TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug-
Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und
deren Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke
verschiedener Spezies
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Dana Alms (geb. Neumann)
aus Neubrandenburg
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
1. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Löscher
2. Univ.-Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn
Institut für Zelluläre Chemie
Medizinische Hochschule Hannover
3. Univ.-Prof. Dr. Konstantin Wewetzer
Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Löscher
Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Rita Gerardy-Schahn
Univ.-Prof. Dr. rer. physiol. Konstantin Wewetzer
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Gert Fricker
Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2013
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der FAZIT Stiftung gefördert.

Für meine Familie

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... V
1 EINLEITUNG .....................................................................................................................1
2 STAND DER FORSCHUNG ..................................................................................................3
2.1 Epilepsie ...................................................................................................................................... 3
2.1.1 Definition und Bedeutung ................................................................................................................. 3
2.1.2 Temporallappenepilepsie ................................................................................................................. 5
2.1.3 Therapie .............................................................................................................................................. 6
2.2 Pharmakoresistenz .................................................................................................................... 9
2.2.1 Definition und Bedeutung ................................................................................................................. 9
2.2.2 Target-Hypothese ............................................................................................................................ 10
2.2.3 Genvarianz-Hypothese ................................................................................................................... 11
2.2.4 Netzwerk-Hypothese....................................................................................................................... 11
2.2.5 Multidrug-Transporter-Hypothese ................................................................................................. 12
2.3 Bluthirnschranke ..................................................................................................................... 14
2.3.1 Aufbau und Funktion der Barriere ................................................................................................. 14
2.3.2 Selektivität und Substanztransport über die Bluthirnschranke ................................................. 16
2.4 Multidrug-Transporter ............................................................................................................. 17
2.4.1 P-Glykoprotein (Pgp) ...................................................................................................................... 19
2.4.2 Weitere Multidrug-Transporter ...................................................................................................... 21
2.5 Andere Transporter-Familien................................................................................................. 22
2.6 Wechselwirkungen mit Pgp ................................................................................................... 23
2.6.1 Bekannte Pgp-Substrate ................................................................................................................ 26
2.6.2 Bekannte Pgp-Induktoren .............................................................................................................. 27
2.6.3 Bekannte Pgp-Inhibitoren............................................................................................................... 28
2.6.4 Pgp-Trafficking ................................................................................................................................. 29
2.7 In-vivo-Untersuchungen ......................................................................................................... 30
2.8 In-vitro-Untersuchungen ........................................................................................................ 31
2.8.1 Indirekte In-vitro-Modelle ................................................................................................................ 32
2.8.2 Direkte In-vitro-Modelle .................................................................................................................. 32
2.8.3 Primärkulturen.................................................................................................................................. 35
2.8.4 Ko- und Trikulturen .......................................................................................................................... 36
2.8.5 Humanes dynamisches In-vitro-Bluthirnschranken-Modell ....................................................... 37
3 FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT .................................................................... 38
4 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................. 40
4.1 Immortalisierte Zelllinien ........................................................................................................ 40
4.1.1 Humane Hirnkapillarendothelzellen: hCMEC/D3........................................................................ 40
I

