4<br />
25,4<br />
22,6<br />
21,8<br />
21,8<br />
25,7<br />
-<br />
-<br />
+<br />
-<br />
n.a. (n=1)<br />
-<br />
Wistar<br />
Corning,<br />
Nein 122,5<br />
248,1<br />
25,7<br />
-<br />
Polyester,<br />
135,9 ± 8,1 291,0 ± 27,2 24,1 ± 1,7<br />
12Well<br />
Ja*<br />
Ja<br />
Ja*<br />
Ja<br />
131,6<br />
126,5<br />
133,4<br />
124,2<br />
303,8<br />
319,3<br />
319,3<br />
303,8<br />
26,2<br />
21,5<br />
21,5<br />
26,2<br />
-<br />
+<br />
(+)<br />
-<br />
128,9 ± 3,7 311,6 ± 7,8 23,9 ± 2,4<br />
Gesamt 133,3 ± 7,6 298,5 ± 24,3 24,0 ± 2,0<br />
Greiner,<br />
Polyester, Ja 219,8 122,2 7,3 +<br />
12Well<br />
Wistar Gesamt 12Well Nein 135,9 ± 8,1 291,0 ± 27,2 24,1 ± 1,7<br />
Wistar Gesamt 12Well Ja 147,1 ± 36,5 273,7 ± 76,1 20,5 ± 6,9<br />
Wistar Gesamt 12Well 140,5 ± 25,0 283,8 ± 54,0 22,6 ± 5,0<br />
Gesamt 6Well Nein 97,5 ± 24,8 90,9 ± 5,6 9,6 ± 0,9<br />
Gesamt 12Well Nein 165,4 ± 36,5 246,6 ± 67,8 18,3 ± 6,8<br />
Gesamt 12Well Ja 174,1 ± 39,5 222,8 ± 78,0 15,0 ± 7,6<br />
Gesamt 12Well 168,1 ± 37,6 239,2 ± 72,0 17,3 ± 7,2<br />
n.d.<br />
Messung nicht durchgeführt<br />
n.a.<br />
nicht ausgewertet (zu kleine Gruppengröße)<br />
+ asymmetrischer Transport<br />
- kein asymmetrischer Transport<br />
(+) asymmetrischer Transport nicht über gesamte Versuchsdauer messbar<br />
* Messung nach Zugabe eines Inhibitors (Tariquidar oder Valspodar)<br />
133
ERGEBNISSE<br />
5.2.2.6 Zusammenfassung des Transports in primären Hirnendothelien der<br />
Ratte<br />
Die Untersuchung des Transports in primären Rattenhirnendothelien zeigte,<br />
dass in diesen Zellen auch ohne starke Modifizierungen des Transwell-Modells<br />
Transport nachgewiesen werden konnte. Der Nachweis des Rhodamin-Transports<br />
gelang sowohl in monokultivierten als auch in mit Astrozyten kokultivierten Zellen und<br />
auf verschiedenen 12Well-Membraneinlagen (Corning und Greiner). Wie auch für die<br />
hCMEC/D3-Zellen konnte ein Transport der spezifischen Pgp-Substrate Digoxin und<br />
Verapamil für die Primärkultur nicht detektiert werden (Abbildung 5.25). Keines der<br />
getesteten Substrate wurde von Zellen, die auf größeren 6Well-Membranen kultiviert<br />
wurden, transportiert (Abbildung 5.26).<br />
Die Parameter für die Integrität der Monolayer, der TEER und die Mannitol-<br />
Permeabilität, wurden auch für diese Zellen untersucht. Die Widerstände zeigten für<br />
die Primärkulturen in den meisten Versuchen höhere Werte als die immortalisierten<br />
hCMEC/D3-Zellen (rBCEC: 6Well: 97,5 ± 24,8 Ω*cm 2 und 12Well: 168,1 ± 37,6<br />
Ω*cm 2 ; hCMEC/D3: 6Well: 31,9 ± 12,8 Ω*cm 2 und 12Well: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 )<br />
(siehe Tabellen 5.4 & 5.6). Für die Primärkulturen fiel zudem auf, dass die Zellen auf<br />
Greiner-Membraneinlagen oft etwas höhere transendotheliale elektrische<br />
Widerstände zeigten als auf Corning-Inserts. Dies schien aber keinen Einfluss auf<br />
den Nachweis eines Transports haben. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten ähnlich<br />
hohe Werte auf den 12Well-Membraneinlagen wie die humanen Zellen (rBCEC:<br />
239,2 ± 72,0 nm/s; hCMEC/D3: 230,4 ± 109,2 nm/s). Permeabilitäten < 12 nm/s<br />
wurden nicht gemessen.<br />
Die Kokultur mit Astrozyten führte zu keiner offensichtlichen Verbesserung der<br />
Parameter für die Dichtigkeit und dem Nachweis des Transports. So konnte der<br />
TEER durch die Kokultur (Monokultur: 165,4 ± 36,5 Ω*cm 2 ; Kokultur: 174,1 ± 39,5<br />
Ω*cm 2 ; siehe Tabelle 5.6) nicht wesentlich gesteigert werden, die Mannitol-<br />
Permeabilität blieb ebenfalls nahezu unverändert (Monokultur: 246,6 ± 67,8 nm/s;<br />
Kokultur: 222,8 ± 78,0 nm/s). Weiterhin wurde die Spezifität des Rhodamin-<br />
Transports überprüft. Dieser konnte durch die Pgp-Inhibitoren Tariquidar und<br />
Valspodar in den genannten Konzentrationen nicht vollständig gehemmt werden<br />
(Abbildung 5.29).<br />
134
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.7 fasst alle Resultate der Transportversuche zusammen und soll<br />
einen Überblick geben, unter welchen Bedingungen in den primären<br />
Rattenhirnkapillarendothelzellen Transport nachgewiesen werden konnte. Die<br />
entsprechenden Ergebnisse sind in den Abschnitten 5.2.3.1 bis 5.2.3.4 nachzulesen<br />
und in den Abbildungen 5.25-5.29 dargestellt. Darüber hinaus wird deutlich, dass<br />
auch für die rBCEC-Zellen die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden,<br />
und deshalb der Transport von Antiepileptika in diesen primären Zellen nicht<br />
untersucht wurde.<br />
135
Inhibition des<br />
Transports<br />
+ asymmetrischer Transport nachgewiesen - asymmetrischer Transport nicht nachweisbar<br />
ERGEBNISSE<br />
Tabelle 5.7: Übersicht der Transport-Assays mit primären Hirnkapillarendothelien der Ratte. Es konnte nur ein<br />
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden. Die Versuche wurden mit beiden Rattenstämmen (CD,<br />
Wistar) durchgeführt.<br />
Substrat<br />
Membranfilter<br />
Hersteller Material<br />
Format Kokultur<br />
Asymmetrischer<br />
Transport<br />
136<br />
Digoxin<br />
10 nM<br />
Rhodamin 123<br />
2 µM<br />
Verapamil<br />
10 nM<br />
Phenytoin<br />
50 µM<br />
6Well - - -<br />
Corning Polyester<br />
- - -<br />
12Well<br />
+ - -<br />
Greiner Polyester<br />
Corning Polyester<br />
Greiner Polyester<br />
6Well nicht untersucht<br />
12Well + - -<br />
6Well - - -<br />
+<br />
-<br />
AUC/h: 192,6<br />
12Well<br />
+<br />
+<br />
AUC/h: 192,3<br />
328<br />
6Well nicht untersucht<br />
+<br />
-<br />
AUC/h: 406,5<br />
12Well<br />
+<br />
+<br />
AUC/h: 463<br />
+<br />
AUC/h: 6,6 (- 96,6 %)<br />
Unvollständig<br />
AUC/h: 91,9 (- 52,2 %)<br />
428,3 (+ 30,6 %)<br />
-<br />
AUC/h: 543 (+ 33,6 %)<br />
Unvollständig<br />
AUC/h: 434 (- 6,3 %)<br />
Corning Polyester 12Well - - nicht untersucht<br />
Greiner Polyester 6Well/12Well nicht untersucht<br />
Corning Polyester 12Well - - nicht untersucht<br />
Greiner Polyester 6Well/12Well nicht untersucht
DISKUSSION<br />
6 DISKUSSION<br />
Die MDT-Hypothese sucht die Erklärung für pharmakoresistente Epilepsien in<br />
einer vermehrten Expression bzw. einer gesteigerten Funktionalität der MDTs an der<br />
BHS. Substrate der MDTs werden auf diese Weise schneller wieder zurück ins Blut<br />
transportiert. Die MDT der BHS, zu denen auch das gut untersuchte Pgp gehört,<br />
zeigen ein großes Substratspektrum, das u.a. Arzneimittel wie Zytostatika, HIV-<br />
Medikamente und auch Antiepileptika (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a) beinhaltet.<br />
Allerdings ist die Frage, ob und welche Antiepileptika Substrate der einzelnen MDT<br />
darstellen und ob diese auch modulierende Effekte auf deren Funktionalität ausüben,<br />
noch immer nicht geklärt und wird kontrovers diskutiert (OWEN et al. 2001; BALTES<br />
et al. 2007a, b; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012). Einige In-vitro-Studien<br />
mit nicht-endothelialen Zellen erbrachten aber den Nachweis, dass beispielsweise<br />
die Antiepileptika Phenytoin und Topiramat Substrate des MDTs Pgp sind (LUNA-<br />
TORTÓS et al. 2008 & 2009). Sofern dies auch auf Endothelzellen der Hirnkapillaren<br />
zutrifft, würde das geringere Konzentrationen im Gehirn und die damit verbundene<br />
unzureichende Unterdrückung epileptischer Anfälle erklären. Weiterhin besteht die<br />
Annahme, dass Antiepileptika durch die Induktion von MDT selbst zu ihrem<br />
Abtransport aus dem Zielgewebe, dem epileptischen Fokus, beitragen (LOMBARDO<br />
et al. 2008; WEN et al. 2008). Die Medikamente führen zu einer erhöhten Expression<br />
bzw. Funktionalität des Transporters Pgp. Dies bewirkt einen gesteigerten Efflux aus<br />
dem Gewebe ins Blut. In Leber- und Darmzellen sowie in Lymphozyten wurde eine<br />
Induktion von Pgp durch die Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und<br />
Phenytoin bereits nachgewiesen (SCHUETZ et al. 1996; OWEN et al. 2006; MARTIN<br />
et al. 2008). Erste Studien mit der Rattenhirnkapillarendothelzelllinie GPNT zeigten<br />
keine Effekte von Antiepileptika auf die Funktionalität von Pgp (AMBROZIAK et al.<br />
2010). In Experimenten mit der gleichen und einer weiteren<br />
Rattenhirnendothelzelllinie (RBE4) konnte gezeigt werden, dass nach Anpassungen<br />
des Kultivierungs- und Versuchsprotokolls Carbamazepin und Phenytoin eine<br />
induzierende Wirkung auf den Efflux durch Pgp hatten (NEUMANN 2010,<br />
Diplomarbeit).<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde die immortalisierte humane<br />
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 verwendet, um herauszufinden ob diese<br />
Effekte speziesabhängig waren oder auch weitere Antiepileptika zu einer Induktion<br />
137
DISKUSSION<br />
der Pgp-Funktionalität beitragen. Diese Zellen stammen aus dem epileptischen<br />
Fokus einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin. Mit Hilfe dieser Zellen sollte<br />
untersucht werden, ob Antiepileptika einen Einfluss auf humanes Pgp haben.<br />
Des Weiteren sollten hCMEC/D3-Zellen in Transportversuchen eingesetzt<br />
werden, um deren Eignung im Transwell-Modell und den möglichen Transport von<br />
Antiepileptika durch Pgp festzustellen. Die Kulturbedingungen waren für diese Zellen<br />
bekannt (WEKSLER et al. 2005).<br />
Immortalisierte Endothelzellen werden aufgrund ihrer unzureichenden<br />
Integrität der Monolayer für Transportversuche als ungeeignet betrachtet (DELI et al.<br />
2005; ROUX & COURAUD 2005). Die hCMEC/D3-Zellen stellen ein In-vitro-Modell<br />
der BHS dar, deren Eignung aber noch nicht hinreichend geklärt ist. Zum Vergleich<br />
wurden Primärkulturen aus dem Endothel des Rattenhirns gewonnen, die ebenfalls<br />
in funktionellen Experimenten (Kumulations- und Transportversuche) eingesetzt<br />
wurden und Aufschluss über deren Eignung als BHS-Modell geben sollten.<br />
138
DISKUSSION<br />
6.1 Die humane immortalisierte Hirnkapillarendothelzelllinie<br />
hCMEC/D3<br />
6.1.1 Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen<br />
Mit Hilfe des Western Blots konnte in dieser Arbeit ebenfalls nachgewiesen<br />
werden, dass die hCMEC/D3-Zellen Pgp exprimieren. GPNT-Zellen zeigen im<br />
Gegensatz zu RBE4-Zellen eine höhere Pgp-Expression (ROUX & COURAUD<br />
2005). Dies konnte mit dem vergleichenden Western Blot bestätigt werden. Die<br />
humanen Zellen zeigten eine moderate Pgp-Expression, die etwas höher war als die<br />
der RBE4-Zellen, aber signifikant niedriger als in den GPNT-Zellen (Abbildung 5.2).<br />
Diese großen Unterschiede der Pgp-Expression waren auch in der<br />
Funktionalität von Pgp wiederzufinden. Der stärkste Rhodamin-Efflux wurde in<br />
GPNT-Zellen gemessen, der niedrigste in RBE4. Die humanen Zellen lagen wie mit<br />
ihrer Pgp-Expression dazwischen (Abbildung 5.4). Demnach ist die Funktionalität der<br />
GPNT-Zellen durch Induktoren wie Dexamethason nicht weiter zu steigern, was in<br />
dem unter Abbildung 5.4 C dargestellten Versuch bestätigt wurde. In den humanen<br />
und die RBE4-Zellen führte Dexamethason zu einer Induktion des Rhodamin-Efflux,<br />
was auf die niedrigere Pgp-Expression zurückgeführt werden kann. Aufgrund der<br />
Pgp-Expression und der Induktion des Efflux durch Dexamethason erschienen die<br />
hCMEC/D3-Zellen für Untersuchungen der modulatorischen Wirkungen durch<br />
Antiepileptika geeignet.<br />
6.1.2 Die Modulation der Pgp-Funktionalität<br />
Der Kumulations-Assay erlaubt die Untersuchung der Funktionalität von<br />
Transportern. In dieser Arbeit war der MDT Pgp von großer Bedeutung. Die Basis<br />
der vorliegenden Arbeit bildeten die Untersuchungen von AMBROZIAK et al. (2010),<br />
die die Induktion durch Antiepileptika in MDCK II-Zellen (Epithel der Hundeniere) und<br />
in der Rattenhirnendothelzelllinie GPNT untersuchten. Sie verwendeten das von der<br />
FDA empfohlene Pgp-Substrat Digoxin und fanden keine induzierenden Effekte nach<br />
der Behandlung mit den Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und Phenytoin.<br />
Nach Anpassung des Versuchsprotokolls an ein anderes Substrat (Rhodamin 123<br />
statt Digoxin) und der Kultivierung der GPNT-Zellen (Puromycin wurde nur während<br />
der zwei Passagen dem Medium zugefügt) sowie der Verwendung einer weiteren<br />
139
DISKUSSION<br />
Hirnkapillarendothelzelllinie (RBE4), war es möglich zu zeigen, dass die<br />
Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und Topiramat die Funktionalität Pgps<br />
induzieren und das Substrat im Vergleich zu unbehandelten Zellen vermehrt aus den<br />
Zellen heraustransportiert wurde (NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Für<br />
weiterführende Untersuchungen zu diesem Thema wurde die humane<br />
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 herangezogen. Darüber hinaus wurden<br />
vergleichende Untersuchungen mit den Rattenhirnendothelien GPNT und RBE4<br />
durchgeführt. Die Auswahl der Substanzen und ihrer Konzentrationen wurde<br />
erweitert.<br />
6.1.2.1 Optimierung der Versuchsbedingungen<br />
Die Zellen wurden dazu zunächst unter Berücksichtigung verschiedener<br />
Parameter wie z.B. Kultivierungsbedingungen und Auswahl des Substrats<br />
untersucht. Bereits frühere Versuche mit den Rattenhirnendothelien GPNT und<br />
RBE4 zeigten sehr variable Ergebnisse der Kumulationsversuche, die mit dem von<br />
der FDA empfohlenen Pgp-Substrat Digoxin durchgeführt wurden (NEUMANN 2010,<br />
Diplomarbeit). Dieses Substrat, das für Transportversuche in Nierenzellen empfohlen<br />
wird, schien für funktionelle Untersuchungen in diesen Zelllinien nicht geeignet. Der<br />
unter Abbildung 5.3 dargestellte Versuch mit den hCMEC/D3-Zellen zeigte, dass der<br />
Inhibitor Tariquidar nicht zu einer Hemmung des Efflux von Digoxin führte. Dies ließ<br />
darauf schließen, dass Digoxin für Experimente, die die Funktionalität in den<br />
humanen Zellen untersuchen, wie auch in den RBE4- und GPNT-Zellen ungeeignet<br />
war. Digoxin ist ein spezifisches Pgp-Substrat (BECKER & DREWE 2006; siehe<br />
Tabelle 2.1), dennoch könnte eine zu geringe Permeationsgeschwindigkeit dieser<br />
Substanz durch die Membranen ursächlich dafür sein, dass eine Inhibition des Efflux<br />
in der Kürze der Versuchsdauer nicht festzustellen ist. ACHARYA et al. (2008) gehen<br />
nach Transportstudien mit MDCK II-Zellen (aus der Niere des Hundes) davon aus,<br />
dass Digoxin nicht allein von Pgp sondern zusätzlich von einem weiteren Transporter<br />
transportiert wird, der basolateral lokalisiert ist. Dieser noch nicht näher beschriebene<br />
Transporter ist nicht in allen Zellen zu finden, sodass man folglich den nicht<br />
messbaren Transport bzw. Efflux von Digoxin mit dem Fehlen des basolateralen<br />
Transporters erklären könnte. Um Modulationen der Funktion des MDTs Pgp durch<br />
Substanzen in hCMEC/D3-Zellen untersuchen zu können, wurde ein anderes<br />
bekanntes Pgp-Substrat verwendet, Rhodamin 123 (EFFERTH et al. 1989; LEE et al.<br />
140
DISKUSSION<br />
1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009). Einige Studien vermuten, dass ein<br />
Efflux von Rhodamin 123 auch in BCRP-exprimierenden Zellen stattfindet, aber<br />
Untersuchungen im hiesigen Labor an BCRP-transfizierten MDCK II-Zellen (K.<br />
Römermann, unveröffentlichte Daten) und ROBEY et al. (2001) konnten keinen<br />
BCRP-vermittelten Rhodamin-Efflux nachweisen.<br />
Die Kumulations-Assays mit Rhodamin 123 führten zum Nachweis<br />
funktionellen Pgps in hCMEC/D3-Zellen, welches durch bekannte Induktoren und<br />
den Pgp-Inhibitor Tariquidar beeinflusst werden konnte. Zudem variierten die<br />
Ergebnisse der Kumulations-Assays nicht so stark und ließen folglich auf robustere<br />
Daten als mit dem Pgp-Substrat Digoxin schließen. Außerdem war es möglich,<br />
modulierende Effekte nach der Behandlung mit Antiepileptika zu detektieren.<br />
Rhodamin 123 war unter den gewählten Versuchsbedingungen ein geeignetes<br />
Substrat, um Modulationen der Pgp-Funktionalität zu untersuchen.<br />
In ersten Versuchen wurde der Einfluss des Serums sowie weiterer<br />
Mediumszusätze auf den Efflux deutlich. Nach dem Protokoll von P.-O. Couraud<br />
werden die hCMEC/D3-Zellen mit standardisiertem bovinem Serum kultiviert.<br />
Aufgrund der hier durchgeführten Versuche und Vergleiche (Abbildung 5.4) wurde für<br />
die Kumulationsexperimente nicht-standardisiertes Serum verwendet.<br />
6.1.2.2 Bekannte Pgp-Induktoren<br />
Um das Ausmaß einer Induktion durch Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen<br />
abschätzen zu können, wurden geeignete Kontrollen benötigt. Diese sollten in den<br />
Kumulationsversuchen sicherstellen, dass die Pgp-Funktionalität auch beeinflusst<br />
werden konnte sowie Informationen über die Empfindlichkeit dieses Assays geben.<br />
Dazu wurden bekannte Pgp-Induktoren eingesetzt, das Glukokortikoid<br />
Dexamethason, die Zytostatika Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin<br />
(FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999; DEMEUSE et al. 2004) und der<br />
Neurotransmitter Glutamat. Die Zellen wurden mit diesen sechs Substanzen und<br />
dem bekannten Pgp-Inhibitor Tariquidar behandelt. Mit Ausnahme des Inhibitors<br />
erfolgte die Behandlung dabei i.d.R. über 3 Tage mit Beginn am 3. Tag nach<br />
Erreichen der Konfluenz. Die gewählten Bedingungen für den Kumulations-Assay<br />
waren für bekannte Pgp-Induktoren sensitiv genug, um Pgp-Induktionen nachweisen<br />
zu können. Allerdings waren die Effekte dieser Induktoren sehr unbeständig. So<br />
führte beispielsweise Dexamethason, welches einen bekannten Induktor für Pgp<br />
141
DISKUSSION<br />
darstellt (SCHINKEL et al. 1996; FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999), in<br />
einigen Versuchen zur Induktion des Efflux. In weiteren Experimenten konnte dieser<br />
Effekt nicht immer wiederholt werden. Es wurden verschiedene Konzentrationen<br />
dieser Substanz getestet, allerdings konnte keine Konzentration gefunden werden,<br />
die in allen Versuchen robuste Effekte lieferte. Die Untersuchung weiterer bekannter<br />
Pgp-Induktoren wie Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin zeigte für<br />
einzelne Konzentrationen eine Induktion der Pgp-Funktionalität (Abbildung 5.5).<br />
Für alle getesteten Pgp-Induktoren fiel auf, dass die Effekte in den<br />
hCMEC/D3-Zellen konzentrationsabhängig zu sein schienen. Sofern mehrere<br />
Konzentrationen getestet wurden, führten oftmals die höheren Dosierungen zu einer<br />
Induktion des Rhodamin-Efflux bzw. einer noch stärkeren Induktion. In der<br />
Zusammenfassung aller Versuche in Abbildung 5.7 ist zu sehen, dass<br />
Dexamethason und Puromycin jeweils in der höchsten Konzentration die stärksten<br />
induzierende Effekte zeigten. In Untersuchungen einer anderer Arbeitsgruppe mit<br />
Caco-2-Zellen (aus dem Darm) führte Rifampicin in der Konzentration von 20 µM<br />
ebenfalls zu einer Induktion des Efflux durch Pgp (DIXIT et al. 2002). Diese<br />
Konzentration sowie weitere (5 und 10 µM) führten in der vorliegenden Arbeit zu<br />