4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT ...................................................................................... 41
4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4 ...................................................................................... 42
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte .................................................. 43
4.1.4.1 Tierhaltung ............................................................................................................................ 43
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels .............................................................................. 44
4.1.4.3 Präparation der Astrozyten ................................................................................................. 45
4.2 Kultivierung der Zellen ........................................................................................................... 46
4.2.1 Passagierung ................................................................................................................................... 47
4.2.2 Kryokonservierung .......................................................................................................................... 48
4.2.3 Auftauen der Zellen ......................................................................................................................... 48
4.3 Untersuchung der Funktionalität .......................................................................................... 48
4.3.1 Kumulations-Assay ......................................................................................................................... 51
4.3.2 Transport-Assay .............................................................................................................................. 53
4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot ..................................................................... 59
4.5 Quantifizierung der Substanzen ........................................................................................... 60
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader .................................................. 60
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter ................................................... 60
4.6 Auswertung der Daten und Statistik .................................................................................... 60
5 ERGEBNISSE .................................................................................................................. 62
5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 ....................................................... 62
5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen .................................................................................... 62
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen ................................................................. 63
5.1.3 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Kumulations-Assays ................................................ 65
5.1.3.1 Auswahl des Substrats......................................................................................................... 65
5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität ..................... 68
5.1.3.3 Modulationen der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika ............................................. 74
5.1.3.4 Einfluss des Serums während des Kumulationsversuchs ............................................. 81
5.1.3.5 Hydrocortison und dessen Einfluss auf den Efflux .......................................................... 81
5.1.3.6 Vergleichende Untersuchungen der Pgp-Funktion in Rattenhirnendothelien ............. 84
5.1.3.7 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp ............................................. 87
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays ..................................................... 88
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen......................................................................... 88
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays ................................. 92
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze ................................... 94
5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials ........................................................................................ 96
5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay ........................................................................................ 98
5.1.4.6 Einfluss des Formats der Membraneinlagen ................................................................. 100
II

5.1.4.7 Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit Astrozyten ....................................... 100
5.1.4.8 Überprüfung des Transports durch Pgp ......................................................................... 103
5.1.4.9 Integrität der Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität ................. 106
5.1.4.10 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen ................. 111
5.2 Primärkulturen des Hirnendothels der Ratte (rBCEC) .................................................... 114
5.2.1 Pgp-Expression in rBCEC-Zellen: Western Blot ....................................................................... 114
5.2.2 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Kumulations-Assays ..................................................... 115
5.2.3 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Transport-Assays .......................................................... 119
5.2.3.1 Auswahl des Substrats ..................................................................................................... 119
5.2.3.2 Einfluss des Membranformats und –formats ................................................................. 122
5.2.3.3 Die Kokultivierung der rBCEC-Zellen mit Astrozyten ................................................... 124
5.2.3.4 Geeignete Pgp-Inhibitoren zur Überprüfung des Transports ...................................... 127
5.2.3.5 Integrität primärer Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität ........ 130
5.2.2.6 Zusammenfassung des Transports in primären Hirnendothelien der Ratte ............. 134
6 DISKUSSION ................................................................................................................. 137
6.1 Die humane immortalisierte Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 ......................... 139
6.1.1 Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen ........................................................................................ 139
6.1.2 Die Modulation der Pgp-Funktionalität ...................................................................................... 139
6.1.2.1 Optimierung der Versuchsbedingungen ......................................................................... 140
6.1.2.2 Bekannte Pgp-Induktoren ................................................................................................. 141
6.1.2.3 Antiepileptika ...................................................................................................................... 144
6.1.2.4 Hydrocortison ..................................................................................................................... 148
6.1.2.5 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp ........................................... 149
6.1.3 hCMEC/D3-Zellen als In-vitro-Bluthirnschranken-Modell ........................................................ 150
6.1.3.1 Einflüsse auf den Nachweis von Pgp-spezifischen Transport .................................... 151
6.1.3.2 Die Kokultur mit Astrozyten .............................................................................................. 157
6.1.3.3 Überprüfung eines asymmetrischen Transports ........................................................... 158
6.1.3.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen ................. 159
6.2 Primäre Hirnkapillarendothelien der Ratte (rBCEC) ........................................................ 161
6.2.1 Die Modulation der Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen ......................................................... 162
6.2.2 Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen .............................................................................. 165
6.2.2.1 Versuchsbedingungen ...................................................................................................... 165
6.2.2.2 Die Kokultur mit Astrozyten .............................................................................................. 166
6.2.2.3 Primärkulturen des Hirnkapillarendothels anderer Spezies ........................................ 168
6.2.2.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen ......................... 169
6.3 Schlussbetrachtung .............................................................................................................. 171
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 173
III

SUMMARY ........................................................................................................................... 176
7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 179
8 ANHANG ...................................................................................................................... 206
8.1 Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte ............................................................. 206
8.2 Gewinnung primärer Rattenhirnkapillarendothelien ....................................................... 210
8.3 Gewinnung primärer Astrozyten der Ratte ....................................................................... 212
8.4 Durchführung eines Kumulations-Assays ........................................................................ 213
8.5 Durchführung eines Transport-Assays ............................................................................. 215
8.6 Durchführung eines Western Blots .................................................................................... 218
PUBLIKATIONEN ................................................................................................................... 221
DANKSAGUNG ..................................................................................................................... 223
IV

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AUC
BCRP
BHS
CBZ
CETA
Dex
Dox
DMSO
g
Glu
IBE
ILAE
LEV
MDT
MRP
P
PBS
Pgp
PHB
PHT
Puro
Rif
SEM
TLE
TPM
Vin
VPA
VPM
WHO
ZNS
Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve)
humanes Breast Cancer Resistance Protein
Bluthirnschranke
Carbamazepin
Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assay
(Concentration Equilibrium Transport Assay)
Dexamethason
Doxorubicin
Dimethylsulfoxid
Gravitationsbeschleunigung
Glutamat
Internationales Büro für Epilepsie (International Bureau for Epilepsy)
Internationale Liga gegen Epilepsie (International League Against
Epilepsy)
Levetiracetam
Multidrug-Transporter
Multidrug Resistance-Associated Protein
Passage der Zellen
Phosphat-gepufferte Saline (Phosphate Buffered Saline)
P-Glykoprotein
Phenobarbital
Phenytoin
Puromycin
Rifampicin
Standardfehler (Standard Error of Mean)
Temporallappenepilepsie
Topiramat
Vincristin
Valproat
Verapamil
Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation)
Zentrales Nervensystem
V

EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Epilepsien gehören mit einer Prävalenz von 0,5-1 % in der Bevölkerung zu
den häufigsten chronisch neurologischen Erkrankungen (World Health Organisation
WHO, 2005). Epilepsien sind durch spontane, wiederkehrende Krampfanfälle
charakterisiert (FISHER et al. 2005). Die Standardtherapie bei Epilepsien ist die
Behandlung mit einem oder mehreren antikonvulsiven Medikamenten
(Antiepileptika), die die Anfälle symptomatisch unterdrücken. Etwa ein Drittel der
Patienten spricht nicht auf diese Therapie an. Sie gelten als pharmakoresistent.
Es existieren verschiedene Erklärungsansätze für die Pharmakoresistenz bei
Epilepsien. Eine der favorisierten Hypothesen besagt, dass sogenannte Multidrug-
Transporter (MDT) eine erhöhte Expression in der Bluthirnschranke (BHS)
aufweisen, was zum Auswärtstransport der Antiepileptika aus dem Zielgewebe führt
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). Die physiologische Funktion dieser Efflux-
Transporter ist der Schutz des Gehirns vor potentiell toxischen Substanzen, indem
sie aus dem Gehirn zurück ins Blut transportiert werden. Damit leisten die MDT einen
wichtigen Beitrag zur Aufrechterhaltung der BHS. Die Überexpression des MDT P-
Glykoprotein (Pgp) wurde in Resektionsgeweben pharmakoresistenter
Epilepsiepatienten nachgewiesen (z.B. TISHLER et al. 1995; LIU et al. 2012). Geht
man davon aus, dass Antiepileptika Substrate der MDT sind, würde eine erhöhte
Expression dieser Transporter einen vermehrten Efflux antikonvulsiver Substanzen
aus dem Gehirn bewirken. Folglich könnten keine therapeutisch wirksamen
Konzentrationen im Gehirn erreicht werden (SIDDIQUI et al. 2003) und weitere, teils
auch stärkere epileptische Anfälle wären die Folge. Diverse Untersuchungen konnten
bereits nachweisen, dass Antiepileptika Pgp-Substrate sind (z.B. SCHINKEL et al.
1996; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und 2009).
Die Ursachen der erhöhten Pgp-Expression bei Epilepsien sind bis heute nicht
eindeutig geklärt. Studien in Tiermodellen lassen aber den Schluss zu, dass die
Hochregulierung von Pgp in Gliazellen, Neuronen und Endothelzellen der
Gehirnkapillaren anfallsbedingt ist und dem Schutz der Neurone im Gehirn vor
Glutamat dient (ZHU & LIU 2004; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a; BANKSTAHL et
al. 2008a). Die Glutamat-Konzentration steigt nach epileptischen Anfällen im Gehirn
an. Dadurch können toxische Konzentrationen erreicht werden (DURING &
SPENCER 1993), die zur Neurodegeneration führen können. Die Pgp-Expression
1