einer Inhibition des Efflux in den hCMEC/D3-Zellen. Erst in der Konzentration von 50<br />
µM Rifampicin wurde der Rhodamin-Efflux in den humanen Zellen signifikant<br />
induziert (Abbildung 5.7). Höhere Konzentrationen für Puromycin (2,65 µM) und<br />
Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) zeigten inhibitorische Wirkungen, was anhand<br />
eines erhöhten Rhodamin-Gehalts im Vergleich zur Kontrolle zu erkennen war<br />
(Daten nicht gezeigt).<br />
Vincristin führte als einzige Substanz zu reproduzierbaren Ergebnissen und<br />
induzierte die Pgp-Funktionalität. In der höheren Konzentration von 40 nM wirkte<br />
Vincristin toxisch, was sich als Zellablösungen zeigte (Daten nicht dargestellt). Diese<br />
Effekte traten auch nach höheren Konzentrationen für Doxorubicin (0,92 µM),<br />
Puromycin (2,65 µM) und Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) auf. Während der<br />
Behandlung kam es zu zum Teil starken Ablösungen der Zellen. Derartige Effekte<br />
waren zu erwarten, da es sich bei den genannten Substanzen um Zytostatika handelt<br />
(BITTER 1977; FISCHER 1994; HUGHES & CALVIN 1979; YARMOLINSKY & DE<br />
LA HABA 1959). Zudem weisen hCMEC/D3-Zellen im Vergleich zur<br />
Rattenhirnendothelzelllinie GPNT einen geringeren Gehalt an Pgp auf (siehe<br />
Abschnitt 5.1.2), weshalb die Zellen nur in einem geringeren Ausmaß in der Lage<br />
142
DISKUSSION<br />
sind, Substanzen schnellstmöglich aus den Zellen zu transportieren und sich auf<br />
diese Weise vor toxischen Wirkungen zu schützen. Die Behandlungen mit diesen<br />
hohen Konzentrationen führten i.d.R. zu einer Induktion des Efflux, dennoch wurden<br />
diese Daten aus der Gesamtwertung ausgeschlossen. Der Rhodamin-Gehalt wird<br />
zwar auf die Proteinkonzentration bezogen und nimmt demnach auch Bezug auf eine<br />
geringere Zellzahl. Trotzdem wären falsch positive hinsichtlich einer Induktion<br />
denkbar, weshalb die induzierenden Effekte nach Zellablösungen unter Vorbehalt zu<br />
betrachten sind. Mit dem spezifischen Hemmstoff Tariquidar (SZAKÁCS et al. 2006)<br />
konnte stets eine Inhibition des Rhodamin-Efflux nachgewiesen werden, d.h. dass<br />
die Zellen funktionelles Pgp aufwiesen.<br />
Der Vergleich der hCMEC/D3-Zellen mit den Rattenhirnkapillarendothelien<br />
GPNT und RBE4 zeigte funktionelles Pgp in allen drei Zelllinien, wobei der stärkste<br />
Efflux des Substrats bei den GPNT-Zellen auftrat (Abbildung 5.4). Im vergleichenden<br />
Kumulations-Assay konnte der Rhodamin-Efflux in RBE4-Zellen ebenfalls durch<br />
Dexamethason induziert werden. In GPNT-Zellen war dieser Effekt nicht zu sehen.<br />
Außerdem zeigten diese Zellen einen höheren Efflux, der an dem niedrigen<br />
intrazellulären Rhodamin-Gehalt zu erkennen war. Der Efflux der Kontrollgruppen der<br />
hCMEC/D3- und RBE4-Zellen fiel geringer aus. Als Ursache für diesen variablen<br />
Efflux wären unterschiedliche Pgp-Gehalte als Ursache denkbar. Dies konnte<br />
anhand der Western Blots bestätigt werden (Abbildung 5.2). Die GPNT-Zellen<br />
zeigten demnach die höchste Pgp-Expression. Solch hohe Expressionen können<br />
durch Induktoren kaum gesteigert werden, was in dem Kumulationsversuch zu sehen<br />
war. In allen drei Zelllinien bestand eine Korrelationen zwischen der Funktion und der<br />
Expression des Transporters Pgp.<br />
Weitere Ursachen für dieses unterschiedliche Ausmaß des Rhodamin-Efflux<br />
könnten die Herkunft (Spezies und Organ) oder die verschiedenen Mechanismen für<br />
die Pgp-Induktion sein. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Pgp-Funktion über<br />
die ONRs PXR und CAR vermittelt wird. Diese Rezeptoren werden u.a. auch an der<br />
BHS exprimiert (BAUER et al. 2006) und sorgen dort durch Induktionen von MDT für<br />
den Abtransport von Xenobiotika. Die Expression dieser Rezeptoren ist allerdings<br />
sehr variabel und wird als gewebe- und zellspezifisch erachtet (XU et al. 2005;<br />
CHEN 2010). Bestimmte Substanzen stimulieren die Rezeptoren, die wiederum Pgp<br />
induzieren (BAUER et al. 2005; OTT et al. 2009). Für Rifampicin wiesen CHEN &<br />
RAYMOND (2006) und ZHOU et al. (2008) nach, dass dessen Wirkung PXR-<br />
143
DISKUSSION<br />
vermittelt ist. MILLER et al. (2008) zeigten außerdem, dass Rifampicin besonders<br />
stark an humanes PXR gebunden wird. So kann die Induktion von Rifampicin auf die<br />
Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen (Abbildung 5.5) erklärt werden.<br />
Dexamethason, für das ebenfalls eine induzierende Wirkung über PXR<br />
nachgewiesen wurde (PASCUSSI et al. 2000; NARANG et al. 2008), zeigte in den<br />
humanen und RBE4-Zellen ebenfalls eine Induktion der Pgp-Funktionalität, aber<br />
nicht in GPNT-Zellen (Abbildung 5.4). AMBROZIAK et al. (2010) konnten in GPNT-<br />
Zellen PXR nur in einem geringen Maß, CAR gar nicht nachweisen, was den<br />
ausbleibenden Effekt von Dexamethason in GPNT-Zellen erklären würde.<br />
Über die ONRs hinaus wären aber auch noch weitere Mechanismen denkbar.<br />
DAUCHY et al. (2009) konnten beispielsweise zeigen, dass sowohl PXR als auch<br />
CAR in hCMEC/D3-Zellen herunterreguliert sind. Dies würde erklären, warum<br />
Dexamethason in den getesteten Konzentrationen nicht immer zur Induktion in<br />
diesen Zellen führte. Außerdem wurden in vorhergehenden Versuchen mit GPNT-<br />
Zellen induzierende Effekte durch Dexamethason auf die Pgp-Funktionalität<br />
nachgewiesen (ALMS et al. 2012).<br />
6.1.2.3 Antiepileptika<br />
Ein Ziel dieser Arbeit war es, Antiepileptika bezüglich ihrer modulatorischen<br />
Wirkung auf den Efflux-Transporter Pgp zu untersuchen. Der Nachweis der Induktion<br />
durch Antiepileptika (Carbamazepin, Phenobarbital, Phenytoin) wurde bereits in<br />
Darm- und Leberzellen und Lymphozyten erbracht (SCHUETZ et al. 1996; OWEN et<br />
al. 2006; MARTIN et al. 2008). Nachdem diese Effekte auch in den<br />
Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 gezeigt werden konnten<br />
(LOMBARDO et al. 2008; ALMS et al. 2012), sollte dies nun auch in einer Zelllinie<br />
humanen Ursprungs untersucht werden. Erste Versuche der vorliegenden Arbeit<br />
konzentrierten sich darauf, geeignete Versuchsbedingungen (Einflüsse auf die<br />
Kultivierung, Induktoren) zu finden. Dazu wurden Untersuchungen zur Modifikation<br />
von Pgp durch Antiepileptika mit Gruppengrößen n=3 durchgeführt, die aber später in<br />
einer Gesamtauswertung zusammengefasst wurden. In den einzelnen Versuchen<br />
wurden möglichst viele Antiepileptika in verschiedenen Konzentrationen hinsichtlich<br />
ihrer möglichen induzierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität untersucht.<br />
Einige Antiepileptika stellen Substrate für Pgp dar (CROWE & TEOH 2006;<br />
LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). Für Lamotrigin, Levetiracetam, Oxcarbazepin,<br />
144
DISKUSSION<br />
Phenobarbital, Phenytoin und Topiramat wurde nachgewiesen, dass sie Substrate<br />
für Pgp in Nagern und im Menschen sind. Für Valproat und Carbamazepin ist dies<br />
noch nicht abschließend geklärt (LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012).<br />
Allerdings muss ein Pgp-Substrat nicht gleichzeitig ein Induktor dieses Efflux-<br />
Transporters sein (BECKER & DREWE 2006; siehe Tabelle 2.1). Die meisten Pgp-<br />
Induktoren sind i.d.R. auch Induktoren der Cytochrom-P 450 -Enzyme (GUTMANN &<br />
DREWE 2002). Bei den älteren Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und<br />
Phenytoin handelt es sich um Substanzen, die das Cytochrom-P 450 -System<br />
induzieren (LÖSCHER & SCHMIDT 2011), was einen beschleunigten Abbau dieser<br />
Antiepileptika durch diese Enzyme zur Folge hat. Neuere Antiepileptika zeigen diese<br />
Induktion der Cytochrom-P 450 -Enzyme oftmals nicht, weil während der Synthese ein<br />
möglicher oxidativer Metabolismus vermieden wurde (BECKER & DREWE 2006).<br />
In der vorliegenden Arbeit ließen drei der sechs untersuchten Antiepileptika<br />
keinen Einfluss auf die Pgp-Funktionalität erkennen (Abbildung 5.9 & 5.12). Dabei<br />
wird davon ausgegangen, dass eine verringerte Rhodamin-Kumulation in den Zellen<br />
auf eine gesteigerte Funktionalität oder Expression von Pgp zurückzuführen ist (LEE<br />
et al. 1994). Carbamazepin und Valproat verursachten in den humanen Zellen einen<br />
erniedrigten Rhodamin-Gehalt. Allerdings waren diese Effekte moderat, und<br />
Induktionen konnten für die Substanzen v.a. in den höheren Konzentrationen<br />
nachgewiesen werden (Abbildung 5.9). Ähnlich verhielt es sich in RBE4-Zellen.<br />
Induktionen der Pgp-Funktionalität wurden nach der Behandlung mit Carbamazepin<br />
(10 und 50 µM) und Topiramat (100 µM) nachgewiesen (Abbildung 5.12 B). In<br />
hCMEC/D3-Zellen führten einzelne Konzentrationen für Phenobarbital (300 µM),<br />
Phenytoin (10 und 30 µM), Topiramat (300 µM) und Valproat (100 µM) zu Tendenzen<br />
einer Inhibition bzw. zu einem signifikanten Anstieg der Rhodamin-Kumulation<br />
(Abbildung 5.8 B, C & E und 5.9). Eine Inhibition des Efflux durch Valproat (300 µM)<br />
wurde ebenfalls in RBE4-Zellen nachgewiesen (Abbildung 5.12 B). Dies lässt<br />
vermuten, dass die Substanzen in diesen Konzentrationen eine Inhibition der<br />
Transporter-Funktionalität verursachen, wenn das Ausmaß dieser Hemmung auch<br />
geringer ausfiel als für den Inhibitor Tariquidar. Möglicherweise wurde aber durch die<br />
Konzentrationssteigerung ein toxischer Bereich erreicht, in dem die Zellen das<br />
Antiepileptikum nicht mehr in ausreichendem Maß bewältigen können, und es zu<br />
negativen Effekten für die Zellen kommt. Es bleibt festzuhalten, dass Valproat als<br />
einzige Substanz in therapeutischen Konzentrationen (250-500 µM) zu einer<br />
145
DISKUSSION<br />
Inhibition der Pgp-Funktion führte (Abbildungen 5.8 E und 5.12 B). Die Ursache bleibt<br />
zu klären, aber WEISS et al. (2003) zeigten in Untersuchungen mit LLC-Zellen<br />
ebenfalls inhibitorische Effekte nach der Behandlung mit Valproat (> 100 µM) und<br />
Phenytoin (> 100 µM). In der Zusammenfassung der einzelnen Effekte nach der<br />
Behandlung mit Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen zeigten lediglich Carbamazepin<br />
und Valproat eine Induktion der Pgp-Funktionalität. Die inhibitorischen Effekte der<br />
anderen Antiepileptika wurden in der zusammenfassenden Darstellung der<br />
Einzelversuche aufgehoben (Abbildung 5.9). In GPNT-Zellen führte keines der<br />
untersuchten Antiepileptika zu einer Modulation der Pgp-Funktionalität, was mit der<br />
fehlenden bzw. geringen Expression von PXR und CAR begründet werden kann<br />
(AMBROZIAK et al. 2010).<br />
Die modulatorischen Wirkungen der untersuchten Antiepileptika waren nicht<br />
mit den Effekten bekannter Induktoren vergleichbar. Dies könnte mehrere Ursachen<br />
haben. Zum einen wäre es möglich, dass Antiepileptika in therapeutischen<br />
Konzentrationen Pgp an der BHS nicht induzieren. Zum anderen könnten Beginn und<br />
Dauer der Behandlung eine Rolle spielen. So könnten die Zellen zu Beginn der<br />
Behandlung (i.d.R. am 3. Tag nach Erreichen der Konfluenz) beispielsweise noch<br />
nicht ausdifferenziert und dementsprechend noch wenig Pgp vorhanden sein. Dies<br />
würde durch Antiepileptika nur wenig oder gar nicht beeinflusst werden. Andererseits<br />
stammen die hCMEC/D3-Zellen aus dem epileptischen Fokus einer<br />
pharmakoresistenten Patientin, weshalb man von einer erhöhten Pgp-Expression<br />
ausgehen kann. Damit wären schwache Induktoren, wie z.B. Antiepileptika, bei<br />
einem bereits sehr hohen Pgp-Gehalt nicht in der Lage, die Funktionalität weiter zu<br />
induzieren. Dennoch zeigten die Zellen im Vergleich mit GPNT-Zellen eine signifikant<br />
geringere Expression dieses Transporters, weshalb eine Steigerung der Expression<br />
möglich wäre. Mit einer längeren Behandlungsdauer könnten möglicherweise mehr<br />
induzierende Effekte auf die Pgp-Funktionalität nachgewiesen werden. Für Valproat<br />
wurde in einem einzelnen Versuch die Behandlung auf 6 Tage ausgedehnt.<br />
Unterschiede im Vergleich zur 3-tägigen Behandlung waren nicht zu erkennen.<br />
Allerdings zeigten WEN et al. (2008), dass eine 21-tägige Behandlung mit den<br />
Antiepileptika Phenobarbital, Carbamazepin und Phenytoin zu einer signifikant<br />
erhöhten Pgp-Expression im Gehirn der Ratte führten. LOMBARDO et al. (2008)<br />
konnten Induktionen der Pgp-Expression in GPNT- und RBE4-Zellen durch die<br />
Behandlung mit Phenobarbital, Carbamazepin und Phenytoin bereits nach 3 Tagen<br />
146
DISKUSSION<br />
nachweisen. In wie weit sich die Expression dann auch auf die Funktionalität<br />
auswirkt, ist unklar. Allerdings zeigten YANG et al. (2008) in In-vitro-Experimenten<br />
mit Rattenhirnendothelien, dass die Funktionalität und Expression von Pgp nach<br />
einer 60-tägigen Behandlung mit Antiepileptika (Carbamazepin, Phenobarbital,<br />
Phenytoin und Valproat) und Rifampicin parallel induziert wurden. Dennoch müssen<br />
Funktionalität und Expression von Pgp nicht zwangsläufig miteinander korrelieren.<br />
Wenn Substanzen nur über einen relativ kurzen Zeitraum auf die Funktionalität<br />
einwirken, müssen mögliche Effekte nicht unbedingt auch für die Expression gelten.<br />
Ebenso müssen Abweichungen in der Expression nicht mit einer veränderten<br />
Funktionalität einhergehen. Ungeachtet dessen könnte die Dauer der Behandlung in<br />
den hier dargestellten Versuchen (drei Tage) den Nachweis stärkerer Induktionen<br />
durch Antiepileptika unmöglich gemacht haben. Im Gegensatz dazu zeigten<br />
fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Pgp-Trafficking an mit grünfluoreszierenden<br />
Pgp (GFP-Pgp) transfizierten hCMEC/D3-Zellen in der hiesigen<br />
Arbeitsgruppe, dass bereits zwei Stunden nach der Behandlung mit der Pgpinduzierenden<br />
Substanz Mitomycin C die Translokation von Pgp aus dem Zytosol zu<br />
den Membranen erfolgt. Eine Auswirkung auf die Funktionalität bzw. Expression war<br />
erst 24 h später nachweisbar (A. Noack, Publikation in Revision), wobei es sich um<br />
eine kürzere Zeitspanne handelt als für die in dieser Arbeit durchgeführten<br />
Behandlungen. Zu beachten ist aber, dass intrazelluläres Pgp-Trafficking von der<br />
Polarisation der Zellen und auch der Wahl der Zelllinie abhängig ist (FU & ARIAS<br />
2012) und demzufolge Studien mit verschiedenen Zellkulturmodellen zu<br />
unterschiedlichen Ergebnissen kommen können.<br />
Bezüglich der Kultivierungsdauer (Anzahl der Passagen) könnte ein variabler<br />
Pgp-Gehalt in den Zellen dafür verantwortlich sein, dass die Grundfunktion verändert<br />
wird und robuste Effekte nur schwer nachweisbar sind. Das Ausmaß der Expression<br />
von Pgp im Laufe der Kultivierung von Zellen kann durchaus einen Einfluss auf den<br />
Nachweis bestimmter Effekte haben. Ein unterschiedliches Ausmaß des Efflux war<br />
aber in Abhängigkeit der Kultivierungsdauer und der Passagenzahl der hCMEC/D3-<br />
Zellen nicht erkennbar. Dennoch ist eine genauere Kenntnis zum Einfluss der Dauer<br />
der Zellkultur und Behandlung auf die Expressions- und Funktionalitätslevel<br />
unbedingt notwendig.<br />
Die Induktion von Pgp wird u.a. über die Rezeptoren CAR und PXR vermittelt<br />
(EKINS & ERICKSON 2002; WANG & LECLUYSE 2003). Außerdem zeigten<br />
147
DISKUSSION<br />
NALLANI et al. (2003) und CHEN et al. (2004) in Leberzellen Interaktionen zwischen<br />
dem Pregnane-X-Rezeptor (PXR) und den Antiepileptika Phenobarbital und<br />
Topiramat. AMBROZIAK et al. (2010) untersuchten bereits die Induktion einer<br />
Überexpression von Pgp durch die Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und<br />
Phenytoin und den bekannten Pgp-Induktor Dexamethason in MDCK II-Zellen<br />
(Hundeniere) und GPNT-Zellen (Rattenhirn). Dabei konnte keine induzierende<br />
Wirkung auf Pgp nachgewiesen werden. Die Expression von PXR und CAR ist<br />
allerdings gewebe- und zellspezifisch und sehr variabel (XU et al. 2005; CHEN<br />
2010). Laut DAUCHY et al. (2009) sind beide Rezeptoren in hCMEC/D3-Zellen<br />
herunterreguliert. Dies könnte für das geringe Ausmaß an Modulationen der Pgp-<br />
Funktionalität in den humanen Zellen verantwortlich sein. AMBROZIAK et al. (2010)<br />
konnten in GPNT-Zellen PXR nicht und CAR nur in einem geringen Ausmaß<br />
nachweisen. Dies könnte der Grund für die ausleibenden Induktionen durch<br />
Antiepileptika in diesen Rattenzellen sein.<br />
Um mögliche falsch positive oder negative Effekte ausschließen zu können,<br />
müssten weitere Kumulationsversuche zu den einzelnen Antiepileptika durchgeführt<br />
werden. Insgesamt ist zu sagen, dass Carbamazepin, Topiramat und Valproat die<br />
stärksten induzierenden Effekte auf die Funktionalität von Pgp aufwiesen. Doch auch<br />
diese Effekte waren moderat. Die hCMEC/D3-Zellen waren eher unempfindlich<br />
gegenüber den untersuchten Pgp-Induktoren und Antiepileptika, obgleich sie eine<br />
relativ geringe Pgp-Expression aufwiesen (Abbildung 5.2). In RBE4-Zellen wurden<br />
aufgrund einer geringen Expression induzierende Effekte nachgewiesen. Die<br />
weiteren Antiepileptika zeigten Tendenzen zur Induktion der Pgp-Funktionalität. Die<br />
GPNT-Zellen zeigten eine vergleichsweise sehr hohe Pgp-Expression, weshalb nach<br />
der Behandlung mit Antiepileptika keine Effekte beobachtet wurden.<br />
6.1.2.4 Hydrocortison<br />
Die hCMEC/D3-Zellen werden im Allgemeinen nach dem Protokoll von P.-O.<br />
Couraud mit 1,4 µM Hydrocortison kultiviert. Diese Substanz fördert die Ausbildung<br />
von Tight junctions (FÖRSTER et al. 2008). In porcinen Hirnkapillarendothelzellen<br />
bewirkte Hydrocortison einen Anstieg des TEER um den Faktor 2,5 innerhalb von 3<br />
Tagen (HOHEISEL et al. 1998), womit die Barriereeigenschaften der Zellen gefördert<br />
werden. Dieser Effekt ist für Transportuntersuchungen wünschenswert, aber für<br />
Kumulationsstudien nicht notwendig. Gleichzeitig kann Hydrocortison induzierend auf<br />
148
DISKUSSION<br />
die Pgp-Funktionalität wirken (MAINES et al. 2005) und damit Induktionen durch<br />
andere Substanzen überdecken. Die humanen Zellen wurden für die Kultivierung und<br />
Behandlungszeiträume bis zu den beschriebenen Kumulationsversuchen dem<br />
Hydrocortison im Medium ausgesetzt. Zur Überprüfung des Einflusses auf die Pgp-<br />
Funktionalität wurden zwei vergleichende Kumulations-Assays durchgeführt, in<br />
denen die Zellen ab der Aussaat mit und ohne Hydrocortison kultiviert und mit<br />
verschiedenen Substanzen behandelt wurden. Die Zellen ohne Hydrocortison wiesen<br />
einen höheren Rhodamin-Gehalt auf (Abbildung 5.10 A), was möglicherweise auf<br />
eine geringere Pgp-Funktionalität oder –Expression zurückgeführt werden kann.<br />
Allerdings würde man dann eine geringe Inhibition durch Tariquidar erwarten. Die<br />
signifikant höhere Inhibition durch Tariquidar bei den Zellen ohne Hydrocortison kann<br />
damit nicht erklärt werden.<br />
Sowohl die Gruppe mit Hydrocortison als auch ohne reagierten auf eine relativ<br />
hohe Konzentration an Doxorubicin (0,92 µM) in Form von Zellablösungen, wobei die<br />
Zellen ohne Hydrocortison stärkere Zellablösungen zeigten und empfindlicher<br />
reagierten (nicht dargestellt). Dies lässt darauf schließen, die Zellen ohne<br />
Hydrocortison eine geringere Pgp-Funktion aufweisen und somit toxische Wirkungen<br />
durch das Zytostatikum ermöglicht werden. Weiterhin zeigten die Zellen ohne<br />
Hydrocortison eine höhere Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit<br />
Antiepileptika (Abbildung 5.10 B), die sich auch in inhibitorischen Effekten äußerte.<br />
Hydrocortison induzierte also die Pgp-Funktionalität, wodurch induzierende Effekte<br />
anderer Substanzen überdeckt werden können. Um die Modulationen durch<br />
Antiepileptika weiter zu untersuchen, sollten die humanen Zellen für weitere<br />
Kumulationsversuche ohne Hydrocortison kultiviert werden.<br />
6.1.2.5 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp<br />
Zusammenfassend ist zu sagen, dass in den hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-<br />
Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden konnte. Die Funktion dieses<br />
Transporters wurde durch bekannte Pgp-Induktoren und -Inhibitoren sowie<br />
Antiepileptika moduliert. Generell reagierten die humanen Zellen und GPNT-Zellen<br />
im Vergleich zu den RBE4-Zellen aber relativ unempfindlich gegenüber Modulationen<br />
durch Antiepileptika und bekannte Pgp-Induktoren. In weiterführenden<br />
Untersuchungen sollten die Ursachen dieser modulatorischen Effekte, die<br />
beispielsweise über die ONRs vermittelt werden, genauer betrachtet werden.<br />
149
DISKUSSION<br />
6.1.3 hCMEC/D3-Zellen als In-vitro-Bluthirnschranken-Modell<br />
Mehrere Studien in Epithelzellen der Niere, die sich mit ihrer hohen Integrität<br />
der Monolayer für Transportuntersuchungen eignen (LUNA-TORTÓS et al. 2008 &<br />
2009), belegten bereits den Transport von Antiepileptika durch Pgp (LÖSCHER et al.<br />
2011; ZHANG et al. 2012). Bislang gibt es kein ideales Modell der BHS und Daten<br />
aus Untersuchungen mit humanem Gewebe bzw. Zellen sind kaum bekannt. Es<br />
wurden Untersuchungen an hCMEC/D3-Zellen durchgeführt, die zur Entwicklung<br />
neuer und besserer Modelle für die BHS beitragen sollen (WEKSLER et al. 2005;<br />
CUCULLO et al. 2008; POLLER et al. 2008; TAI et al. 2009). Aufgrund der<br />
Expression von Efflux-Transportern wie Pgp, MRP1 und BCRP (WEKSLER et al.<br />
2005; DAUCHY et al. 2009), die die Zellen zum aktiven Substanz-Transport<br />
befähigen, gelten hCMEC/D3-Zellen als geeignetes Werkzeug für Studien zur<br />
Entzündungs- und Infektionsantworten und der BHS-Funktion (CUCULLO et al.<br />
2008; FASLER-KAN et al. 2010; POLLER et al. 2010; DANIELS et al. 2012).<br />
POLLER et al. (2008) und weitere Arbeitsgruppen berichteten vom Einsatz der<br />
hCMEC/D3-Zellen als BHS-Modell für Transportuntersuchungen (CARL et al. 2010;<br />
HSUCHOU et al. 2010). Sie untersuchten die parazellulären Permeabilitäten von<br />
Markersubstanzen wie Sucrose, Inulin und Mannitol, die durch die Verwendung von<br />
humanem Serum im Kulturmedium der Zellen reduziert wurden, und zeigten<br />
außerdem den direkten Pgp-vermittelten Transport von Rhodamin 123 (POLLER et<br />
al. 2008). Des Weiteren untersuchten HATHERELL et al. (2011) eine verbesserte<br />
Anwendung der hCMEC/D3-Zellen durch die Kokultur mit Astrozyten, die zu einer<br />
Erhöhung der TEER-Werte führte und damit die Integrität der Zellmonolayer förderte.<br />
Dennoch wird der Einsatz der hCMEC/D3-Zellen als BHS-Modell kontrovers<br />
diskutiert (URICH et al. 2012), v.a. weil immortalisierte Hirnendothelzelllinien nur eine<br />
unzureichende Dichtigkeit der Monolayer aufweisen und damit für<br />
Transportuntersuchungen als ungeeignet gelten (DELI et al. 2005; ROUX &<br />
COURAUD 2005). Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit der Einsatz<br />
der humanen immortalisierten Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-BHS-Modell weiter<br />
untersucht werden.<br />
In vielen In-vivo- und In-vitro-Studien wurde untersucht, ob MDT wie zum<br />
Beispiel das Pgp Antiepileptika transportieren (SCHINKEL et al. 1996; MAHAR<br />
DOAN et al. 2002; BALTES et al. 2007a, b; LUNA-TORTÓS et al. 2008; ROBEY et<br />
150
DISKUSSION<br />
al. 2008a). Dies ist laut der MDT-Hypothese eine Erklärung für die<br />
Pharmakoresistenz bei Epilepsien (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b; SCHMIDT &<br />
LÖSCHER 2009). Für etliche Antiepileptika wie z.B. Levetiracetam, Phenobarbital,<br />
Phenytoin, Topiramat und Valproat wurde bereits nachgewiesen, dass sie von Pgp<br />
transportiert werden (LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012), womit geringe<br />
Konzentrationen der Antiepileptika im Gehirn zu erklären wären. Welche weiteren<br />
Antiepileptika Substrate von MDT darstellen und dementsprechend modulierende<br />
Effekte möglich sind, wird nach wie vor diskutiert (OWEN et al. 2001; BALTES et al.<br />
2007a, b; LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al.<br />
2012). Der Transport von u.a. Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin und<br />
Topiramat durch Pgp wurde in den Zelllinien LLC und MDCK II nachgewiesen<br />
(LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009), die aus dem Nierenepithel des Schweins bzw.<br />
des Hundes stammen. Um den Transport von Antiepileptika durch Pgp an der BHS<br />
untersuchen zu können, wurde deshalb die Hirnendothelkapillarzellen hCMEC/D3<br />
eingesetzt. Sofern sich diese immortalisierte Zelllinie für die Anwendung als BHS-<br />
Modell eignet, sollte in weiterführenden Studien der Transport von Antiepileptika in<br />
Hirnendothelzellen humanen Ursprungs untersucht werden.<br />
6.1.3.1 Einflüsse auf den Nachweis von Pgp-spezifischen Transport<br />
Es wurden verschiedene bekannte Pgp-Substrate und Einflüsse durch das<br />
Membranmaterial, Mediumszusätze (Simvastatin, weitere Wachstumsfaktoren), den<br />
Ursprung und die Qualität des Serums und das Format der Membraneinlagen<br />
untersucht.<br />
Auswahl des Substrats<br />
In Untersuchungen des Transports in Zellen aus Nierenepithel (LLC-PK1 und<br />
MDCK II) wurde der Transport von Digoxin durch Pgp nachgewiesen<br />
(TAIPALENSUU et al. 2004; ACHARYA et al. 2008; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und<br />
2009). Dieses von der FDA empfohlene Substrat für Transportstudien in Nierenzellen<br />
(FDA, 2006) zeigte trotz Variation und Optimierung der Versuchsbedingungen in<br />
keinem der Versuche mit hCMEC/D3-Zellen einen Transport, obgleich mehrere<br />
Parameter angepasst wurden (Abbildung 5.14, 5.15 & 5.20). Ähnlich verhielt es sich<br />
mit Verapamil, welches ebenfalls ein Pgp-Substrat darstellt (HENDRIKSE et al. 1998;<br />
LEE et al. 2006; Abbildung 5.15) und für das in Studien von SHIRASAKA et al.<br />
151
DISKUSSION<br />
(2008) ein konzentrationsabhängiger Transport in Caco-2- und MDCK II-Zellen<br />
nachgewiesen wurde. Möglicherweise wurde ein Transport von Verapamil und<br />
Digoxin durch die hohe parazelluläre Permeabilität der humanen Zellen überdeckt,<br />
was die Problematik dieser immortalisierten Endothelzellen als Transwell-Modell<br />
bestätigen würde. Allerdings wird von ACHARYA et al. (2008) angenommen, dass<br />
Digoxin neben Pgp von einem anderen noch nicht weiter beschriebenen Transporter<br />
in MDCK II-Zellen transportiert wird. Sofern dieser Transporter nicht in allen Zellen zu<br />
finden ist, könnte auf diese Weise erklärt werden, warum der Transport von Digoxin<br />
in hCMEC/D3-Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Allerdings weisen die recht<br />
niedrigen TEER-Werte und v.a. die hohen Mannitol-Permeabilitäten darauf hin, dass<br />
aufgrund der unzureichenden Integrität der parazelluläre Transport von Digoxin und<br />
Verapamil wesentlich höher war als ein Pgp-vermittelter Transport dieser<br />
Substanzen.<br />
In allen Versuchen, in denen ein asymmetrischer Transport in den in dieser<br />
Arbeit beschriebenen Versuchen festzustellen war, handelte es sich um die Substanz<br />
Rhodamin 123, die ebenfalls ein Pgp-Substrat darstellt (EFFERTH et al. 1989; LEE<br />
et al. 1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009) und für Transportexperimente mit<br />
diesen Zellen geeignet erschien. Die Vermutung, dass Rhodamin 123 auch von<br />
BCRP transportiert wird, konnte von ROBEY et al. (2001) und in Studien im hiesigen<br />
Labor (K. Römermann, unveröffentlichte Daten) nicht bestätigt werden.<br />
Einflüsse auf den Widerstand und die Permeabilität<br />
Dichte Zellmonolayer sind für Transport-Assays unerlässlich. Die Dichtigkeit<br />
der Monolayer wurde zum einen durch den transendothelialen elektrischen<br />
Widerstand, zum anderen durch die parazelluläre Permeabilität der Substanz<br />
Mannitol bestimmt. Wenn ein Zellmonolayer nicht ausreichend dicht ist, kann<br />
Mannitol zwischen den Zellen parazellulär diffundieren. Dies würde auch für andere<br />
Substanzen, dessen Transport untersucht werden soll, gelten. Das heißt, dass ein<br />
hoher transendothelialer elektrischer Widerstand der Zellmonolayer sowie eine<br />
niedrige Permeabilität des parazellulären Markers Mannitol Voraussetzungen für<br />
Transportuntersuchungen sind (LUNA-TORTÓS et al. 2008; HELMS et al. 2010).<br />
CLAUDE et al. (1978) zeigten z.B., dass die Anzahl der Tight junctions mit dem<br />
transendothelialen Widerstand korreliert. Deshalb wurden für alle Transport-Assays<br />
Messungen beider Parameter durchgeführt. Dabei sollten Werte von 12 nm/s bzw.<br />
152
DISKUSSION<br />
1 %/h für die Permeabilität von Mannitol nicht überschritten werden und der TEER<br />
Werte von mindestens 100 Ω*cm 2 aufweisen (nach LUNA-TORTÓS et al. 2008). In<br />
Transportstudien von Antiepileptika durch Pgp wurden derartige Werte in LLC- und<br />
MDCK II-Zellen gemessen (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). In hCMEC/D3-<br />
Zellen wurden in Monokultur bzw. Kokultur mit Astrozyten bislang nur relativ geringe<br />
TEER-Werte gemessen (< 40 bzw. 63 Ω*cm 2 ) (WEKSLER et al. 2005; HATHERELL<br />
et al. 2011). Die Mannitol-Permeabilität wurde nur von CARL et al. (2010) untersucht<br />
und zeigte Werte von 24,7 ± 0,2 nm/s.<br />
Die Untersuchungen der Einflüsse durch das im Medium enthaltende Serum,<br />
durch verschiedene Membraneinlagen und –formate im Transwell-System und die<br />
Kokultur mit Astrozyten zeigten, dass alle genannten Faktoren sich in einem<br />
bestimmten Ausmaß auf den Nachweis des Transports auswirken. Dies wird in den<br />
folgenden Abschnitten beschrieben.<br />
Material und Format der Membraneinlagen<br />
Aufgrund von Lieferproblemen wurde der Herstellungsprozess der bisher<br />
verwendeten Polyester-Membranen der Firma Corning geändert. Der Transport<br />
gängiger Pgp-Substrate war nach dieser Umstellung aufgrund der Absorption der<br />
Substanzen durch die Membranen in Nierenepithelzellen (LLC und MDCK II) nicht<br />
mehr bzw. nur noch teilweise nachweisbar (K. Römermann, unveröffentlichte Daten).<br />
Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit auch Membraneinlagen anderer Firmen<br />
(Greiner Bio-One und Millipore) getestet, aber die Dichtigkeit der Zellmembran war<br />
aufgrund einer anderen Porendichte der Membran-Inserts mit der des bisherigen<br />
Herstellers Corning nicht vergleichbar (siehe Tabelle 4.2 S. 54). Auffällig war, dass<br />
die Membran-Inserts des Herstellers Corning stets höhere TEER-Werte aufwiesen.<br />
Diese scheinbar höhere Integrität der Monolayer hatte aber keinen Einfluss auf den<br />
Nachweis eines asymmetrischen Transports. In Transportstudien mit hCMEC/D3-<br />
Zellen werden auch Corning-Membraneinlagen verwendet (CUCULLO et al. 2008;<br />
POLLER et al. 2008; JOICE et al. 2009; CARL et al. 2010), wobei die TEER-Werte<br />
zwischen 30 und 80 Ω*cm 2 lagen. Ähnlich niedrige Widerstände wurden auch in den<br />
hier beschriebenen Versuchen gemessen (17,9-65 Ω*cm 2 , Abbildung 5.13, 5.16, 5.17<br />
B, 5.18 B & C und 5.19 A).<br />
Die Polyester-Membranen, die üblicherweise in der hiesigen Arbeitsgruppe für<br />
Transportversuche verwendet werden, führten in einzelnen Versuchen zu einem<br />
153
DISKUSSION<br />
Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-Transports. Die Unterschiede des<br />
Substratgehalts zwischen apikaler und basolateraler Kammer fielen für die<br />
Membranen aus Polycarbonat aber deutlicher aus. Außerdem zeigten die<br />
Zellmonolayer höhere TEER-Werte. Polycarbonat-Membranen schienen unter den<br />
gewählten Bedingungen besser geeignet zu sein. Genauere Angaben dazu sind in<br />
der Literatur nicht zu finden.<br />
Untersuchungen des Formats der Membran-Inserts machten deutlich, dass<br />
die Wachstumsfläche einen entscheidenden Einfluss auf die Integrität der<br />
Zellmonolayer haben kann. Mit der Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf kleineren<br />
Membranen im 12Well-Format (Wachstumsfläche: 1,12 cm 2 ) zeigten die Monolayer<br />
eine höhere Dichtigkeit, die durch etwa 4-fach höhere TEER-Werte und niedrigere<br />
Mannitol-Permeabilitäten gekennzeichnet war. In den Untersuchungen von<br />
CUCULLO et al. (2008) und POLLER et al. (2008) wurden ebenfalls die kleineren<br />
Transwell-Inserts verwendet und die Dichtigkeit zumindest in CUCULLO et al. (2008)<br />
durch Messungen des Widerstands überprüft. Die TEER-Werte fielen aber mit 60-80<br />
Ω*cm 2 niedriger aus als in der vorliegenden Arbeit (138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 ). Mannitol-<br />
Permeabilitäten wurden nicht bestimmt. Allerdings untersuchten POLLER et al.<br />
(2008) die Permeabilitäten von Sucrose, die Werte von 15,8 nm/s zeigten. CARL et<br />
al. (2010) zeigten Mannitol-Permeabilitäten von 24,7 nm/s in hCMEC/D3-Zellen.<br />
Damit sind diese Permeabilitäten im Durchschnitt etwa 10- bis 100-mal niedriger als<br />
die hier beschriebenen Daten (siehe Tabelle 5.4, S. 107). Ein asymmetrischer<br />
Transport von Rhodamin 123 konnte in diesen Zellen trotz der hohen Permeabilitäten<br />
und den vergleichsweise niedrigen TEER-Werten in einzelnen Versuchen der<br />
vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden.<br />
Die Widerstände der Monolayer auf größeren Membran-Inserts (6Well), die für<br />
einen direkten Vergleich mit monokultivierten hCMEC/D3-Zellen untersucht wurden,<br />
fielen niedriger aus (29,6 vs. 119 Ω*cm 2 , Abbildung 5.19 A & B). Dies korrelierte mit<br />
den Ergebnissen der Transport-Assays. Ein asymmetrischer Transport von Digoxin<br />
und Verapamil konnte nicht, der Transport von Rhodamin 123 lediglich in zwei<br />
Versuchen nachgewiesen werden. Ähnlich niedrige TEER-Werte wurden auch den<br />
Untersuchungen von WEKSLER et al. (2005) gemessen. Allerdings muss hier<br />
hinzugefügt werden, dass die Messung der Widerstände für die 12Well-<br />
Membraneinlagen in der vorliegenden Arbeit aufgrund des Formats mit der<br />
Messpinzette vorgenommen wurde (siehe Abschnitt 4.3.2) und diese Werte<br />
154
DISKUSSION<br />
möglicherweise nicht ohne Weiteres mit den Daten der Messkammer verglichen<br />
werden können.<br />
Serum<br />
Eine Verlaufsuntersuchung der TEER-Werte, die über 7 Tage von hCMEC/D3-<br />
Monolayern vorgenommen wurde, zeigte u.a. Unterschiede zwischen den<br />
verwendeten Seren im Kulturmedium. Humanes Serum soll die Integrität der<br />
Zellmonolayer erhöhen. POLLER et al. (2008) zeigten eine Reduktion der<br />
parazellulären Sucrose-Permeabilität um bis zu 39 % (auf ca. 15,8 nm/s), nachdem<br />
hCMEC/D3-Zellen mit ansteigenden Konzentrationen bis zu 10 % humanem Serum<br />
kultiviert wurden. CARL et al. (2010) wiesen nach der Kultivierung dieser Zellen mit<br />
bovinem Serum etwa 1,5-mal höhere Werte für die Mannitol-Permeabilität (24,7<br />
nm/s) nach. Der Transportnachweis für Digoxin wurde aber in den Versuchen, für die<br />
die Zellen mit humanem Serum kultiviert wurden, nicht beeinflusst (Daten nicht<br />
gezeigt). Des Weiteren zeigte die Verlaufsuntersuchung der TEER-Werte keine<br />
Unterschiede zwischen humanem und bovinem Serum (Abbildung 5.13). Im<br />
Vergleich mit dem apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (P app ) für<br />
Mannitol, der für dichte Zellmonolayer 12 nm/s nicht überschreiten sollte (LUNA-<br />
TORTÓS et al. 2008), lag die Sucrose-Permeabilität von POLLER et al. (2008) über<br />
dem genannten Wert. Deshalb sollte die Erhöhung der Dichtigkeit durch<br />
beispielsweise noch höhere Konzentrationen des humanen Serums oder andere<br />
Parameter in den hCMEC/D3-Zellen untersucht werden.<br />
Die Überprüfung der parazellulären Permeabilität wurde in den hier<br />
dargestellten Versuchen mit Mannitol durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit<br />
gemessenen Permeabilitäten für Mannitol und die TEER-Werte für Zellmonolayer auf<br />
6Well-Membraneinlagen wurden von den verschiedenen Seren offensichtlich nicht<br />
beeinflusst. Das bovine Serum zeigte ähnlich hohe Widerstände wie das humane<br />
Serum und wurde deshalb und auch aus Kostengründen für die Kultivierung der<br />
Zellen für Transport-Assays verwendet. Der Transport von Rhodamin 123 konnte in<br />
hCMEC/D3-Zellen v.a. auf Membran-Inserts im 12Well-Format nachgewiesen<br />
werden. Ob für dieses Format ein Einfluss durch humanes Serum nachgewiesen<br />
werden kann, muss geklärt werden.<br />
155
DISKUSSION<br />
Zusammensetzung des Mediums<br />
Für die humanen Zellen wurden ab der Aussaat auf Transwell-Inserts drei<br />
Kulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung (siehe Abschnitt 5.1.4.3 S. 94 f.<br />
und Anhang S. 215) getestet (Wachstumsfaktoren wie VEGF, IGF-1, EGF, ein<br />
reduzierter Serum- und/oder Hydrocortisongehalt) und es konnte kein Einfluss auf<br />
die Integrität der Monolayer und den Transportnachweis in hCMEC/D3-Zellen<br />
nachgewiesen werden. Für den eigentlichen Transportversuch wurde letztlich ein<br />
Puffer verwendet, der sich aus HBSS-Puffer mit 1mM Natriumpyruvat und 10 mM<br />
HEPES zusammensetzte. Dieser wurde u.a. von POLLER et al. (2008) und CARL et<br />
al. (2010) in Transportuntersuchungen mit hCMEC/D3-Zellen verwendet. Mit diesem<br />
Puffer konnte im Gegensatz zum Medium Opti-MEM ® , welches üblicherweise für<br />
Transport-Assays in der hiesigen Arbeitsgruppe verwendet wurde, ein<br />
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden, weshalb der<br />
HBSS-Puffer für weitere Transport-Assays eingesetzt wurde.<br />
Die Zellen wurden 1 Tag vor dem Transportversuch mit 1 nM Simvastatin<br />
inkubiert (Kultivierungsprotokoll für hCMEC/D3-Zellen für Transport-Assays nach P.-<br />
O. Couraud, Stand 2009). Diese Substanz, welche zu den Statinen gehört, soll u.a.<br />
zur Erhöhung des Wachstumsfaktors VEGF und damit zur Integrität der<br />
Zellmonolayer beitragen (PARK et al. 2008). Vergleichende Transportversuche mit<br />
und ohne Simvastatin ließen aber keine Einflüsse durch diese Substanz auf TEER-<br />
Werte und Mannitol-Permeabilitäten in den Transportversuchen mit den Substraten<br />