EINLEITUNG
wird in gleichem Maß heraufreguliert, sodass Glutamat aus den Zellen transportiert
wird und weitere Erregungen vermieden werden. Mit Hilfe von In-vivo- und In-vitro-
Untersuchungen wurde gezeigt, dass Glutamat ein Pgp-Substrat ist (LIU & LIU
2001).
Aufgrund der möglichen Folgen nicht behandelter Epilepsien wie z.B. eine
verkürzte Lebensdauer (SPERLING et al. 2004) ist die Klärung der Mechanismen der
Pharmakoresistenz von großer Bedeutung. Deshalb sollte im Rahmen dieses
Promotionsprojekts die Rolle von Pgp in der Pharmakoresistenz untersucht werden.
Dazu wurden vergleichende In-vitro-Studien mit immortalisierten Zelllinien aus
Hirnkapillarendothel des Menschen und der Ratte durchgeführt, in denen die
Auswirkungen auf Funktionalität und Expression des Transporters Pgp nach der
Behandlung mit verschiedenen Antiepileptika untersucht wurden. Darüber hinaus
sollte der Transport von Antiepileptika durch Pgp in Hirnendothelzellen humanen
Ursprungs sowie in Primärkulturen verschiedener Spezies untersucht werden.
2

STAND DER FORSCHUNG
2 STAND DER FORSCHUNG
2.1 Epilepsie
2.1.1 Definition und Bedeutung
Der Begriff Epilepsie stammt vom altgriechischen Wort „epilepsis“ = der Anfall,
der Überfall. Laut der Definition der Internationalen Liga gegen Epilepsie (ILAE) und
des Internationalen Büros für Epilepsie (IBE) ist Epilepsie eine Störung des Gehirns,
die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung epileptischer Anfälle sowie durch
neurobiologische, kognitive, psychologische und soziale Konsequenzen dieses
Zustands gekennzeichnet ist (FISHER et al. 2005). Epilepsien sind chronische
Erkrankungen, von denen weltweit etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al.
2006) betroffen sind. Diese stellen die zweithäufigste Gruppe neurologischer
Erkrankungen dar und gehören zu den häufigsten Hirnerkrankungen bei Menschen,
Hunden und Katzen (LÖSCHER 1994). Die Prävalenz beim Menschen liegt bei
0,52 % in Europa, in Entwicklungsländern sogar bei 1,5 % (STRZELCZYK et al.
2008). Laut SANDER (2003) und KWAN et al. (2011) erkranken bis zu 51/100.000
Personen jährlich neu an Epilepsie. Etwa 10 % der Bevölkerung erleiden einmal in
ihrem Leben einen epileptischen Anfall, wobei ein Drittel dieser Menschen
chronische Epilepsien entwickelt (ENGEL 2011).
Die Epilepsiepatienten leiden an Krampfanfällen, die in verschiedene
Schweregrade eingeteilt und einige Sekunden bis zu mehreren Minuten andauern
können. Die Symptome können vielseitig sein, von Konvulsionen und dem Verlust
des Bewusstseins bis hin zu solchen, die nicht immer bemerkt werden, wie z.B.
Erstarren, unwillkürliches Lippenlecken, Kaubewegungen oder Zuckungen der Arme
und Beine. Auslöser für die unwillkürlich auftretenden, epileptischen Anfälle sind
hypersynchronisierte Entladungen ganzer Neuronengruppen, welche durch
Funktionsstörungen des Nervensystems hervorgerufen werden.
Konkrete Ursachen derartiger Funktionsstörungen sind nur in wenigen Fällen
auszumachen. Die Einteilung erfolgt dazu in symptomatische, kryptogene und
idiopathische Epilepsien. Bei den symptomatischen Epilepsien sind die Anfälle auf
andere Erkrankungen wie z.B. Tumore, Infektionen oder Hirntraumata
zurückzuführen. Als kryptogen werden Epilepsien bezeichnet, wenn kein exakter
Grund für die Anfälle zu finden ist (LÖSCHER & BRANDT 2010). Auch bei
3

STAND DER FORSCHUNG
idiopathischen Epilepsien ist der auslösende Faktor unbekannt, es wird aber von
einer erblich bedingten erhöhten Anfallsbereitschaft ausgegangen (ENGEL 2006;
BERG et al. 2010). Bei etwa zwei Drittel der Patienten sind die auslösenden
Faktoren unbekannt bzw. als Zusammenspiel mehrerer Einflüsse anzusehen. Wenn
keine konkrete Diagnose gestellt werden kann, werden die Epilepsien nach ihrem
Anfallstyp oder dem Syndrom eingeteilt. Bekannte Ursachen, die zur Erhöhung der
Anfallsbereitschaft führen können, sind zum einen Erkrankungen des Gehirns selbst,
wie zum Beispiel Hirntumoren, Entzündungen, Blutungen und Traumata
(THEODORE et al. 2008; STEFAN 2009). Zum anderen können Erkrankungen des
Gesamtorganismus, die mit Funktionsstörungen des Gehirns einhergehen, zur
Entwicklung von Epilepsien führen.
Der Ursprung der Anfälle kann auf bestimmte Regionen eingegrenzt werden
oder aber im gesamten Gehirn liegen. Auf Vorschlag der ILAE wird eine Einteilung
nach dem Anfallsmuster der Epilepsien vorgenommen. Dabei werden fokale und
generalisierte Anfälle unterschieden. Bei den letztgenannten ist das gesamte Gehirn
betroffen, ein genauer Ursprung ist nicht auszumachen. Bei fokalen Anfällen nimmt
nur ein Teil des Gehirns (epileptischer Fokus) am Anfallsgeschehen teil. Diese
Anfälle können auf ihre umschriebene Region beschränkt bleiben aber auch
sekundär generalisieren und auf das ganze Gehirn übergreifen. Weitere
Unterteilungen können wie schon erwähnt nach Ursachen, zudem nach Alter bei
Krankheitsbeginn, auslösenden Faktoren und elektroenzephalographischen
Befunden vorgenommen werden.
Bei epileptischen Anfällen kommt es zu einer überschießenden Erregung von
Nervenzellen. Im gesunden Organismus werden die Entstehung und die
Weiterleitung der Aktionspotentiale an einem Neuron durch inhibitorisch wirkende
Transmitter unterbrochen. Die γ-Aminobuttersäure (GABA) ist hierbei der wichtigste
Vertreter. Ein weiterer Neurotransmitter, dem eine große Bedeutung im zentralen
Nervensystem (ZNS) zukommt, ist das Glutamat. Während GABA eine hemmende
Wirkung auf die Weiterleitung von Aktionspotentialen hat, zeigt Glutamat den
umgekehrten Effekt. Es wirkt erregend. Beide Transmitter befinden sich in einem
Gleichgewicht. Verschiebungen in diesem Gleichgewicht können Anfälle auslösen
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005a). Kommt es beispielsweise zu einer Blockade der
GABA-Synthese oder GABA-Rezeptoren, können Krampfanfälle die Folge sein. Ein
weiterer Aspekt, der in Zusammenhang mit der Entstehung von Epilepsien
4