Digoxin und Rhodamin 123 erkennen.<br />
Methodik<br />
Die hier beschriebenen Transportversuche wurden größtenteils nach der<br />
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA) durchgeführt. Diese Methode gilt als<br />
sensitiver, um v.a. auch schwache Substrate der MDT wie z.B. Antiepileptika<br />
detektieren zu können (LUNA-TORTÓS et al. 2008). Es konnte ein asymmetrischer<br />
Transport der Substanz Rhodamin 123 festgestellt werden (Abbildung 5.15), der aber<br />
nicht konsistent in allen Versuchen nachweisbar war. Andere Arbeitsgruppen, die<br />
Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen durchführten, verwendeten<br />
ausschließlich den bidirektionalen Assay mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 und<br />
bekannten Substraten der Protonen-gekoppelten Oligopeptid-Transporter<br />
(Glycylsarcosin, Carnosin, Histidin und Valacyclovir) (POLLER et al. 2008; CARL et<br />
156
DISKUSSION<br />
al. 2010). Aus diesem Grund wurden mit diesen Zellen ebenfalls bidirektionale<br />
Transportversuche durchgeführt, die aber keinen asymmetrischen Rhodamin-<br />
Transport erkennen ließen und deshalb für weitere Transportuntersuchungen in<br />
hCMEC/D3-Zellen nicht mehr durchgeführt wurden.<br />
6.1.3.2 Die Kokultur mit Astrozyten<br />
Die Kultivierungs- und Versuchsbedingungen wurden in Anlehnung an Quellen<br />
in der Literatur (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010)<br />
gewählt. In zwei von 35 einzelnen Versuchen mit monokultivierten humanen Zellen<br />
konnte ein asymmetrischer Transport des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123<br />
nachgewiesen werden (Abbildung 5.15). Es existieren viele Studien, in denen der<br />
Einfluss der natürlichen Umgebung von Hirnkapillarendothelien untersucht wurde<br />
(DEHOUCK et al. 1990; WOLBURG et al. 1994; CECCHELLI et al. 1999; GAILLARD<br />
et al. 2000; ABBOTT 2002; DEMEUSE et al. 2002; HAWKINS et al. 2002; SCHIERA<br />
et al. 2003; GARCIA et al. 2004; HAYASHI et al. 2004; NAKAGAWA et al. 2007;<br />
WILLIS et al. 2007; HATHERELL et al. 2011). Dabei fiel auf, dass v.a. Astrozyten<br />
einen entscheidenden Einfluss auf die Dichtigkeit und Undurchlässigkeit der<br />
Endothelzellschicht und folglich auch der BHS haben. Die Astrozyten sezernieren<br />
z.B. bestimmte Faktoren, die die Ausbildung der Tight junctions (CECCHELLI et al.<br />
1999) und die Expression von MDT fördern (WILLIS et al. 2007). Mit der Kokultur der<br />
Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten auf kleineren Membranen konnten das<br />
Transwell-Modell und damit die Transportuntersuchungen für die Zelllinie hCMEC/D3<br />
optimiert werden. Die Kokultivierung führte zu einer erneuten Steigerung des TEER-<br />
Werts (Monokultur: 110,7 ± 36,2 Ω*cm 2 , Kokultur: 161,9 ± 3,5 Ω*cm 2 ; siehe Tabelle<br />
5.4) sowie einer niedrigeren Mannitol-Permeabilität (Monokultur: 309,0 ± 115,0 nm/s,<br />
Kokultur: 165,0 ± 37,5 nm/s; siehe Tabelle 5.4). Dies deutete auf dichtere Monolayer<br />
hin. Ähnliche Effekte zeigten CUCULLO et al. (2008), die zumindest eine leichte<br />
Steigerung des TEER durch die Kokultur mit Astrozyten nachwiesen. Die<br />
Transportversuche zur Kokultur der hCMEC/D3-Zellen mit Astrozyten zeigten ein<br />
einheitlicheres Bild, der Transport von Rhodamin 123 konnte festgestellt werden<br />
(Abbildung 5.19 B & C).<br />
157
DISKUSSION<br />
6.1.3.3 Überprüfung eines asymmetrischen Transports<br />
Ein asymmetrischer Transport von 2 µM Rhodamin 123 konnte in hCMEC/D3-<br />
Zellen nachgewiesen werden. Zur Überprüfung, ob es sich um Pgp-spezifischen<br />
Transport handelte, wurden die bekannten Inhibitoren Valspodar (PSC833) und<br />
Tariquidar eingesetzt. Der Rhodamin-Transport konnte aber nur bedingt durch diese<br />
Pgp-Inhibitoren gehemmt werden. In einem einzelnen von insgesamt 8 Versuchen<br />
wurde der Transport vollständig durch Tariquidar inhibiert (Abbildung 5.21 F).<br />
Allerdings waren die Konzentrationsunterschiede zwischen Substrat mit und ohne<br />
Inhibitor sehr gering, weshalb der gemessene asymmetrische Transport von<br />
Rhodamin in diesem Einzelversuch fraglich ist (Abbildung 5.21 E & F).<br />
Untersuchungen von TANG et al. (2004) und FORSTER et al. (2012) zeigten<br />
beispielsweise eine Hemmung des Rhodamin-Transports durch die Pgp-Inhibitoren<br />
GF-120918 bzw. Quinidin in MDCK II-Zellen. YUMOTO et al. (1999) sowie<br />
TROUTMAN & THAKKER (2003) konnten eine Inhibition des Transport von<br />
Rhodamin 123 durch u.a. Quinidin und einen weiteren Pgp-Inhibitor (GW918) in der<br />
Darmzelllinie Caco-2 nachweisen. Ausgehend von diesen Studien sollten weitere<br />
Versuche durchgeführt werden, die auch andere Pgp-Inhibitoren und eventuell<br />
höhere Konzentrationen der bereits untersuchten Inhibitoren berücksichtigen und das<br />
Vermögen, Pgp-spezifischen Transport in hCMEC/D3-Zellen zu inhibieren,<br />
untersuchen.<br />
Die hCMEC/D3-Zellen wurden aus reseziertem epileptischem Hirngewebe<br />
einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin gewonnen. Es wäre denkbar, dass<br />
diese Pharmakoresistenz nicht nur auf die erhöhte Funktionalität bzw. Expression<br />
eines MDT in der BHS zurückzuführen ist. Es könnten mehrere Transporter daran<br />
beteiligt sein, sodass Rhodamin 123 durch einen anderen MDT als Pgp transportiert<br />
wurde und die Resultate der vorliegenden Arbeit eventuell nicht auf einen<br />
spezifischen Transport durch Pgp zurückzuführen sind. Demnach würde eine<br />
Inhibition von Pgp keinen Einfluss auf den Transport nehmen. Andererseits wird<br />
Rhodamin 123 oft als Pgp-Substrat für Kumulationsstudien eingesetzt (EFFERTH et<br />
al. 1989; LEE et al. 1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009). Zudem berichteten<br />
ROBEY et al. (2001), dass Rhodamin 123 zwar von Mutanten des Transporterproteins<br />
BCRP aber nicht vom ursprünglichen MDT (Wildtyp) transportiert wird.<br />
Die Integrität der Zellmonolayer, die im Rahmen der Transportstudien mit<br />
hCMEC/D3-Zellen genauer betrachtet wurde, wurde durch die Parameter Mannitol-<br />
158
DISKUSSION<br />
Permeabilität und TEER beschrieben. In der Literatur wird beschrieben, dass diese<br />
Parameter korrelieren (LÖSCHER et al. 2011). Werden hohe TEER-Werte<br />
gemessen, zeigen die Permeabilitäten für Mannitol oder andere parazelluläre Marker<br />
niedrige Werte. Insgesamt ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit der<br />
Widerstand nicht immer mit dem Nachweis eines Transports korrelierte. Wenn ein<br />
asymmetrischer Rhodamin-Transport nachgewiesen werden konnte und dazu hohe<br />
TEER-Werte für die Monolayer der hCMEC/D3-Zellen gemessen wurden, waren die<br />
Permeabilitäten für Mannitol oft noch sehr hoch. Dies lässt auf eine unzureichende<br />
Integrität der Monolayer schließen und stellt den gemessenen Transport in Frage.<br />
6.1.3.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen<br />
Eine Erhöhung des TEER konnte nach Modifikationen bezüglich des Serums,<br />
des Materials und Formats der Membranen sowie der Kokultur mit Astrozyten<br />
erreicht werden, aber die Werte waren immer noch weitaus geringer als<br />
beispielsweise für LLC- und MDCK II-Zellen, die als In-vitro-Modelle der BHS<br />
eingesetzt werden (MAHAR DOAN et al. 2002; GARBERG et al. 2005; BACHMEIER<br />
et al. 2006). Diese Daten waren mit Untersuchungen zu immortalisierten humanen<br />
Hirnkapillarendothelzellen anderer Arbeitsgruppen vergleichbar, die Widerstände im<br />
Bereich von 20 bis 200 Ω*cm 2 zeigten (GRANT et al. 1998; WEKSLER et al. 2005;<br />
HATHERELL et al. 2011). Dennoch könnten die generell niedrig-ohmigen<br />
Widerstände der humanen Zelllinie hCMEC/D3 (WEKSLER et al. 2005; CARL et al.<br />
2010; HATHERELL et al. 2011) ein Problem für die Untersuchung eines Pgpvermittelten<br />
Transports in diesen Zellen darstellen.<br />
Die Mannitol-Permeabilität blieb von den untersuchten Faktoren nahezu<br />
unbeeinflusst, eine Verbesserung trat für monokultivierte hCMEC/D3-Zellen nicht ein.<br />
Die Permeabilitäten für Mannitol lagen je nach Versuch durchschnittlich bei 90,2 ±<br />
35,9 nm/s für 6Well-Membranen und 309,0 ± 115,0 nm/s für 12Well-Membranen,<br />
vereinzelt wurden Werte von 24 nm/s gemessen (siehe Tabelle 5.4). Damit befanden<br />
sich die hier ermittelten niedrigsten Werte im gleichen Bereich wie auch in der<br />
Literatur angegebene Daten zur Überprüfung der parazellulären Permeabilität, z.B.<br />
mit Sucrose 27,5 bzw. 15,8 nm/s oder mit Mannitol 24,7 nm/s (WEKSLER et al.<br />
2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In den meisten Fällen waren diese<br />
Werte aber im Vergleich mit anderen Gruppen höher. Der apparente parazelluläre<br />
Permeabilitäts-Koeffizient (P app ) für Mannitol zeigte von der basolateralen in die<br />
159
DISKUSSION<br />
apikale Kammer (b-A) ausschließlich höhere Werte als 12 nm/s, der in<br />
Transportstudien mit LLC- und MDCK II-Zellen als Grenzwert festgesetzt wurde<br />
(LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). Deshalb muss man davon ausgehen, dass die<br />
Monolayer während der Versuche nur in unzureichendem Maß dicht waren.<br />
Die Kokultur der humanen Endothelzellen mit Astrozyten trug zu einer<br />
Verbesserung des Transwell-Modells mit hCMEC/D3-Zellen bei. Mit der<br />
Kokultivierung konnte sowohl ein Anstieg des Widerstands der Monolayer als auch<br />
ein leichter Abfall der Mannitol-Permeabilität beobachtet werden. Dies lässt zwar<br />
darauf schließen, dass die Monolayer im Vergleich zu monokultivierten Zellen eine<br />
größere Dichtigkeit aufwiesen. Aber diese Mannitol-Werte für 12Well-<br />
Membraneinlagen waren immer noch höher als für 6Well-Membranen. Der optimale<br />
Bereich wurde nicht gefunden. Dennoch konnte der positive Einfluss der Kokultur mit<br />
Astrozyten in diesen Versuchen bestätigt werden (DEHOUCK et al. 1990;<br />
WOLBURG et al. 1994; ABBOTT 2002; DEMEUSE et al. 2002; HAYASHI et al.<br />
2004; NAKAGAWA et al. 2007; HATHERELL et al. 2011).<br />
Abschließend ist zu sagen, dass sämtliche beschriebenen Transport-Assays<br />
darauf hindeuten, dass die geeigneten Bedingungen für die humanen Zellen in<br />
Transportuntersuchungen nicht gefunden wurden. Anpassungen verschiedener<br />
Parameter wie z.B. Serum, Membranmaterial und –format und Kokultur mit<br />
Astrozyten zeigten kaum Verbesserungen der Parameter für die Integrität der<br />
Zellmonolayer, weshalb hCMEC/D3-Zellen für Transportuntersuchungen im<br />
Transwell-Modell ungeeignet erscheinen. Die hier beschriebenen Versuche<br />
bestätigen also die Aussage, dass immortalisierte Hirnkapillarendothelien für<br />
Transportversuche nicht geeignet sind (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005).<br />
CUCULLO et al. (2008) kamen in vergleichenden Untersuchungen mit hCMEC/D3-<br />
Zellen im humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modell (STANNESS et al. 1996) und<br />
im statischen Transwell-Modells zu einer ähnlichen Konklusion, da transendotheliale<br />
Widerstände für die humanen Zellen im Transwell-Modell von 70 Ω*cm 2 gemessen<br />
wurden. Im dynamischen BHS-Modell, welches die Scherkräfte des Blutstroms an<br />
der BHS nachahmt, zeigten die Zellen TEER-Werte von bis zu 1000 Ω*cm 2 .<br />
Aufgrund der unzureichenden Dichtigkeit der hCMEC/D3-Monolayer wurden<br />
keine Untersuchungen des Transports von Antiepileptika in diesen Zellen<br />
durchgeführt. Möglicherweise wären derartige Studien nach der Etablierung des<br />
humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells möglich.<br />
160
DISKUSSION<br />
6.2 Primäre Hirnkapillarendothelien der Ratte (rBCEC)<br />
Primärkulturen aus Hirnendothelzellen stellen ein vereinfachtes weniger<br />
komplexes Modell der In-vivo-Situation dar, benötigen aber bestimmte technische<br />
Voraussetzungen, und die Präparation und die Kultivierung sind zeitintensiv.<br />
Dennoch stellen sie eine Alternative zu Tierversuchen dar, um Studien der BHS<br />
durchzuführen (CARDOSO et al. 2010). Im Vergleich zum Ursprungsgewebe können<br />
immortalisierte Zellen Veränderungen wie zum Beispiel in der Expression bestimmter<br />
Transporter aufweisen (NICOLAZZO et al. 2006; URICH et al. 2012; C. Luna-Tortós,<br />
unveröffentlichte Daten). Um näher an die in vivo vorliegenden Bedingungen zu<br />
kommen, wurden für die Bearbeitung des Dissertationsthemas Endothelzellen direkt<br />
aus dem Gehirn von Ratten gewonnen und in Kultur gebracht. Primärkulturen<br />
wurden bereits im Transwell-System für Untersuchungen des Transports eingesetzt<br />
(GARBERG et al. 2005; PERRIÈRE et al. 2005; ZHANG et al. 2006). Durch den<br />
Einsatz von Primärkulturen sollte zusätzlich zu der Zelllinie hCMEC/D3 unter<br />
Berücksichtigung von Speziesunterschieden untersucht werden, welche<br />
Antiepileptika in der Lage sind, die Funktion von MDT an der BHS beeinflussen und<br />
ob sie in diesen Zellen Substrate der MDT darstellen.<br />
Die Protokolle zur Präparation und Kultivierung der Primärkulturen sind sehr<br />
verschieden. Daraus ergeben sich beachtliche Variationen z.B. bezüglich der<br />
Reinheit der Endothelzellkultur sowie der Parameter für die Integrität der<br />
Zellmonolayer (parazelluläre Permeabilität, transendothelialer Widerstand) in<br />
Transportstudien (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Die Mikroumgebung<br />
der Zellen verändert sich in der Kultur (CALABRIA et al. 2006), außerdem verlieren<br />
sie ihre typischen Eigenschaften (NAKAGAWA et al. 2009) wie z.B. Phänotyp und<br />
Barriereeigenschaften (BERNAS et al. 2010). Zusätzlich durchlaufen die Zellen<br />
Prozesse der Alterung und Dedifferenzierung (CARDOSO et al. 2010). Aus diesen<br />
Gründen werden Primärzellen nur über wenige Passagen für Versuche eingesetzt<br />
und müssen permanent neu präpariert und in Kultur gebracht werden, was zu<br />
Schwankungen in den Untersuchungsergebnissen führt.<br />
Laut Literatur kann mit den derzeit verwendeten Protokollen zur Gewinnung<br />
primärer Hirnkapillarendothelien und Astrozyten (PERRIÈRE et al. 2005; ZHANG et<br />
al. 2006; VANTELON et al. 2007) eine hohe Reinheit der Kulturen erreicht werden.<br />
Für die Endothelzellen konnte eine solche reine Kultur relativ gut erzielt werden, da<br />
161
DISKUSSION<br />
es nur wenige Verunreinigungen durch andere Zellen oder Infektionen gab. Es<br />
wurden zwei verschiedene Auszucht-Rattenstämme (Wistar und CD ® -IGS, Charles<br />
River, Sulzfeld) verwendet, um einen geeigneten Stamm für die Bearbeitung der<br />
Fragestellung finden zu können. Tatsächlich zeigten die so gewonnenen Zellen eine<br />
unterschiedlich gute Anheftung an Oberflächen der Zellkulturmaterialien sowie<br />
unterschiedlich schnelles Wachstum. Weitere Unterschiede, die z.B. die Effekte<br />
durch Erkrankungen oder Substanzen betreffen, wurden in Tieren bzw. Zellen dieser<br />
beiden Rattenstämme beobachtet (KACEW & FESTING 1996). Es wurde außerdem<br />
beschrieben, dass die Expression des mdr1b-Gens, welches zusammen mit mdr1a<br />
das Pgp in Nagern codiert (SCHINKEL et al. 1995), in Wistar- und Sprague-Dawley-<br />
Ratten (entsprechen den hier verwendeten CD ® -IGS-Ratten von Charles River,<br />
Sulzfeld) unterschiedlich ausgeprägt ist (HILL et al. 1996), was sich auf<br />
Untersuchungen des Pgp-vermittelten Transports auswirken kann.<br />
Ausgehend von einer besseren Anheftung und einem schnelleren Wachstum<br />
schienen die Zellen der CD-Ratten im Vergleich mit Zellen aus Wistar-Ratten besser<br />
geeignet zu sein, um Untersuchungen mit einem geringeren Zeitaufwand und<br />
bezüglich der Ausbeute der Präparationen in einem größeren Umfang durchführen<br />
zu können.<br />
Mit diesen Primärkulturen wurden sowohl Kumulations- als auch<br />
Transportuntersuchungen durchgeführt.<br />
6.2.1 Die Modulation der Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen<br />
Mit dem Kumulations-Assay, der Aufschluss über einen Transporterinduzierten<br />
Efflux einer Substanz gibt, konnte in den primären Hirnendothelzellen<br />
funktionelles Pgp in Zellen beider Rattenstämme nachgewiesen werden. Die<br />
Expression dieses MDTs wurde im Western Blot bestätigt (Abbildung 5.22). Die<br />
Funktion Pgps wurde durch den Pgp-Induktor Puromycin induziert. Tariquidar (0,5<br />
µM) sowie auch die Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin inhibierten in den<br />
Konzentrationen von 100 µM den Efflux (Abbildung 5.24). Eine Induktion durch<br />
Dexamethason konnte nicht nachgewiesen werden, sehr wohl aber für Puromycin.<br />
Diese Daten stehen in Kontrast zu denen der immortalisierten hCMEC/D3-Zellen,<br />
denn in diesen Zellen führte die Behandlung mit Antiepileptika vorrangig zu einer<br />
Induktion des Efflux von Rhodamin 123 (Abbildung 5.8 & 5.9). Allerdings zeigte<br />
Phenytoin in hCMEC/D3-Zellen in den niedrigeren Konzentrationen (10, 30 und 50<br />
162
DISKUSSION<br />
µM) zumindest Tendenzen zur Inhibition der Funktionalität (Abbildung 5.8 C). In einer<br />
Studie mit den immortalisierten Rattenhirnendothelien RBE4- und GPNT-Zellen<br />
wurde eine Induktion der Pgp-Expression durch die Antiepileptika Carbamazepin,<br />
Phenobarbital und Phenytoin nachgewiesen (LOMBARDO et al. 2008). Diese<br />
induzierende Wirkung wurde über die Rezeptoren PXR und CAR vermittelt. Eine<br />
Erhöhung der Pgp-Expression muss sich nicht zwangsläufig auf die Funktionalität<br />
auswirken, dennoch ist diese Korrelation sehr wahrscheinlich. Nach der Behandlung<br />
mit den Antiepileptika Carbamazepin (10 und 50 µM) und Topiramat (100 µM)<br />
wurden induzierende Effekte auf die Funktionalität in RBE4-Zellen nachgewiesen<br />
(NEUMANN 2010, Diplomarbeit), obwohl AMBROZIAK et al. (2010) in RBE4-Zellen<br />
keine oder nur eine sehr niedrige Expression von PXR und CAR nachgewiesen<br />
haben. Wenn in den rBCEC-Zellen diese ONRs nicht oder nur geringfügig exprimiert<br />
wurden, würde dies zumindest erklären, warum die Antiepileptika Carbamazepin und<br />
Phenytoin die Funktionalität Pgps nicht induzierten. Andererseits wurden in<br />
Untersuchungen an Kapillaren des Rattenhirnendothels PXR und CAR<br />
nachgewiesen (MILLER et al. 2010), sodass in den in dieser Arbeit eingesetzten<br />
Primärkulturen diese Rezeptoren auch nachweisbar und die Vermittlung von<br />
Induktionen auf diese Weise möglich sein sollte.<br />
Neben Antiepileptika wurde u.a. auch für bekannte Pgp-Induktoren wie z.B.<br />
Dexamethason und Rifampicin eine Pgp-Induktion über PXR beschrieben (NARANG<br />
et al. 2008; ZHOU et al. 2008). Für Puromycin ist diese rezeptor-vermittelte Induktion<br />
nicht bekannt. Ausgehend von der induzierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität<br />
in rBCEC-Zellen (Abbildung 5.23 & 5.24) wäre zu vermuten, dass dieser Effekt auch<br />
über ONRs gesteuert wurde. Warum die Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin<br />
den Rhodamin-Efflux inhibierten, ist unklar. Laut XU et al. (2005) und CHEN (2010)<br />