STAND DER FORSCHUNG
(Epileptogenese) diskutiert wird, ist die Veränderung der Eigenschaften
spannungsabhängiger Kanäle (KÖHLING 2008). Zusätzlich gewinnen weitere
Hypothesen zur Epileptogenese wie eine exzitatorische GABAerge Aktivität mit proepileptischer
Wirkung, pH-Verschiebungen (ARAM & LODGE 1987; JABS et al.
2008) sowie Defekte der BHS an Bedeutung.
Epilepsien sind komplexe Erkrankungen, die oftmals mit pathologischen
Verhaltens- und Befindensstörungen, wie beispielsweise Bewusstseinsverlust,
Einschränkungen der Sinneswahrnehmung und Bewegung (durch Verkrampfungen
der Muskulatur) und Störungen mentaler Funktionen einhergehen (GARCÍA-
MORALES et al. 2008). Zudem wurde aufgezeigt, dass eine Verkürzung der
Lebensdauer, auch körperliche Schmerzen, neuropsychologische und psychiatrische
Beeinträchtigungen sowie soziale Defizite (DEVINSKY 2003; SPERLING 2004;
KANNER et al. 2012) als mögliche Folgen unbehandelbarer Epilepsien auftreten
können.
Epilepsien sind kostenintensive Erkrankungen. Kosten, die für Diagnostik,
Therapie und Medikamente, Rehabilitation, Fehlzeiten am Arbeitsplatz,
Arbeitslosigkeit und frühzeitige Berentung anfallen, werden in Deutschland jährlich
auf 7738 € pro Patient geschätzt (STRZELCZYK et al. 2012). Allein die Kosten für
Antiepileptika lagen 2009 bei 1 % der Gesamtkosten für Medikamente in
Deutschland (HAMER et al. 2012). Ein großer Teil der Kosten wird durch den hohen
Anteil pharmakoresistenter Epilepsiepatienten verursacht, weshalb die Aufklärung
der Mechanismen der Pharmakoresistenz und die Entwicklung neuer und besserer
Therapiestrategien von großer Bedeutung ist.
2.1.2 Temporallappenepilepsie
Etwa 25 % der Epilepsiepatienten sind von der Temporallappenepilepsie
(TLE) betroffen. Hierbei gehen die Anfälle vom Schläfenlappen, auch
Temporallappen, des Gehirns aus. TLE kann in jedem Lebensalter auftreten und
stellt aber die häufigste Form der Epilepsien bei Kindern und Jugendlichen dar
(ENGEL 2001). Nahezu alle Betroffenen zeigen fokale Anfälle, die oft mit
Bewusstseinsstörungen einhergehen. Daneben treten auch Anfälle ohne Störungen
des Bewusstseins und sekundär generalisierte tonisch-klonische Anfälle auf. Bei
etwa der Hälfte der Patienten lässt sich eine Ursache nicht nachweisen, seltener
besteht eine familiäre Häufigkeit. Innerhalb des Schläfenlappen gehen die meisten
5