ist die Expression der ONRs in einzelnen Geweben und Zellen sehr verschieden.<br />
Denkbar wäre, dass in den präparierten rBCEC-Zellen Rezeptoren wie PXR und<br />
CAR nur im geringen Ausmaß exprimiert sind und Induktionen über diese Prozesse<br />
nicht vermittelt wurden, was wiederum die ausbleibende Induktion durch<br />
Dexamethason (10 µM) erklären würde. Das Kulturmedium der rBCEC-Zellen<br />
enthielt 0,5 µM Hydrocortison. Diese Substanz wirkt induzierend auf die Pgp-<br />
Funktionalität (MAINES et al. 2005). Deshalb wäre es ebenso möglich, dass eine<br />
Induktion durch Dexamethason aufgrund einer bereits erhöhten Funktion des Efflux-<br />
Transporters nicht nachgewiesen werden konnte.<br />
163
DISKUSSION<br />
Die für Carbamazepin und Phenytoin verwendete Konzentration von 100 µM<br />
liegt außerhalb der beim Menschen therapeutischen Plasmakonzentrationen von 17-<br />
51 µM für Carbamazepin und 40-79 µM für Phenytoin (PATSALOS et al. 2008; siehe<br />
Tabelle 5.1). Die primären Zellen zeigten während der Behandlung mit den<br />
Antiepileptika zwar keine offensichtlichen toxischen Effekte wie beispielsweise<br />
Zellablösungen. Dennoch könnte es möglich sein, dass die Zellen nicht mehr in der<br />
Lage waren, mit dieser erhöhten Konzentration umzugehen, und es sich bei den<br />
durch Carbamazepin und Phenytoin hervorgerufenen Inhibitionen um<br />
zellschädigende Auswirkungen handelte. Allerdings berichteten WEISS et al. (2003)<br />
nach der Behandlung mit Valproat (> 100 µM) und Phenytoin (> 100 µM) in LLC-<br />
Zellen ebenfalls von inhibitorischen Effekten. Aufgrund der Effekte auf den Efflux von<br />
Rhodamin durch Induktoren und Inhibitoren kann man aber davon ausgehen, dass in<br />
den Primärendothelzellen der Ratte funktionelles Pgp vorhanden ist. Mögliche<br />
toxische Effekte für die Primärzellen durch die Behandlung mit Antiepileptika sollten<br />
dennoch in Zytotoxizitäts-Assays untersucht werden.<br />
Die Zellen beider Rattenstämme zeigten bezüglich des Grundtransports von<br />
Rhodamin 123 ein unterschiedliches Ausmaß (Abbildung 5.23 & 5.24), das aber nicht<br />
reproduzierbar war. Für Primärkulturen ist bekannt, dass Schwankungen vieler<br />
Parameter in Abhängigkeit von den Zellchargen durch Präparation und Reinheit der<br />
Kultur auftreten können (ZHANG et al. 2006). Beide zeigten aber die gleichen<br />
modulatorischen Effekte nach der Behandlung mit den genannten Substanzen.<br />
Carbamazepin bildete eine Ausnahme, da es nur in Hirnendothelzellen der Wistar-<br />
Ratten getestet wurde. Die inhibitorischen Effekte durch die Antiepileptika<br />
Carbamazepin und Phenytoin bedürfen weiterer Experimente und zusätzlicher<br />
niedrigerer Konzentrationen, um die Wirkung von Antiepileptika in den Primärkulturen<br />
abzuklären.<br />
Abgesehen von der schnelleren Anheftung an Zellkulturmaterialien und dem<br />
Wachstum der Endothelzellen der CD-Ratten zeigten die Zellen in<br />
Kumulationsversuchen keine Vorteile gegenüber Zellen aus Wistar-Ratten. Die<br />
Primärkulturen beider Rattenstämme können aufgrund vergleichbarer Uptake-<br />
Ergebnisse für die Untersuchungen der Funktionalität eingesetzt werden. Für weitere<br />
Versuche zur Modulation der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika sollten die<br />
primären Rattenhirnendothelzellen ohne Hydrocortison kultiviert werden.<br />
164
DISKUSSION<br />
6.2.2 Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen<br />
6.2.2.1 Versuchsbedingungen<br />
Für die Untersuchung des Transports wurden zwei verschiedene<br />
Rattenstämme, unterschiedliche Pgp-Substrate und Membraneinlagen (Firmen<br />
Corning und Greiner) verwendet. Die gewonnenen Hirnzellen wurden nicht<br />
immortalisiert, sodass sie nur über einen kurzen Zeitraum für Experimente<br />
verwendbar waren und regelmäßig frische Zellen präpariert werden mussten. Dieser<br />
Fakt kann konstante Kultivierungsbedingungen erschweren, da die Anheftung, das<br />
Wachstum der Zellen sowie weitere Einflussfaktoren chargenabhängig sein können<br />
(CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). So könnten die variablen Ergebnisse<br />
der Transport-Assays erklärt werden.<br />
Einer der größten Nachteile des Transwell-Modells ist, dass die bislang<br />
eingesetzten immortalisierten Zelllinien aus Endothelien der BHS aufgrund der<br />
suboptimalen Expression und Ausbildung der Tight junctions eine relativ hohe<br />
parazelluläre Permeabilität zeigen (LIU et al. 2008). Für Transportversuche ist aber<br />
die Ausbildung der Tight junctions, die zusammen mit anderen Faktoren zu hohen<br />
transendothelialen Widerständen führen, unerlässlich. Es wird beschrieben, dass der<br />
TEER-Wert nach Zugabe von cAMP und Ro 20-1724 ansteigt (RUBIN et al. 1991).<br />
Beide Substanzen haben Einfluss auf die Struktur und Funktion bestimmter Tightjunction-Proteine<br />
und damit auf die Dichtigkeit eines Zellverbands. Die primären<br />
Rattenhirnzellen wurden 24 h vor jedem Transportversuch mit diesen beiden<br />
Substanzen inkubiert, um die Ausbildung der Tight junctions zwischen den Zellen zu<br />
verbessern. Im Vergleich mit den humanen Zellen wurden höhere TEER-Werte<br />
gemessen, dennoch war die Mannitol-Permeabilität immer noch sehr hoch (siehe<br />
Tabelle 5.6). FRANKE et al. (1999 & 2000) wiesen in primären Hirnendothelzellen<br />
des Schweines Mannitol-Permeabilitäten von 17-18 nm/s nach. Deshalb muss man<br />
davon ausgehen, dass die Monolayer der primären Rattenhirnendothelzellen nicht<br />
ausreichend dicht waren. Es wurden keine Transportversuche durchgeführt, ohne<br />
dass die Primärkulturen vorher cAMP und Ro 20-1724 erhielten. Es können also<br />
keine Aussagen darüber getroffen werden, ob diese Substanzen in den hier<br />
beschriebenen Experimenten einen großen Einfluss hatten oder ob die<br />
Primärkulturen auch ohne den Einsatz von cAMP und Ro 20-1724 dichtere<br />
Zellmonolayer ausbilden. Des Weiteren wird dem Kulturmedium der rBCEC-Zellen<br />
165
DISKUSSION<br />
stets Hydrocortison zugefügt (siehe Mediumszusammensetzung S. 45), welches zur<br />
Ausbildung von Tight junctions beiträgt (FÖRSTER et al. 2008) und damit ebenfalls<br />
die Integrität der Monolayer fördert.<br />
In der Literatur werden beispielsweise für primäre Hirnkapillarendothelzellen<br />
der Ratte TEER-Werte bis zu 500 Ω*cm 2 beschrieben (PERRIÈRE et al. 2005). Die<br />
hier gemessenen Werte der Hirnkapillarendothelzellen aus Ratten lagen mit einem<br />
durchschnittlichen Widerstand von 168,1 Ω*cm 2 (auch in Kokultur mit Astrozyten)<br />
weit unter diesem Wert. Die optimalen Bedingungen für die Erhöhung des TEER-<br />
Werts und folglich der Integrität müssen also noch gefunden werden.<br />
Wie die hCMEC/D3-Zellen zeigten die Primärkulturen ebenfalls sehr<br />
unterschiedliche Ergebnisse nach Transport-Assays mit den Pgp-Substraten<br />
Rhodamin 123, Digoxin und Verapamil (Abbildung 5.25). Ein asymmetrischer<br />
Transport des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 war in primären Zellen beider<br />
Rattenstämme nachweisbar (Abbildung 5.25, 5.27 & 5.28). Der Transport von<br />
Digoxin und Verapamil konnte nicht detektiert werden. Es fiel aber auf, dass die<br />
Rattenhirnendothelien im Gegensatz zu hCMEC/D3 auf Transwell-Inserts von<br />
Greiner einen höheren Widerstand und auch niedrigere Mannitol-Permeabilitäten<br />
zeigten, was auf eine bessere Integrität der Zellmonolayer schließen ließ. Dies hatte<br />
aber keinen Einfluss auf den Nachweis eines Transports (Abbildung 5.28). Generell<br />
zeigten die primären Rattenzellen höhere TEER-Werte als die humanen<br />
immortalisierten Zellen. Bezüglich der Mannitol-Permeabilität ist zu sagen, dass für<br />
die Primärkulturen aus der Ratte höhere Werte als für die humanen Zellen gemessen<br />
wurden. Damit besteht möglicherweise das gleiche Problem wie für die hCMEC/D3-<br />
Zellen. Eine zu hohe parazelluläre Permeabilität könnte einen Pgp-vermittelten<br />
Transport überdeckt haben.<br />
6.2.2.2 Die Kokultur mit Astrozyten<br />
Es wurde bereits für die immortalisierten humanen Hirnendothelien<br />
hCMEC/D3 beschrieben, dass die Kokultur von Endothelien mit Astrozyten die<br />
Membraneigenschaften wesentlich beeinflussen und verbesserte Bedingungen für<br />
Transportversuche schaffen kann (HATHERELL et al. 2011; siehe Abschnitt 5.1.4.7<br />
S. 100 ff.). Für primäre Zellen des Hirnkapillarendothels konnte dies ebenfalls<br />
nachgewiesen werden (CECCHELLI et al. 2007; NAKAGAWA et al. 2007). In<br />
einzelnen Versuchen mit den rBCEC-Zellen konnten höhere TEER-Werte und<br />
166
DISKUSSION<br />
niedrigere Mannitol-Permeabilitäten gemessen werden, die auf eine Erhöhung der<br />
Dichtigkeit schließen lassen. Diese Ergebnisse waren aber nicht für alle Kokultur-<br />
Versuche in gleichem Ausmaß reproduzierbar. Die Rhodamin-Konzentrationen der<br />
apikalen und der basolateralen Kammer waren signifikant verschieden, zeigten<br />
oftmals kaum einen apikalen Anstieg oder Schwankungen der Substrat-<br />
Konzentration, wobei keine Unterschiede zwischen Rattenstamm oder<br />
Membranmaterial zu erkennen waren (Abbildung 5.28 & 5.29).<br />
Positive Effekte der Kokultur von Endothelzellen der Ratte oder der Maus mit<br />
Astrozyten auf TEER-Werte und parazelluläre Permeabilitäten wurden in<br />
Untersuchungen von DELI et al. (2003) und HUTAMEKALIN et al. (2008) berichtet.<br />
In diesen Studien wurden u.a. TEER-Werte von 307 ± 3,2 Ω*cm 2 bzw. maximal 600<br />
Ω*cm 2 und niedrige Permeabilitäten von beispielsweise Albumin von 1,88 ± 0,1 nm/s<br />
gemessen. Trotz der Kokultur der primären Rattenhirnendothelien mit Astrozyten<br />
konnte kein asymmetrischer Transport von Digoxin beobachtet werden. Ein<br />
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte aber sehr wohl nachgewiesen<br />
werden. Allerdings war keiner der eingesetzten Inhibitoren (Valspodar und<br />
Tariquidar) in den gewählten Konzentrationen in der Lage, den Transport von<br />
Rhodamin 123 vollständig und wiederholbar zu hemmen (Abbildung 5.29). Folglich<br />
ist davon auszugehen, dass entweder höhere Konzentrationen nötig sind oder aber<br />
der Rhodamin-Transport nicht durch den MDT Pgp verursacht wurde. Vermutungen<br />
zufolge, könnte der Transporter BCRP am Transport beteiligt sein. ROBEY et al.<br />
(2001) und Studien der hiesigen Arbeitsgruppe (K. Römermann, unveröffentlichte<br />
Daten) widerlegten aber diese Annahme.<br />
In der Kokultur der Endothelzellen (rBCEC oder hCMEC/D3) mit Astrozyten<br />
wurden beide Zelltypen mit dem jeweiligen Medium oder aber auch nur mit dem<br />
Medium für die Endothelien kultiviert. Unterschiede im Wachstumsverhalten und der<br />
Morphologie waren nicht zu erkennen. Im Medium der Endothelzellen war immer der<br />
Wachstumsfaktor bFGF und Hydrocortison enthalten (siehe<br />
Mediumszusammensetzung für hCMEC/D3 und rBCEC S. 41 und 45). In früheren<br />
Arbeiten dieser Arbeitsgruppe wurde untersucht, ob diese Faktoren einen Einfluss<br />
auf das Wachstum der Astrozyten haben können. Die Expression von Vimentin, ein<br />
Marker für mesenchymale Zellen und auch unausgereifte Astrozyten (LIN &<br />
GOLDMAN 2009), erhöhte sich nach der Zugabe von bFGF (C. Luna-Tortós,<br />
unveröffentlichte Daten). Für Hydrocortison konnte kein Effekt auf Vimentin oder auf<br />
167
DISKUSSION<br />
das Intermediärfilament Saures Gliafaserprotein (englisch glial fibrillary acidic protein,<br />
GFAP), ein spezifischer Marker für die Differenzierung von Astrozyten (REUSS et al.<br />
2003), festgestellt werden. Die Expression von Vimentin oder GFAP wurde in dieser<br />
Arbeit nicht untersucht, und bFGF war im Medium zur Kokultivierung der<br />
Endothelzellen und Astrozyten enthalten. Für weitere Untersuchungen des<br />
Transwell-Modells sollten diese Faktoren berücksichtigt werden.<br />
THANABALASUNDARAM et al. (2010) untersuchten die Kokultur von<br />
primären porcinen Hirnendothelzellen mit Perizyten im Transwell-Modell und wiesen<br />
sogar einen Abfall des Widerstands und einen Anstieg der Sucrose-Permeabilität<br />
nach, was auf undichte Monolayer schließen lässt. Dies konnte aber durch das<br />
Entfernen des Wachstumsfaktors VEGF wieder aufgehoben und eine Steigerung des<br />
TEER erzielt werden. Ähnliche Effekte für VEGF wurden bereits von NITZ et al.<br />
(2003) beschrieben. VEGF wird von den Perizyten sezerniert<br />
(THANABALASUNDARAM et al. 2010) und stellt einen wichtigen Einflussfaktor der<br />
Integrität der BHS dar (ARGAW et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit war für die<br />
Primärkulturen kein VEGF im Medium enthalten. Untersuchungen zu<br />
inflammatorischen Erkrankungen des ZNS wiesen aber nach, dass humane<br />
Astrozyten VEGF sezernieren können (ARGAW et al. 2012). Möglicherweise wurde<br />
dieser Wachstumsfaktor auch von Astrozyten in den hier beschriebenen Kokultur-<br />
Versuchen abgegeben, was erklären würde, warum der Widerstand der Monolayer<br />
durch die Kokultur in dieser Arbeit nicht weiter gesteigert werden konnte.<br />
6.2.2.3 Primärkulturen des Hirnkapillarendothels anderer Spezies<br />
Mit den derzeit verfügbaren In-vitro-Modellen der BHS kann die<br />
Mikroumgebung dieser Barriere relativ gut nachgeahmt werden und eine Reihe an<br />
Eigenschaften und Funktionen untersucht werden (ASCHNER et al. 2006).<br />
Versuche, menschliches Hirngewebe für BHS-Modelle einzusetzen (BERNAS et al.<br />
2010), werden durch eher geringe Verfügbarkeit dieses Gewebes erschwert. Im<br />
Gegensatz dazu kann Hirngewebe des Schweines und des Rindes relativ einfach<br />
gewonnen werden (CECCHELLI et al. 2007; CARDOSO et al. 2010), und viele<br />
Untersuchungen werden an diesen (ZHANG et al. 2006; ZHANG et al. 2009a) und<br />
weiteren Spezies wie Maus und Ratte (COISNE et al. 2005; PERRIÈRE et al. 2007)<br />
durchgeführt. Möglicherweise wären Primärkulturen des Hirnendothels anderer<br />
Spezies als der Ratte eher für das Transwell-Modell geeignet. GARBERG et al.<br />
168
DISKUSSION<br />
(2005) berichteten beispielsweise, dass die Unterschiede des Transports durch Pgp<br />
in primären und immortalisierten Hirnkapillarendothelzellen verschiedener Spezies<br />
sehr groß sind. Des Weiteren ist es schwierig, ausreichend reine Kulturen an<br />
primären Hirnkapillarendothelien der Ratte mit hohen TEER-Werten zu gewinnen<br />
(LECHARDEUR & SCHERMAN 1995; HURST & FRITZ 1996; ABBOTT et al. 1997;<br />
REINHARDT & GLOOR 1997). Zudem wiesen NITZ et al. (2003) in<br />
Hirnkapillarendothelzellen des Schweines Widerstände von bis zu 1800 Ω*cm 2 nach.<br />
FRANKE et al. (2000) konnten nach Messungen des transendothelialen Widerstands<br />
in den gleichen Zellen immerhin Werte von bis zu 700 Ω*cm 2 feststellen. Für<br />
Primärkulturen des Hirnkapillarendothels des Rindes wurden allerdings<br />
vergleichsweise niedrige TEER-Werte von etwa 70 Ω*cm 2 (LEE et al. 2004) bzw. 130<br />
Ω*cm 2 gemessen (GAILLARD & DE BOER 2000), sodass BHS-Modelle mit bovinen<br />
Zellen möglicherweise eher ungeeignet sind. WOLBURG et al. (1994) wiesen aber<br />
für primäre Zellen bovinen Ursprungs teils höhere Widerstände nach, die Werte bis<br />
800 Ω*cm 2 erreichten. Unabhängig von der Wahl der Spezies dürfen für die<br />
Interpretation der Ergebnisse und die Translation von In-vitro-Daten auf die In-vivo-<br />
Situation mögliche Speziesunterschiede nicht außer Acht gelassen werden<br />
(CECCHELLI et al. 2007; CARDOSO et al. 2010).<br />
6.2.2.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen<br />
In einem einzelnen Versuch wurde der Transport des Antiepileptikums<br />
Phenytoin untersucht (Daten nicht gezeigt). Es war kein signifikanter Transport zu<br />
erkennen, obgleich Phenytoin als Pgp-Substrat gilt (LUNA-TORTÓS et al. 2008).<br />
Dies macht deutlich, dass zur Untersuchung des Transports von Antiepileptika in<br />
Primärkulturen des Rattenhirnendothels im Transwell-Modell die Bedingungen weiter<br />
optimiert werden müssen. Dennoch mussten für diese Zellen im Vergleich zu den<br />
immortalisierten humanen Hirnkapillarendothelzellen weniger Parameter verändert<br />
werden, um einen Transport detektieren zu können. Die Primärkulturen des<br />
Rattenhirnendothels zeigten von Beginn an höhere TEER-Werte (6Well: 97,5 ± 24,8<br />
Ω*cm 2 ; 12Well: 168,1 ± 37,6 Ω*cm 2 ) als die hCMEC/D3-Zellen (6Well: 31,9 ± 12,8<br />
Ω*cm 2 ; 12Well: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 ) (siehe Tabelle 5.4 & 5.6). Die höheren TEER-<br />
Werte der rBCEC-Zellen könnten auf eine generell bessere Eignung der primären<br />
Zellen für das Transwell-Modell hinweisen, wie es auch von anderen Arbeitsgruppen<br />
beschrieben wurde (FRANKE et al. 2000; GARBERG et al. 2005; PERRIÈRE et al.<br />
169
DISKUSSION<br />
2005; ZHANG et al. 2006). Allerdings wiesen PERRIÈRE et al. (2005) für primäre<br />
Rattenhirnendothelien TEER-Werte von bis zu 500 Ω*cm 2 nach, sodass die in dieser<br />
Arbeit gemessenen Widerstände auf eine geringere Dichtigkeit der Monolayer<br />
hindeuten. Die vergleichsweise hohe Mannitol-Permeabilität bei den Primärzellen der<br />
Ratte (6Well: 90,9 ± 5,6 nm/s; 12Well: 239,2 ± 72,0 nm/s), die für porcine<br />
Primärendothelien des Gehirns bei 17-18 nm/s lagen (FRANKE et al. 1999 & 2000),<br />
bestätigten die Vermutung der unzureichenden Integrität der Monolayer. Die in den<br />
beschriebenen Versuchen gemessenen hohen Mannitol-Permeabilitäten zeigten<br />
ähnlich hohe Werte wie für die immortalisierten humanen hCMEC/D3-Zellen<br />
(unabhängig vom Membran-Hersteller; 6Well: 90,2 ± 35,9 nm/s; 12Well: 230,4 ±<br />
109,2 nm/s). Wie auch für die humanen Zellen hCMEC/D3 konnte in den<br />
Rattenzellen nur ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen<br />
werden, der aber nicht vollständig bzw. wiederholbar durch die Pgp-Inhibitoren<br />
Tariquidar und Valspodar gehemmt wurde. Der Transport scheint fragwürdig, sodass<br />
der Transport von Antiepileptika unter diesen Bedingungen nicht weiter untersucht<br />
wurde.<br />
Eine Korrelation von TEER und Mannitol-Permeabilität wurde nicht<br />
festgestellt. Dies könnte mit der Kultivierungsdauer der Zellen zusammenhängen.<br />
Die rBCEC-Zellen befanden sich zu Zeitpunkt des Transportversuchs i.d.R. 8-11<br />
Tage auf den Membranen, was etwa dem 6.-9. Tag nach Erreichen der Konfluenz<br />
entsprach. Möglicherweise würde eine längere Kultivierung der primären Zellen die<br />
Parameter für die Integrität verbessern, sodass eventuell auch Transportstudien mit<br />
Antiepileptika durchgeführt werden können.<br />
Abschließend ist zu sagen, dass die Primärkulturen aus dem<br />
Hirnkapillarendothel der Ratte nach den hier vorliegenden Daten als In-vitro-Modell<br />
der BHS eher ungeeignet sind. Unter den vorliegenden Bedingungen konnte kein<br />
Pgp-vermittelter Transport nachgewiesen werden, der reproduzierbar inhibiert wurde.<br />
Für diese Zellen muss die Kultivierung auf Membran-Inserts und das Protokoll für die<br />
Transport-Assays optimiert werden, um eine Verbesserung des Transwell-Systems<br />
zu erzielen und weitere Substanzen auf ihren Transport durch Pgp untersuchen zu<br />
können.<br />
170
DISKUSSION<br />
6.3 Schlussbetrachtung<br />
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass bekannte Pgp-Induktoren und Antiepileptika<br />
in primären und immortalisierten Zelllinien unterschiedliche Effekte auf Pgp haben.<br />
Eine Erklärung dafür könnten verschiedene Mechanismen sein, die zu einer<br />
Induktion des MDT führen. Eine Möglichkeit ist die Induktion über nukleare<br />
Rezeptoren wie PXR und CAR (BAUER et al. 2004; AMBROZIAK et al. 2010). Es ist<br />
noch nicht für alle Antiepileptika belegt, ob ihre Wirkung über diese Rezeptoren<br />
vermittelt wird. Für Carbamazepin wurde allerdings in In-vitro- und In-vivo-Versuchen<br />
bewiesen, dass es über die Stimulation von PXR zur Induktion von Pgp führt<br />
(GIESSMANN et al. 2004; OWEN et al. 2006). Phenobarbital und Phenytoin führen<br />
ebenfalls zu einer Aktivierung der Rezeptoren PXR bzw. CAR (LUO et al. 2002,<br />
KODAMA et al. 2006; KÖHLE & BOCK 2009). Laut MILLER et al. (2010) weisen<br />
Hirnkapillarendothelzelllinien der Spezies Maus, Ratte, Schwein und Mensch PXR<br />
und CAR auf. Aber in Abhängigkeit der Spezies und eventuell auch der<br />
Immortalisierung werden sie nicht immer im gleichen Ausmaß exprimiert (XU et al.<br />
2005; CHEN 2010). Zum Beispiel konnte in GPNT-und RBE4-Zellen keiner dieser<br />
Rezeptoren nachgewiesen werden (AMBROZIAK et al. 2010). In GPNT-Zellen führte<br />
keines der untersuchten Antiepileptika zu einer Induktion. Dies passt zu der<br />
Aussage, dass in diesen Zellen die ONRs PXR und CAR nicht exprimiert werden. In<br />
RBE4-Zellen hingegen führten die Antiepileptika Carbamazepin (10 und 50 µM) und<br />
Topiramat (100 µM) aber zu einer Induktion der Funktionalität (Abbildung 5.12 B;<br />
NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Folglich sind andere Mechanismen denkbar, die<br />
hier eine Induktion hervorgerufen haben. In hCMEC/D3-Zellen wurde die Expression<br />
der genannten Rezeptoren nachgewiesen, allerdings waren diese herunterreguliert<br />
(DAUCHY et al. 2009). Letztlich ist aber festzuhalten, dass Carbamazepin und<br />
Valproat die Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen induzierten.<br />
In den rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin in relativ hohen<br />
Konzentrationen zu einer Inhibition der Pgp-Funktion. Dies sind aber nur vorläufige<br />
Ergebnisse. Weitere Versuche sind deshalb notwendig, um mögliche Induktionen der<br />
Pgp-Funktionalität in primären Hirnendothelzellen der Ratte durch Antiepileptika zu<br />
untersuchen. Weitere Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse in den<br />
immortalisierten und primären Zelllinien können in den verschiedenen Spezies, aus<br />
denen die Zellen stammen, begründet sein. BALTES et al. (2007a) zeigten<br />
171
DISKUSSION<br />
beispielsweise, dass sich humanes Pgp und Maus-Pgp im Transport von<br />
Antiepileptika unterscheiden. Der Immortalisierungsprozess könnte sich ebenfalls auf<br />
die Funktion der Transporterproteine auswirken. Aufgrund dessen ist es sinnvoll,<br />
diese Unterschiede genauer zu untersuchen.<br />
In den Transportuntersuchungen mit hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen konnte<br />
weder ein Pgp-vermittelter Transport von Digoxin noch von Verapamil nachgewiesen<br />
werden. Es war aber möglich, einen asymmetrischen Rhodamin-Transport auf<br />
12Well-Membraneinlagen sowohl in monokultivierten und kokultivierten Zellen beider<br />
Spezies zu zeigen. Dieser Transport wurde aber nicht vollständig durch die<br />
spezifischen Pgp-Inhibitoren Tariquidar und Valspodar gehemmt werden. Die<br />
Zelllinie und die Primärkulturen sind also nicht ohne Weiteres als In-vitro-Modell der<br />
BHS einsetzbar.<br />
In dem humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modell (STANNESS et al. 1996)<br />
wurden die in dieser Arbeit verwendete Zelllinie für Transportuntersuchungen bereits<br />
erfolgreich eingesetzt (JANIGRO et al. 1999; CUCULLO et al. 2002, 2007 & 2008),<br />
denn die Nachstellung der Scherkräfte des Blutstroms fördert die Ausbildung der<br />
charakteristischen Eigenschaften der BHS. Damit wird eine höhere Integrität der<br />
Zellen erreicht. Wenn das humane dynamischen In-vitro-BHS-Modell mit den hier<br />
beschriebenen Zellen gezielte Untersuchungen des Transports von Antiepileptika<br />
durch MDT ermöglicht, könnten die daraus gewonnenen Kenntnisse, ob<br />
Antiepileptika in therapeutischen Konzentrationen von MDT transportiert werden,<br />
eine gezieltere und effektivere Epilepsiebehandlung ermöglichen.<br />
172
ZUSAMMENFASSUNG<br />
ZUSAMMENFASSUNG<br />
Dana Alms<br />
Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug-<br />
Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und deren<br />
Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke verschiedener<br />
Spezies<br />
Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge etwa 50 Millionen Menschen<br />
(DUNCAN et al. 2006), weshalb eine wirksame Behandlung von großem Interesse<br />
ist. Die Patienten werden vorrangig mit Antiepileptika therapiert. Diese Medikamente<br />
zeigen aber bei etwa einem Drittel der Patienten nur eine unzureichende oder gar<br />
keine Wirkung (KWAN & BRODIE 2000). Es ist bis heute unklar, wodurch das<br />
Phänomen der Pharmakoresistenz ausgelöst wird. Ein viel diskutierter Ansatz ist die<br />
Multidrug-Transporter-Hypothese. Dieser zufolge führt eine Überexpression<br />
sogenannter Multidrug-Transporter (MDT) an der Bluthirnschranke (BHS) zu einem<br />
vermehrten Efflux der Antiepileptika zurück ins Blut, weshalb nur unzureichende<br />
Konzentrationen im epileptischen Fokus erreicht werden. Erste Zusammenhänge<br />
zwischen einer Hochregulierung solcher Transporter und der Pharmakoresistenz<br />
zeigten die Studien von TISHLER et al. (1995), die den gut untersuchten Transporter<br />
P-Glykoprotein (Pgp) in epileptischem Hirngewebe nachwiesen. Des Weiteren<br />
erbrachten Studien den Nachweis, dass Pgp eine Reihe der therapeutisch<br />
eingesetzten Antiepileptika transportiert (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009),<br />
wodurch niedrige Konzentrationen im Gehirn ebenfalls zu erklären sind. Dieser<br />
Transport wurde bisher nur für Phenytoin in Kapillarendothelzellen humanen<br />
Ursprungs untersucht (CUCULLO et al. 2007), weshalb in der vorliegenden Arbeit die<br />
immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-Modell eingesetzt wurde. Mit<br />
dieser Zelllinie sollte geklärt werden, ob der Transport von Antiepileptika durch Pgp<br />
nachgewiesen werden kann. Immortalisierte Endothelzellen gelten allerdings<br />
aufgrund einer unzureichenden Integrität der Zellmonolayer als ungeeignet für<br />
Transportstudien (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005). Aus diesem Grund<br />
wurden zusätzlich Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte präpariert.<br />
173
ZUSAMMENFASSUNG<br />
Diese wurden im Transwell-Modell eingesetzt, um deren Eignung und Pgpspezifischen<br />
Transport untersuchen zu können.<br />
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der MDT-Hypothese, der damit<br />
verbundenen Überexpression der MDT sowie der Etablierung einer humanen<br />
Zelllinie als Transwell-Modell. Von besonderem Interesse war dabei das Pgp. Es ist<br />
nicht hinreichend geklärt, wodurch eine verstärkte Funktion dieser Transporter bei<br />
epileptischen Patienten ausgelöst wird. Ziel der Untersuchungen war es<br />
herauszufinden, ob Antiepileptika die Funktionalität von Pgp induzieren. Dazu wurde<br />
die humane Zelllinie hCMEC/D3 ausgewählt. Bei hCMEC/D3-Zellen handelt es sich<br />
um immortalisierte Endothelzellen aus dem Temporallappen einer<br />
pharmakoresistenten Epilepsiepatientin (WEKSLER et al. 2005). Die hCMEC/D3-<br />
Zellen exprimieren für Endothelien typische Marker-proteine und werden für In-vitro-<br />
Untersuchungen eingesetzt (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al.<br />
2010). In vorläufigen Studien wurden auch primäre Hirnkapillarendothelzellen der<br />
Ratte eingesetzt.<br />
Der Western Blot ermöglichte den Nachweis von Pgp sowohl in den<br />
immortalisierten hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen als auch in den primären<br />
Hirnendothelien der Ratte. Die funktionelle Untersuchung wurde mit Hilfe von<br />
Kumulations-Assays mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 durchgeführt. Dazu<br />
wurden hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen mit den Antiepileptika Carbamazepin,<br />
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat behandelt. In den<br />
Primärkulturen wurden Carbamazepin und Phenytoin untersucht. Die Behandlung<br />
erstreckte sich i.d.R. über drei Tage. Im Kumulations-Assay konnte für alle Zelllinien<br />
und den primären rBCEC-Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden, dessen<br />
Funktion durch bekannte Induktoren und den spezifischen Inhibitor Tariquidar<br />
moduliert werden konnte. Dabei zeigten die hCMEC/D3-Zellen funktionelles Pgp,<br />
welches sich trotz vergleichsweise geringer Expression nur schwer induzieren ließ.<br />
Die Ergebnisse der Kumulations-Assays variierten in den Zellen der verschiedenen<br />
Spezies. Die Funktionalität von Pgp wurde nicht von allen Antiepileptika in den<br />
gewählten Konzentrationen beeinflusst. Das heißt, dass die getesteten Antiepileptika<br />
nicht in allen Zellen induzierende Wirkungen hatten. Die robustesten Effekte in<br />
hCMEC/D3-Zellen ließen sich mit Carbamazepin (100 µM) und Valproat (300 µM)<br />
zeigen. In RBE4-Zellen induzierte Carbamazepin (50 µM) die Funktionalität Pgps. In<br />
den Versuchen mit rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin zu einer<br />
174
ZUSAMMENFASSUNG<br />
Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch<br />
bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit<br />
Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere<br />
Konzentrationen der Antiepileptika untersucht werden, um mögliche<br />
konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser<br />
Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp<br />
vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen,<br />
konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden.<br />
Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse<br />
sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und<br />
Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben<br />
(CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer<br />
Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des<br />
Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen<br />
werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell-<br />
Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol-<br />
Permeabilitäten zeigte. Demzufolge führte die Kokultur dieser Gliazellen mit den<br />
Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der<br />
Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur<br />
teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die<br />
relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass<br />
die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der<br />
immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der<br />
Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des<br />
humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et<br />
al. 2002) könnten dazu beitragen, gezielte In-vitro-Untersuchung des Transports von<br />
Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen.<br />
175
SUMMARY<br />
SUMMARY<br />
Dana Alms<br />
Induction of multidrug transporters by antiepileptic drugs and known inducers<br />
and their transport in brain capillary endothelial cells of the blood-brain barrier<br />
of different species<br />
Approximately 50 million peoples are affected by epilepsies (DUNCAN et al.<br />
2006) and efficient therapies are of great interest. In most cases patients are treated<br />
with antiepileptic drugs (AEDs). But one third of the epileptic patients is not seizurefree<br />
under the AED treatment (KWAN & BRODIE 2000). Reasons for the<br />
phenomenon of pharmacoresistance are until now not fully understood. According to<br />
the multidrug transporter hypothesis, one explanation for pharmacoresistance, an<br />
overexpression of multidrug-resistance transporters (MDTs) at the blood-brain barrier<br />
(BBB) leads to an increased efflux of AEDs back to the blood and consequently<br />
inadequate concentrations in the epileptic focus. TISHLER et al. (1995) first<br />
described correlations between overexpression of multidrug-resistance transporter<br />
proteins and pharmacoresistance by detection of the well investigated MDT P-<br />
glycoprotein (Pgp) in epileptic tissue. Furthermore, studies provided evidence that<br />
several AEDs are transported by Pgp in therapeutic concentrations (LUNA-TORTÓS<br />
et al. 2008 und 2009). This would explain low brain concentration of these<br />
substances. So far, only the antiepileptic drug phenytoin was investigated regarding<br />
the transport by Pgp in human brain capillary endothelial cells (CUCULLO et al.<br />
2007).<br />
One object of the thesis was the investigation of the immortalized human brain<br />
endothelial cell line hCMEC/D3 as an in vitro model of the BBB and the transport of<br />
AEDs by Pgp in cells of human origin. But because of an insufficient tightness of the<br />
cell monolayers, immortalized brain endothelial cells are considered to be not<br />
suitable for transport studies (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005).<br />
Therefore, primary rat brain endothelial cells were dissected and utilized for transport<br />
assays to detect Pgp-specific transport.<br />
The thesis dealt with the MDT hypothesis, the associated overexpression of<br />
MDTs and the establishment of a human cell line in a transwell model. The initial<br />
176
SUMMARY<br />
cause of increased functionality of MDTs especially Pgp in epileptic patients is not<br />
adequately defined. One aim was to investigate, if AEDs induce Pgp functionality.<br />
For this purpose the immortalized human cell line hCMEC/D3, which was derived<br />
from the temporal lobe of a pharmacoresistant epilepsy patient (WEKSLER et al.<br />
2005), was chosen. These cells express characteristic endothelial marker proteins<br />
and are used for in vitro studies (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL<br />
et al. 2010). In preliminary studies, primary rat brain endothelial cells (rBCEC) were<br />
also used in a transwell model.<br />
Expression of Pgp was detected by Western blot in all immortalized cell lines<br />
(hCMEC/D3, GPNT, RBE4) and in the primary rBCEC cells. Functional analysis was<br />
performed by accumulation assays (or uptake assays) with the Pgp substrate<br />
rhodamine 123. Therefore, hCMEC/D3, GPNT, and RBE4 cells were exposed to the<br />
widely used AEDs carbamazepine, levetiracetam, phenobarbital, phenytoin,<br />
topiramate, and valproate at different therapeutic concentrations. For rBCEC cells,<br />
carbamazepine and phenytoin were investigated. Typically, the cells were treated for<br />
three days. In the uptake experiments functional Pgp in the cell lines hCMEC/D3,<br />
GPNT, and RBE4 as well as in rBCEC cells was detected, which could be modulated<br />
by known Pgp inducers and the known Pgp inhibitor tariquidar. The hCMEC/D3 cells<br />
showed only little inducing effects for Pgp-mediated efflux although the expression of<br />
this protein was relatively low compared to other cell lines. Data of the accumulation<br />
assays varied widely in cells of the different species. Pgp functionality was not<br />
affected by all tested AEDs in the chosen concentrations. In hCMEC/D3 cells, robust<br />
effects were detected after the treatment with carbamazepine (100 µM) and valproate<br />
(300 µM). In RBE4 cells, carbamazepine and topiramate induced Pgp functionality. In<br />
experiments with rBCEC cells carbamazepine and phenytoin led to an decreased<br />
efflux of the Pgp substrate rhodamine 123 and therefore the used concentrations of<br />
these AEDs seemed to have inhibiting effects on the Pgp functionality. Although<br />
known Pgp inducers in GPNT cells induced the rhodamine efflux, no effects were<br />
detected after treatment with AEDs. Because of varying results the analysis of<br />
additional concentrations of the AEDs is important to detect possible concentrationdependent<br />
effects. Data of the rhodamine uptake assays lead to the conclusion that<br />
several AEDs affect the functionality of Pgp.<br />
The transport studies revealed variable data. For primary brain cultures similar<br />
variable results were already described due to many different preparation and<br />
177
SUMMARY<br />
cultivation protocols (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). After modification<br />
of different parameters, especially for hCMEC/D3 cells, asymmetric transport of<br />
rhodamine 123 in these cells and rBCEC cells was detectable. Co-cultivation with<br />
astrocytes improved the transwell model by higher TEER values and slightly reduced<br />
mannitol permeabilities. Accordingly the co-culture of the immortalized human and<br />
primary rat brain endothelial cells with these glial cells led to an increased integrity of<br />
the monolayers. But the asymmetric transport of rhodamine 123 could only partially<br />
be inhibited by tariquidar and valspodar. Moreover, in comparison with literature the<br />
relatively low TEER values and the high permeabilities of mannitol revealed that the<br />
ideal conditions are not yet found. However, the improvement of the immortalized<br />
human hCMEC/D3 cells and the primary brain endothelial cells of rats as well as of<br />
other species as transwell model and the establishment of the humanized dynamic in<br />
vitro BBB model (STANNESS et al. 1996; CUCULO et al. 2002) respectively may<br />
contribute to specific investigations of AEDs transport by MDTs at the BBB.<br />
178
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204
205<br />
ANHANG
ANHANG<br />
8 ANHANG<br />
8.1 Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte<br />
Tabelle 8.1: Medien und Reagenzien, in alphabetischer Reihenfolge.<br />
Substanz<br />
Ammonium Persulfat (APS)<br />
Aquasafe 30 plus Scintillationsflüssigkeit<br />
Ascorbinsäure<br />
Basic fibroblast growth factor (bFGF)<br />
BCA Protein Assay Kit<br />
Bovine Serum Albumin (BSA)<br />
Bromphenolblau Natriumsalz<br />
Butanol<br />
Carbamazepin<br />
Chemically defined lipid concentrate<br />
Collagen Typ I<br />
Collagen Typ IV<br />
Collagenase II<br />
Coomassie ® Brillantblau R-250<br />
Cyclic Adenosinphosphat (cAMP)<br />
Desoxycholsäure Natriumsalz (DOC)<br />
Desoxyribonuclease (DNAse) I<br />
Dexamethason<br />
Digoxin<br />
Dinatriumhydrogenphosphat Na 2 HPO 4<br />
Dimethylsulfoxid (DMSO)<br />
Dispase II<br />
Dithiothreitol (DTT)<br />
DMEM, Low Glucose<br />
DMEM/F-12<br />
Doxorubicin (Hydrochlorid)<br />
EBM-2 Medium<br />
Essigsäure 100 %<br />
Ethanol (100 %)<br />
Ethanol (vergällt)<br />
Fetales Kälberserum FKS, (standardisiert und<br />
nicht-standardisiert)<br />
Fibronectin<br />
Glycerol<br />
Glycin<br />
Ham’s F-10 + GlutaMAX-I<br />
HBSS<br />
HEPES<br />
Humanes Serum<br />
Hydrocortison<br />
Kaliumchlorid<br />
Bezugsquelle<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Zinsser Analytic, Frankfurt<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Thermo Scientific, Rockford, USA<br />
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-<br />
Bettingen<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Roche, Mannheim<br />
Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Biochrom AG, Berlin<br />
AppliChem, Darmstadt<br />
Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Roche, Mannheim<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
AppliChem, Darmstadt<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Roche, Mannheim<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach<br />
Lonza Ltd., Basel, Schweiz<br />
AppliChem, Darmstadt<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
CG Chemikalien, Laatzen<br />
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich;<br />
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-<br />
Bettingen<br />
Biochrom AG, Berlin<br />
AppliChem, Darmstadt<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Merck, Darmstadt<br />
206
ANHANG<br />
Substanz<br />
Kaliumdihydrogenphosphat KH 2 PO 4<br />
Levetiracetam<br />
L-Glutamin (200 mM)<br />
Magermilchpulver<br />
MEM + GlutaMAX-I<br />
Methanol<br />
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin (TEMED)<br />
Natriumchlorid<br />
Natriumhydroxid<br />
Natriumpyruvat<br />
Opti-MEM ®<br />
Precision Plus Protein Standard (Dual color)<br />
Penicillin/Streptomycin<br />
(10.000 E/10.000 µg/ml)<br />
Phenobarbital<br />
Phenytoin<br />
Primärantikörper anti-Pgp C219<br />
(Maus, monoklonal)<br />
Primärantikörper anti-ß-Aktin (Kaninchen,<br />
monoklonal)<br />
Protease Inhibitor Cocktail Tablets<br />
Puromycin Dihydrochlorid<br />
Rhodamin 123<br />
Rifampicin<br />
Ro-20-1724<br />
Rotiphorese ® Gel 30<br />
Röntgen-Entwickler<br />
Röntgenfixierlösung<br />
Salzsäure p. a. (37 %ig)<br />
Sekundärantikörper Ziege-anti-Kaninchen-HRP<br />
Sekundärantikörper Kaninchen-anti-Maus-HRP<br />
Sodiumdodecylsulfat Pellets<br />
SuperSignal ® West Femto Kit<br />
Tariquidar<br />
Bezugsquelle<br />
Merck, Darmstadt<br />
UCB Pharma, Brüssel, Belgien<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Fluka Biochemika, Deisenhofen<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Merck KgaA, Darmstadt<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
BIO-RAD Labaratories GmbH, München<br />
Biochrom AG, Berlin<br />
Serva, Heidelberg<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Signet Covance, California, USA<br />
Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Roche, Mannheim<br />
Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
TETENAL AG & CO. KG, Norderstedt<br />
TETENAL AG & CO. KG, Norderstedt<br />
Merck KgaA, Darmstadt<br />
Dako Deutschland, Hamburg<br />
Dako Deutschland, Hamburg<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Thermo Scientific, Rockford, USA<br />
Xenova Ltd., Berkshire, UK<br />
The R. W. Johnson Research Institute,<br />
Topiramat<br />
Pennsylvania, USA<br />
Tris<br />
AppliChem, Darmstadt<br />
Tris-Glycin-Fertiggele (10 %, NOVEX ® )<br />
Life Technologies GmbH, Darmstadt<br />
Triton X-100<br />
Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Trypan Blue Solution (0,4 %)<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Trypsin/EDTA-Lösung 10x (0,5/0,2 %)<br />
Biochrom AG, Berlin<br />
Tween 20<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Tween 80<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Valproat<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
Valspodar (PSC833)<br />
Novartis Pharma GmbH, Nürnberg<br />
Verapamil<br />
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim<br />
3 H-Digoxin Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim<br />
3 H-Verapamil Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig<br />
14 C-Mannitol Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig<br />
207
ANHANG<br />
Tabelle 8.2: Bezugsquellen Materialien und Geräte in alphabetischer Reihenfolge.<br />
Materialien und Geräte<br />
Hersteller<br />
Akku-Schüttler KM-2<br />
Edmund Bühler Labortechnik GmbH, Hechingen<br />
Altromin 1324 Standarddiät (für Ratten)<br />
Altromin GmbH, Lage<br />
Blottingpapier (d=3 mm)<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
CO 2 -Inkubator Heraeus BBD 6220<br />
Heraeus Instruments GmbH, Osterode<br />
CO 2 -Inkubator NU-4500E<br />
NuAire Inc., Plymouth, USA<br />
Deckgläschen<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Einmalkanülen<br />
TERUMO ® Europe N.V., Leuven, Belgien<br />
Einmalspritzen<br />
B. Braun Melsungen AG, Melsungen<br />
Eismaschine<br />
ZIEGRA Eismaschinen GmbH, Isernhagen<br />
Elektronische Mikrowaagen CPA 225D<br />
Sartorius AG, Göttingen<br />
Elektrophoresekammer und Stromgerät<br />
Biometra GmbH, Göttingen,<br />
Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN ® Tetra BIO-RAD Labaratories GmbH, München<br />
Cell + PowerPac Basic Power Supply<br />
Vakuumfiltrationseinheit<br />
Millipore, Billerica, MA, USA<br />
Fluoreszenzmessgerät FLUOStar OPTIMA BMG Labtech GmbH, Ortenberg<br />
Laborpumpe BVC 21<br />
Vacuubrand GmbH + Co. KG, Wertheim<br />
Leica Mikroskop DM LB und TCS SP5 AOBS Leica Mikroskopie & Systeme GmbH, Wetzlar<br />
Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,<br />
Schwabach<br />
Makrolonkäfige<br />
Ebeco, Caustrop-Rauxel<br />
Millicell ® Membran-Inserts<br />
Millipore, Billerica, MA, USA<br />
Mini-Laborpumpe LABOPORT ® neoLab ® Laborbedarf-Vertriebs GmbH,<br />
Heidelberg<br />
MRX Microplate Reader<br />
Dynatech Deutschland GmbH, Denkendorf<br />
Multiwell-Platten<br />
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen<br />
NIKON Eclipse TS100<br />
NIKON INSTRUMENTS INC., Melville, USA<br />
Nylon-Gewebesieb (Porendurchmesser: 70 und BD Falcon, BD Biosciences, Heidelberg<br />
40 µm)<br />
Nylonmembran NITEX (Porendurchmesser = 80 SEFAR GmbH, Edlingen<br />
µm)<br />
Objektträger<br />
Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig<br />
Operationsbesteck<br />
Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Melsungen<br />
Pasteurpipetten<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
pH-Meter<br />
Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co.,<br />
Berlin<br />
Pipettenspitzen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen;<br />
Eppendorf AG, Hamburg<br />
Pipettierhilfe accu-jet ® pro<br />
BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim<br />
PVDF Transfer Membran T830.1<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Röhrchen 15, 50 ml<br />
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen<br />
Röntgenfilm CL-Xposure Film<br />
Fisher Scientific GmbH, Schwerte<br />
Schüttler Mini-Rocker MR-1<br />
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen<br />
Semi-Dry-Electroblotter PerfectBlue<br />
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen<br />
Sicherheitsbrenner FIREBOY plus<br />
INTEGRA Biosciences GmbH, Fernwald<br />
Skalpellklingen, steril (OR-System)<br />
Otto Rüttgers GmbH & Co. KG, Solingen<br />
Sterilwerkbank NU-440-400E und NU-480-600E NuAire Inc., Plymouth, USA<br />
Szintillationscounter Liquid Scintillator System Beckman Coulter Inc., Brea, USA<br />
LS 5000 TA<br />
208
ANHANG<br />
Materialien und Geräte<br />
Hersteller<br />
ThinCerts ® Membran-Inserts<br />
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen<br />
Transwell ® Membran-Inserts<br />
Corning Costar GmbH, Bodenheim<br />
TEER-Messkammer (EndOhm-24SNAP) World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL,<br />
USA<br />
TEER-Messpinzette (Elektrodenset EVOM) World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL,<br />
USA<br />
Ultraschallbad Sonorex Super<br />
BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin,<br />
Vortex REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,<br />
Schwabach<br />
Wasserbad<br />
Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel<br />
Wasserfeste Stifte<br />
Edding International GmbH, Ahrensburg<br />
Wattestäbchen<br />
Dirk Rossmann GmbH, Burgwedel<br />
Weichholzgranulat<br />
Rettenmaier & Söhne GmbH & Co KG,<br />
Rosenberg<br />
Whatman ® -Blotting-Papiere<br />
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe<br />
Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal<br />
Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-<br />
Königshofen<br />
Zellkulturflaschen (A = 25 cm 2 )<br />
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen<br />
Zellkulturschalen Ø 60, 100 mm<br />
Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht<br />
Zellschaber<br />
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen<br />
Zentrifuge ( Multifuge 1S-R)<br />
Thermo Electronic Corporation, Osterode<br />
Zentrifuge Labofuge 400<br />
Heraeus Instruments GmbH, Hanau<br />
96Well-Platten (schwarz)<br />
Corning Incorporated, USA<br />
209
ANHANG<br />
8.2 Gewinnung primärer Rattenhirnkapillarendothelien<br />
Medien und Puffer<br />
Phosphat-gepufferte Saline (PBS) pH 7,3<br />
137 mM NaCl<br />
2,7 mM KCl in A. dest. lösen<br />
4,3 mM Na 2 HPO 4 pH-Wert einstellen<br />
1,47 mM KH 2 PO 4<br />
Für die Verwendung in der Zellkultur wurde der Puffer autoklaviert, ansonsten unsteril verwendet.<br />
PBS (pH 7,3) + 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
Lagerung bei 4 °C<br />
Enzymlösung<br />
Dispase II in DMEM/F-12 lösen (20 mg/ml)<br />
DNAse I in A. dest. lösen (10 mg/ml)<br />
19 ml DMEM/F-12<br />
1 ml Dispase II Lösung alle Lösungen<br />
10 µl DNAse I Lösung mischen und<br />
200 µl Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml) sterilfiltrieren<br />
Collagenase II (270 U/ml)<br />
20 % (w/v) BSA-Lösung<br />
4 g in 20 ml DMEM/F-12 auf einem Magnetrührer lösen und sterilfiltrieren<br />
cAMP-Ro 20-1724-Lösung<br />
cAMP – Stammlösung: 100 mg/8 ml oder 10 mg/0,8 ml A. bidest.<br />
Ro 20-1724 – Stammlösung: 19,5 mg/2 ml DMSO<br />
Herstellen einer 20:1 Mischung<br />
Medium A (Grundmedium)<br />
EBM-2 Medium<br />
20 % (v/v) Serum<br />
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)<br />
1 mM HEPES<br />
1 % (v/v) L-Glutamin (Stocklösung: 200 mM)<br />
500 ng/ml Hydrocortison<br />
Medium B<br />
Medium C<br />
Siehe Grundmedium<br />
Siehe Grundmedium<br />
+ 2 ng/ml bFGF + 1 ng/ml bFGF<br />
Collagen IV-Lösung<br />
Collagen IV in A. bidest. lösen (1 mg/ml)<br />
1:10 Verdünnung der Stocklösung<br />
pro cm 2 Wachstumsfläche 50 µl; 1 h bei 37 °C inkubieren, Collagen-Lösung abnehmen und<br />
Zellkulturgefäße unter der Sterilbank trocknen lassen<br />
210
ANHANG<br />
Collagen IV-Fibronectin-Lösung<br />
Collagen IV in A. bidest. lösen (1 mg/ml)<br />
270 µl Collagen IV-Stocklösung<br />
+ 135 µl Fibronectin-Stocklösung (1 mg/ml)<br />
+ 2,295 ml A. bidest.<br />
120 µl der Mischung pro Insert pipettieren, 2 h bei 37 °C inkubieren, Lösung abnehmen, Inserts<br />
unter der Sterilbank trocknen lassen<br />
Präparation<br />
1) 5-6 Ratten (2-3 Wochen alt) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im<br />
Becherglas auf Eis sammeln<br />
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren in Petrischale mit eiskaltem PBS + 1 %<br />
Penicillin/Streptomycin sammeln<br />
3) Kleinhirn abtrennen, auf Filterpapier mit Wattestäbchen von Meningen befreien<br />
4) Stammhirn, Plexus entfernen Cortices in neue Petrischale mit Puffer überführen, Lagerung auf<br />
Eis!<br />
5) Puffer absaugen und Cortices mit Skalpellen zu homogenen Brei zerkleinern<br />
6) 15 ml Enzymlösung zugeben und mit 10 ml-Pipette homogenisieren, in ein 50 ml-Röhrchen<br />
überführen<br />
7) 1,5 h im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln<br />
8) Verdau mit 20 ml 20 % BSA-Lösung mischen, Gemisch auf zwei 50 ml-Röhrchen verteilen<br />
9) 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugieren, Überstand (Myelin) dekantieren und verwerfen, Pellet<br />
mit restlicher Enzym-Lösung resuspendieren<br />
10) 1 h im Wasserbad bei 37 °C inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln<br />
11) Nylonmembran (Porendurchmesser: 80 µm) 3-mal mit 5 ml DMEM/F12 spülen<br />
12) Verdau durch Nylongewebe filtrieren, zurückgehaltene Kapillaren 3-mal vorsichtig mit je 5 ml<br />
DMEM/F-12 waschen, Filtrat verwerfen<br />
13) Kapillaren mit 11 ml Medium A ohne Puromycin vom Filter waschen<br />
14) Pro Petrischale (A = 28 cm 2 ) 5 ml Zellsuspension + 20 µl Puromycin-Lösung (Endkonzentration: 4<br />
µg/ml) versetzen<br />
Kultivierung<br />
1) 3 Tage im Brutschrank kultivieren, mit Medium A waschen, Mediumswechsel auf Medium B<br />
2) Für Aussaat auf Membran-Inserts Beschichtung mit Collagen IV und Fibronectin<br />
3) Bei 70-80 % Konfluenz: Passage auf beschichtete Membran-Inserts (0,5 bzw. 1,5 ml<br />
Zellsuspension pro 12Well bzw. 6Well-Insert), Medium C<br />
4) Alle 2-3 Tage Mediumswechsel: Medium absaugen, sammeln, zentrifugieren, Überstand 1:1 mit<br />
frischem Medium mischen<br />
5) 1 Tag vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung<br />
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
211
ANHANG<br />
8.3 Gewinnung primärer Astrozyten der Ratte<br />
Medien und Puffer<br />
PBS (pH 7,3)<br />
PBS (pH 7,3) + 2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
Siehe Abschnitt 8.2 Lagerung bei 4 °C<br />
Dissoziationslösung<br />
9,2 ml DMEM<br />
0,4 ml Trypsin/EDTA-Lösung (10x) alle Lösungen<br />
0,2 ml HEPES (1 M) mischen und<br />
0,1 ml DNAse I (Endkonzentration: 0,1 mg/ml) sterilfiltrieren<br />
0,1 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)<br />
Astrozyten-Medium<br />
DMEM Low Glucose<br />
10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)<br />
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
Präparation<br />
1) 5-6 Ratten (0-3 Tage alt, P0-P3) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im<br />
Becherglas mit PBS + 2% Penicillin/Streptomycin auf Eis sammeln<br />
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren, Stammhirn und Kleinhirn entfernen, Cortices in<br />
Petrischale mit eiskaltem PBS + 2 % Penicillin/Streptomycin sammeln<br />
3) Cortices auf Filterpapier von Meningen befreien, Cortexhälften trennen, Hippocampus durch<br />
Herausrollen entfernen Cortices in 15 ml-Röhrchen mit Puffer sammeln, Lagerung auf Eis!<br />
4) Puffer absaugen, Dissoziationslösung zugeben, Cortices mit 10 ml-Pipette homogenisieren<br />
5) Homogenat 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, regelmäßig schütteln<br />
6) Verdau sorgfältig mit 10 ml-Pipette dissoziieren<br />
7) 5 min bei 400xg zentrifugieren, Überstand absaugen (oder dekantieren)<br />
8) Pellet in 10 ml Astrozytenmedium resuspendieren<br />
9) 5 min bei 200xg zentrifugieren, Überstand absaugen<br />
10) Pellet in 6 ml Astrozytenmedium (1 ml/Gehirn) aufnehmen<br />
11) Zellsuspension durch ein Gewebesieb filtrieren (erst 70 µm, dann 40 µm)<br />
12) Aussaat der Zellen in 25 cm 2 Flaschen (3-4 Gehirne/Flasche)<br />
Kultivierung<br />
1) mikroskopische Kontrolle am nächsten Tag, Medium absaugen, abgesetzte Zellen mit<br />
Astrozytenmedium vorsichtig waschen, neues Medium hinzugeben<br />
2) alle 2-3 Tage Mediumswechsel<br />
3) Entfernung der Oligodendrozyten und Mikroglia: Flaschen bei 250 Umdrehungen/min (U/min)<br />
schütteln für einige Stunden oder über Nacht<br />
4) bei ca. 90 % Konfluenz: Passage oder Kryokonservierung<br />
5) für Kokultur mit Hirnkapillarendothelzellen: bei 70-80 % Konfluenz Aussaat der Astrozyten 3 Tage<br />
vor Endothelzellen<br />
212
ANHANG<br />
8.4 Durchführung eines Kumulations-Assays<br />
Medien und Puffer<br />
PBS (pH 7,3)<br />
Versuchsmedium<br />
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®<br />
Collagen I-Lösung (für hCMEC-, GPNT-und RBE4-Zellen)<br />
Collagen I in 0,2 % Essigsäure lösen (2 mg/ml)<br />
1:50 Verdünnung der Stocklösung<br />
1h bei 37 °C inkubieren, Collagen-Lösung abnehmen und Zellkulturgefäße unter der Sterilbank<br />
trocknen lassen<br />
Collagen IV-Lösung (für rBCEC-Zellen)<br />
Siehe Abschnitt 8.2<br />
Lysis-Puffer (pH 8,0)<br />
25 mM Tris<br />
50 mM NaCl<br />
0,5 % (w/v) Natrium-deoxycholat<br />
0,5 % (v/v) Triton X-100<br />
Frisch zugesetzt: 1x Protease Inhibitor Cocktail Complete ®<br />
Lagerung bei 4 °C<br />
Aussaat und Kultivierung der Zellen<br />
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6Well-Platten. Für die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen wurden<br />
die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. Collagen IV beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage<br />
bis zur Konfluenz kultiviert und i.d.R. ab dem dritten Tag der Konfluenz behandelt. Für alle Gruppen<br />
wurde eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.<br />
Kumulations-Assay<br />
1) Vorbereiten des Assay-Mediums mit Inhibitor Tariquidar (TQD):<br />
Stocklösung: 5 mM TQD in DMSO<br />
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet<br />
2) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop; Auswahl der Wells, die mit dem<br />
Inhibitor inkubiert werden<br />
3) Absaugen des Mediums, Opti-MEM ® +/- Inhibitor auf die Zellen geben (3 ml Medium pro Well)<br />
4) Inkubation der Zellen für 1 h im Inkubator bei 50 U/min<br />
5) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin<br />
Rhodamin 123<br />
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol<br />
Opti-MEM ® + 10 µM Rhodamin 123<br />
Digoxin<br />
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO<br />
Stocklösung 2: Opti-MEM ® + Stocklösung 1 (100 µM)<br />
Versuchsmedium: Opti-MEM ® + 1 µM Stocklösung 2 + 10 kBq/ml 3 H-Digoxin<br />
Vom Versuchsmedium: Medium + TQD ansetzen (0,5 µM TQD)<br />
6) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-<br />
Inhibitor ersetzen (3 ml/Well)<br />
7) Inkubation für 2 h bei 37 °C und bei 50 U/min<br />
213
ANHANG<br />
8) Versuchsende: Entnahme von je 100 µl Mediumproben, restliches Medium absaugen, Platten auf<br />
Eis halten<br />
9) Zellen mit eiskaltem PBS waschen, Zellen mit Schaber lösen, in je 500 µl PBS aufnehmen und in<br />
ein Eppendorfgefäß überführen<br />
10) Zentrifugieren der Zellen bei 250xg für 8 min bei 4 °C<br />
11) Überstand entfernen, Zugabe von je 150 µl Lysispuffer, Zellen resuspendieren<br />
12) Entnahme von 100 µl Zelllysat und Transfer auf schwarze 96Well-Platten<br />
13) Messung der Lysate, Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät<br />
(FLUOStar OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid<br />
Scintillator System LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)<br />
Proteinbestimmung<br />
1) Zentrifugation des verbleibenden Zelllysats bei 18550xg und 4 °C für 15 min<br />
2) Überführen der Überstande in neue Eppendorfgefäße<br />
3) Pro Probe 10 µl Volumen auf 96Well-Platte pipettieren (i.d.R. unverdünnt und 1:2 verdünnt),<br />
zusätzlich 10 µl pro Konzentration der BSA-Standardreihe<br />
4) Ansetzen der Reaktionslösung: Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung im Verhältnis 50:1<br />
mischen (BCA-Assay-Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA)<br />
5) Zugabe von je 200 µl Reaktionslösung, 30 min bei 37 °C dunkel inkubieren<br />
6) Messung der optischen Dichte, Ermittlung der Eichkurve<br />
7) Berechnung der Proteinkonzentration (mg/ml) anhand der Eichkurve mit Excel ® (Microsoft,<br />
Unterschleißheim)<br />
Auswertung<br />
1) Berechnung des Substratgehalts anhand der Proteinkonzentration<br />
2) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)<br />
Für alle Versuche erfolgte die Auswertung der Ergebnisse so, dass zweiseitig und stets gegen<br />
die Kontrolle getestet wurde.<br />
214
ANHANG<br />
8.5 Durchführung eines Transport-Assays<br />
Medien und Puffer<br />
PBS (pH 7,3)<br />
Versuchsmedium<br />
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®<br />
Versuchspuffer<br />
HBSS-Puffer (Hank’s Balanced Salt Solution; 1x)<br />
10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)<br />
1 mM Natriumpyruvat<br />
Medien zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf Transwell-Inserts<br />
1. Normales Kulturmedium<br />
EBM-2 Medium<br />
5 % (v/v) FKS<br />
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin<br />
1 % (v/v) HEPES<br />
0,01 % Hydrocortison<br />
0,1 % bFGF<br />
0,5 % (v/v) Ascorbinsäure<br />
1 % Lipidkonzentrat<br />
2. Medium mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren<br />
EBM-2 Medium<br />
2,5 % (v/v) FKS<br />
1 % Penicillin/Streptomycin<br />
0,05 % (v/v) Hydrocortison<br />
0,1 % (v/v) bFGF<br />
Je 0,025 % Ascorbinsäure, VEGF, IGF, EGF<br />
3. Medium mit weniger Zusätzen<br />
EBM-2 Medium<br />
2,5 % FKS<br />
1 % Penicillin/Streptomycin<br />
1 % HEPES<br />
0,00055 % Hydrocortison<br />
0,1 % bFGF<br />
24 h vor dem Transportversuch Zugabe von 1 nM Simvastatin:<br />
Stocklösung 1: 60 mM; dazu Simvastatin in Ethanol lösen (50 mg/ml), Zugabe von 0,813 ml 1 N<br />
Natriumhydroxid und Einstellen des pH-Werts auf 7,2.<br />
Stocklösung 2: Stocklösung 1 in Medium verdünnen (1 µM)<br />
1 Tag vor dem Versuch wird Simvastatin dem Zellkulturmedium so zugegeben, dass es in einer<br />
Konzentration von 1 nM im Medium gelöst ist.<br />
Medien zur Kultivierung der rBCEC-Zellen auf Transwell-Inserts<br />
Medium C: Siehe Abschnitt 8.2<br />
24 h vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung (20:1):<br />
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal<br />
215
ANHANG<br />
Aussaat und Kultivierung der Zellen<br />
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6- und 12Well-Membraneinlagen, für Transportversuche nach<br />
der bidirektionalen Methode wurden lediglich 6Well-Membraninserts verwendet. Für die hCMEC/D3-<br />
und rBCEC-Zellen wurden die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. einem Gemisch aus<br />
Collagen IV und Fibronectin beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage bis zur Konfluenz kultiviert und<br />
i.d.R. ab dem 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transportversuch verwendet. Für alle<br />
Gruppen wurde fast ausschließlich eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.<br />
Für Transportversuche mit den hCMEC/D3-Zellen wurden diese in verschiedenen Medien<br />
kultiviert und zwei verschiedene Versuchsmedien verwendet. Des Weiteren wurden die Zellen 1 Tag<br />
vor dem Versuch mit und ohne 1 nM Simvastatin kultiviert.<br />
Bidirektionaler Transport-Assay<br />
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden<br />
2) Inhibitor lösen: 5 mM Tariquidar in DMSO<br />
3) Versuchsmedium +/-Inhibitor bzw. Versuchsmedium + Vehikel (= Lösungsmittel des Inhibitors:<br />
DMSO) ansetzen<br />
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet.<br />
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die<br />
Inkubation mit Inhibitor<br />
5) Medium in den Transwell-Inserts absaugen (erst basolateral, dann apikal)<br />
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: 2,5 ml basolateral, 1,5 ml apikal<br />
7) 1 h Vorinkubation (bei 50 U/min und bei 37 °C)<br />
8) Medium für Permeabilitätskontrolle vorbereiten:<br />
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol<br />
9) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin<br />
Rhodamin 123<br />
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol<br />
Vom<br />
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123<br />
Versuchsmedium<br />
Digoxin<br />
Medium + Inhibitor<br />
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO<br />
bzw. Vehikel<br />
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)<br />
vorbereiten<br />
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin<br />
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette<br />
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-<br />
Inhibitor ersetzen (2,7 ml basolateral, 2 ml apikal)<br />
Das Medium mit Substrat wird nur in eine der beiden Kammern gegeben, entweder apikal oder<br />
basolateral. Die Probenentnahme erfolgt kontralateral.<br />
Mannitol nur in basolaterale Kammer geben, apikal erfolgt nur die Zugabe des<br />
Versuchsmediums. Aus dieser Kammer werden auch die Proben entnommen.<br />
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min<br />
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten: 100 µl Probenvolumen aus der kontralateralen<br />
Kammer<br />
Zusätzlich Entnahme von Ausgleichsvolumina: apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl<br />
14) Versuchsende: Entnahme der letzten Proben, erneute TEER-Messung, entsprechende<br />
Entsorgung der verbleibenden Flüssigkeiten<br />
15) Messung der Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät (FLUOStar<br />
OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid Scintillator System<br />
LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)<br />
16) Berechnung des Substratgehalts mit Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim)<br />
17) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)<br />
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.<br />
216
ANHANG<br />
Transport-Assay nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)<br />
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden<br />
2) Inhibitor lösen: 5 mM TQD in DMSO oder 8,23 mM PSC833 in Ethanol/Tween80 (9:1) und A.<br />
bidest.<br />
3) Versuchsmedium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten<br />
TQD wird in einer Konzentration von 0,5 µM, PSC833 in einer Endkonzentration von 10 µM<br />
verwendet.<br />
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die<br />
Inkubation mit dem Inhibitor<br />
5) Absaugen des Medium in den Transwell-Inserts (erst basolateral, dann apikal)<br />
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: Volumen vom Format der Membran-<br />
Inserts abhängig (12Well bzw. 6Well) basolateral: 1,5 bzw. 2,5 ml, apikal 0,7 bzw. 1,5 ml<br />
7) 1 h Vorinkubation (bei 37 °C und 50 U/min)<br />
8) Vorbereitung des Versuchsmediums mit jeweiligem Substrat: Rhodamin 123, Digoxin oder<br />
Verapamil<br />
Rhodamin 123<br />
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol<br />
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123<br />
Digoxin<br />
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO<br />
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)<br />
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin<br />
Verapamil<br />
Stocklösung 1: 4,375 mM Verapamil in Ethanol<br />
Stocklösung 2: Stocklösung 1 im Versuchsmedium verdünnen (43,75 µM)<br />
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Verapamil<br />
Vom Versuchsmedium: Medium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten<br />
9) Medium für Permeabilitätskontrolle ansetzen:<br />
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol<br />
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette<br />
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-<br />
Inhibitor ersetzen (basolateral: 1,5 bzw. 2,7 ml, apikal: 0,7 bzw. 1,5 ml)<br />
Das Medium mit Substrat wird in beide Kammern gegeben. Die Probenentnahme erfolgt<br />
ebenfalls aus beiden Kammern.<br />
Mannitol wird nur in die basolaterale Kammer geben, apikal erfolgen nur die Zugabe des<br />
Versuchsmediums sowie auch die Probenentnahme.<br />
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min<br />
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten aus beiden Kammern: 50 bzw. 100 µl<br />
basolateral, 70 bzw. 130 µl apikal<br />
14) Weiteres Vorgehen siehe Bidirektionaler Transport-Assay<br />
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.<br />
217
ANHANG<br />
8.6 Durchführung eines Western Blots<br />
Lösungen und Puffer<br />
Sämtliche Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser angesetzt.<br />
PBS (pH 7,3) Lysis-Puffer (pH 8,0)<br />
Siehe Abschnitt 8.2 Siehe Abschnitt 8.4<br />
5x Laemmli-Puffer<br />
2 % (w/v) SDS<br />
50 mM Tris, pH 6,8<br />
0,2 mg/ml Bromphenol Blau<br />
0,1 M DTT<br />
10 % (v/v) Glycerol<br />
Lagerung bei -20 °C<br />
Transferpuffer<br />
Elektrophoresepuffer<br />
25 mM Tris 25 mM Tris<br />
192 mM Glyzin 250 mM Glyzin<br />
10 % Methanol 0,1 % (w/v) SDS<br />
PBS mit Tween-20 (PBS-T)<br />
Siehe Zusammensetzung PBS + 0,05 % Tween-20<br />
Coomassie-Färbelösung<br />
60-80 mg Coomassie Brillantblau R-250<br />
35 mM HCl<br />
A. bidest. ad 1000 ml<br />
lichtgeschützte Lagerung bei 4 °C<br />
Magermilchlösung<br />
2 % bzw. 5 % Magermilchpulver (w/v) in PBS-T<br />
Polyacrylamidgel<br />
Sammelgel<br />
Trenngel<br />
4 % Acrylamid 10 % Acrylamid<br />
0,5 M Tris (pH 6,8) 1,5 M Tris (pH 8,8)<br />
0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS<br />
0,1 % APS 0,1 % APS<br />
0,1 % TEMED 0,1 % TEMED<br />
Alle Schritte ab Herstellung der Proteinlysate fanden unsteril ohne die Verwendung der Sterilbank<br />
statt.<br />
218
ANHANG<br />
Herstellung der Proteinlysate<br />
Für die Herstellung der Lysate wurden die Zellen zunächst mit kaltem PBS gewaschen.<br />
Anschließend wurden 300-800 µl mit Protease-Inhibitor versetztem Lysispuffer in Abhängigkeit von<br />
der Größe der Kultivierungsgefäße auf die Zellen gegeben und für diese über 30 min auf Eis inkubiert.<br />
Anschließend wurden die Zellen mit Hilfe eines Schabers von der Oberfläche der Kulturschalen/Wells<br />
gelöst, das Volumen in Eppendorfgefäße überführt und darin eventuell noch intakte Zellen lysiert.<br />
Nach einer 15-minütigen Zentrifugation bei 18550xg und 4 °C wurde der Überstand in ein neues<br />
Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung bei – 20 °C gelagert.<br />
Vorbereitung der Proben<br />
Mittels des BCA Protein Assays wurde die Proteinkonzentration der Zellproben bestimmt, um<br />
für alle Proben die gleiche Proteinmenge auftragen zu können (genauere Angaben siehe 4.3.1<br />
Bestimmung der Proteinkonzentration). Pro Probe wurden i.d.R. 15-40 µg Protein eingesetzt. Die<br />
Proben wurden mit dem nötigen Volumen an Proteinlysat vorbereitet und mit einem Viertel des<br />
jeweiligen Volumens an 5x konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bei<br />
37 °C inkubiert.<br />
Elektrophorese: SDS-PAGE<br />
Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelen und des Detergenz<br />
Sodiumdodecylsulfat (SDS), welches die Proteine denaturiert und ihnen eine negative Ladung<br />
verschafft. In den Gelen wurden die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, wobei kleinere<br />
bzw. leichtere Proteine eine längere Laufstrecke im Gel zurücklegen.<br />
Sofern keine Fertiggele (10 % Tris-Glycin, Life Technologies, Darmstadt) verwendet wurde, fanden für<br />
die Gelelektrophorese zwei Gele Anwendung: das Sammelgel (4 % Acrylamid) und das Trenngel<br />
(10 % Acrylamid). Ersteres sorgte für die Konzentration der Proben in den Geltaschen und damit für<br />
einen gleichmäßigen Lauf der Proteine. Im Trenngel erfolgte dann die eigentliche Auftrennung des<br />
Proteingemisches in einzelne Proteinbanden. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von max.<br />
U = 125 V durchgeführt.<br />
Elektroblotting<br />
Nach der Auftrennung des Proteingemisches mittels SDS-PAGE erfolgte die Übertragung auf<br />
eine Polyvinylidenmembran in einer Semi-Dry-Blottingapparatur. Dazu wurden 6 Whatman ® -Blotting-<br />
Papiere (Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe) und die Membran auf die Größe des Gels<br />
zurechtgeschnitten. Die PVDF-Membran (PVDF Transfer Membran T830.1, Carl Roth GmbH + CO.<br />
KG, Karlsruhe) wurde mit Hilfe von 100 % Methanol für die folgenden wässrigen Lösungen zugänglich<br />
gemacht.<br />
Daran anschließend erfolgte der Aufbau des Western Blots. Die verwendete Stromstärke in<br />
mA richtete sich nach der Fläche des Gels multipliziert mit 2. Die Blottingdauer betrug 2 h. Zur<br />
Überprüfung, ob die Proteine vom Gel auf die Membran übertragen wurden, wurde das Gel mit einer<br />
Coomassie-Lösung gefärbt.<br />
Immunodetektion<br />
Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C in 5 %iger Magermilchlösung geschwenkt, um<br />
freie Bindungsstellen zu blocken. Anschließend wurden die Membranen an einer rot markierten Bande<br />
bei 72 kDa geschnitten. Auf der oberen Hälfte erfolgte dann der Nachweis des Pgps mit einem<br />
Molekulargewicht von 170 kDa, auf dem unteren Membranabschnitt wurde ß-Aktin (42 kDa)<br />
nachgewiesen.<br />
219
ANHANG<br />
Tabelle 8.3: Verwendete Antikörper und Verdünnungen<br />
Antikörper Bezug Lösungsmittel Verdünnung<br />
Primärantikörper<br />
Anti-Pgp C219<br />
Signet 2 %ige Magermilch 1:200<br />
(Maus, monoklonal)<br />
Anti-β-Aktin<br />
Sigma-Aldrich 2 %ige Magermilch 1:5000<br />
(Kaninchen, monoklonal)<br />
Sekundärantikörper<br />
Kaninchen-anti-Maus-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000<br />
Ziege-anti-Kaninchen-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000<br />
Sowohl Primärantikörper als auch Sekundärantikörper wurden in 2 %iger Magermilchlösung<br />
verdünnt. Die Inkubation mit dem jeweiligen Primärantikörper erfolgte für 1-2 h bei Raumtemperatur<br />
auf einem Schüttler. Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte<br />
entfernt. Die nun folgende einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde bei<br />
Raumtemperatur durchgeführt.<br />
Die Sekundärantikörper waren an das Enzym Meerrettichperoxidase (Horse Radish<br />
Peroxidase, HRP) gekoppelt. Diese setzt Luminol bzw. dessen Derivate in die oxidierte Form um,<br />
wobei eine detektierbare Lumineszenz frei wird. Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper<br />
wurden die Membranen erneut gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem<br />
chemilumineszenten Substrat des SuperSignal ® West Femto Kits. Dazu wurden pro Membranhälfte<br />
etwa 300 µl des chemilumineszenten Substrats verwendet. Die Signale wurden entweder mit dem<br />
Programm Chemidoc XRS System (inklusive Image Lab Software; Bio-Rad Laboratories,<br />
München) aufgezeichnet oder aber durch eine Inkubation der Membranen auf Röntgenfilm für etwa 10<br />
sec bis 30 min fixiert. Nach der Entwicklung und Fixierung des Films wurde dieser gescannt.<br />
Unabhängig von der Aufzeichnung der Signale wurden die Banden anschließend mit der Quantity<br />
One ® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories) quantifiziert. Die statistische Auswertung wurde<br />
mit Prism5 ® (GraphPad, San Diego, CA, USA) vorgenommen. Dabei wurden die für die Pgp-Signale<br />
ermittelten Daten auf die Werte für ß-Aktin normiert.<br />
220
PUBLIKATIONEN<br />
PUBLIKATIONEN<br />
Originalarbeiten<br />
Noack, A., Noack, S., Hoffmann, A., Maalouf, K., Couraud, P.-O., Romero, I.A.,<br />
Weksler, B., Alms, D., Naim, H.Y., Löscher, W., 2012. Drug-induced trafficking of P-<br />
glycoprotein in human brain capillary endothelial cells. PLOS ONE. Eingereicht<br />
Alms, D., Fedrowitz, M., Löscher, W., 2013. Marked differences in the effect of<br />
antiepileptic and cytostatic drugs on the functionality of P-glycoprotein in human and<br />
rat brain capillary endothelial cell lines. Biochem. Pharmacol. Eingereicht<br />
Zitierfähige Kongressbeiträge<br />
D. Neumann, M. Fedrowitz, W. Löscher (2011): „Several antiepileptic drugs induce<br />
the MDT P-glycoprotein in rat and human brain endothelial cell lines“. 65 th Annual<br />
Meeting American Epilepsy Society 2011, Baltimore, Poster 1.243<br />
Alms D., Fedrowitz M., Löscher W. (2012): „Induction of the Multidrug-Transporter P-<br />
glycoprotein by several antiepileptic drugs in rat and human brain endothelial cell<br />
lines“. 8 th FENS Forum of Neuroscience 2012, Barcelona, FENS Abstract, Volume 6,<br />
Poster 034.01<br />
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DANKSAGUNG<br />
DANKSAGUNG<br />
Als erstes danke ich Herrn Prof. Dr. Löscher für die Möglichkeit der<br />
Anfertigung der Doktorarbeit und die fachliche und stete Betreuung während der<br />
Promotionszeit. Bei Frau Prof. Dr. Gerardy-Schahn und Herrn Prof. Dr. Wewetzer<br />
bedanke ich mich für die hilfreichen Kommentare. Ihnen und Herrn Prof. Dr. Fricker<br />
danke ich für die Begutachtung dieser Arbeit.<br />
Frau PD Dr. Maren Fedrowitz danke ich für die stetige Diskussions- und<br />
Hilfsbereitschaft, die methodischen Anleitungen und den persönlichen Einsatz. Frau<br />
Kerstin Römermann, Ph.D., Frau Dr. Bianca Backofen-Wehrhahn und Herrn Dr.<br />
Andreas Noack danke ich für die angenehme Zeit im Zellkultur- und Western-Blot-<br />
Labor. Ich danke allen für die zahlreichen methodischen Tipps und die tatkräftige<br />
Unterstützung, die zum reibungslosen Ablauf und dem Gelingen der Versuche<br />
beitrugen.<br />
Allen anderen Doktoranden der Abteilung danke ich für deren ständige<br />
Hilfsbereitschaft und auch für die amüsante Zeit im und außerhalb des Instituts. Bei<br />
Frau Sonja Bröer und Herrn Dr. Manuel Töpfer bedanke ich mich für die aufregenden<br />
und auch entspannten Momente während der 65. Jahrestagung der Amerikanischen<br />
Epilepsiegesellschaft in Baltimore 2011. Außerdem möchte ich allen Mitarbeitern der<br />
Abteilung Pharmakologie für die angenehme Zeit im Institut danken.<br />
Ich danke der FAZIT-Stiftung für das Promotionsstipendium und der<br />
<strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> für die Abschlussfinanzierung der Doktorarbeit.<br />
Meinen Freunden danke ich für alle aufmunternden Worte und der nötigen<br />
Abwechslung vom Institutsalltag.<br />
Ganz besonders danke ich aber meinen Eltern, meinen Geschwistern, meinen<br />
Schwiegereltern und v.a. meinem Mann Markus für die seelische, moralische und<br />
auch finanzielle Unterstützung und den Zuspruch während dieser Zeit. Sie haben<br />
mich stets ermutigt und mir Rückhalt geboten.<br />
Schließlich möchte ich auch allen hier nicht genannten Personen danken, die<br />
zu dieser Arbeit beigetragen haben.<br />
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