STAND DER FORSCHUNG
Anfälle von mesialen Abschnitten wie z.B. dem Hippocampus aus (BERTRAM 2009).
Hierbei ist das Zusammenspiel des Schläfenlappens mit der Amygdala und dem
Hippocampus wichtig. Diese Teile des Gehirns spielen für Emotionen und die
Ausbildung des Gedächtnisses eine große Rolle (MCDONALD & WHITE 1993),
weshalb es bei TLE-Patienten zu Störungen der Gedächtnisleistung und der Psyche
kommen kann.
Die TLE ist im überwiegenden Maß nur schwer zu behandeln, da die Hälfte
der Betroffenen trotz Therapie nicht anfallsfrei wird. Das Phänomen der
Pharmakoresistenz tritt sehr gehäuft auf, 30-45 % der Patienten reagieren nicht auf
die verabreichten Medikamente (TAVAKOLI et al. 2011). Einzelne Studien gehen von
bis zu 75 % pharmakoresistenten Epilepsiepatienten aus (SPENCER 2002;
SCHMIDT & LÖSCHER 2005).
2.1.3 Therapie
Die Therapie erfolgt ausschließlich symptomatisch, wobei die meist dauerhafte
Gabe von Antiepileptika Mittel der Wahl ist. Diese Medikamente können ihre Wirkung
nur entfalten, wenn sie die BHS passieren. Es handelt sich dabei um relativ kleine (<
500 Da) und lipophile Moleküle, sodass die BHS gut überwunden werden kann. Die
Wirkungsweise erfolgt dabei im Wesentlichen über eine verstärkte synaptische
Inhibition oder aber über die Modulation spannungsabhängiger Ionenkanäle
(ROGAWSKI & LÖSCHER 2004). Das Ziel der Behandlung ist die völlige
Anfallsfreiheit, dabei sollen möglichst wenige oder keine Nebenwirkungen auftreten.
Die dauerhafte Therapie beginnt i.d.R. mit einem einzelnen Antiepileptikum
(Monotherapie), wie zum Beispiel mit Phenytoin, Phenobarbital, Topiramat und
Levetiracetam. Bei einigen Patienten können aber weiterhin Anfälle auftreten.
Deshalb werden häufig weitere Therapeutika eingesetzt, die den jeweiligen
Wirkmechanismus ergänzen und zur Anfallsfreiheit führen sollen. Dabei ist zu
beachten, dass einige Antiepileptika wie z.B. Carbamazepin, Phenobarbital und
Phenytoin potentielle Induktoren des Cytochrom-P 450 -Systems sind. Sie werden
deshalb schneller abgebaut und können nicht ihre volle Wirkung entfalten. Andere
Antiepileptika hingegen können Enzyme, die an der Glucuronidierung beteiligt sind,
hemmen (Valproat). Neuere Antiepileptika wie Topiramat und Levetiracetam zeigen
keine oder nur sehr wenige solcher Wechselwirkungen (SCHMIDT & LÖSCHER
2009).
6

STAND DER FORSCHUNG
Dank der Forschung auf den Gebieten der Genetik, der Transkriptomanalysen
und der Epigenetik konnten viele weitere Angriffspunkte für Antiepileptika gefunden
und bestehende Risiken und Nebenwirkungen minimiert werden (SIMONATO et al.
2012). Dennoch sind auch Medikamente der neuen Generation nicht in der Lage,
therapieresistente Epilepsien zu behandeln oder gar Anfällen vorzubeugen
(LÖSCHER & SCHMIDT 2011).
Trotz intensiver Forschungen und Entwicklungen neuer Antiepileptika bleibt
ein generelles Problem bestehen: der Durchtritt durch die BHS. Trotz des lipophilen
Charakters der Antiepileptika kann der Eintritt ins Gehirn durch MDT wie Pgp oder
Multidrug Resistance-Associated Proteins (MRPs) beschränkt sein. Dies ist von
besonderer Bedeutung, da viele Antiepileptika Substrate für Pgp oder MRPs der
BHS sind (SCHINKEL et al. 1996; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und 2009). Allerdings
ist bisher nicht für alle Antiepileptika bekannt, ob und durch welche Transporter sie
transportiert werden. LUNA-TORTÓS et al. konnten zwar 2008 in In-vitro-Versuchen
für die Antiepileptika Phenytoin, Phenobarbital, Lamotrigin und Levetiracetam einen
Transport durch humanes Pgp nachweisen. Ebenso konnte in In-vivo-
Untersuchungen mit Ratten für Phenytoin nachgewiesen werden, dass es durch Pgp
transportiert wird (POTSCHKA & LÖSCHER 2001), dennoch gibt es bislang keinen
Nachweis über den Transport beim Menschen in vivo.
Liposome oder die Kopplung an Nanopartikel stellen Möglichkeiten dar, den
Efflux durch die Transporter zu umgehen ohne sie zu hemmen und so die BHS zu
überqueren (HUWYLER et al. 2002; FRICKER & MILLER 2004). Erste
Untersuchungen zeigten Erfolge in der Anreicherung von Nanopartikeln und
Liposomen im ZNS, die die BHS durch (rezeptorvermittelte) Endozytose passieren
(BRIGGER et al. 2002; FRICKER & MILLER 2004; VERGONI et al. 2009; VAN
DORPE 2012). Allerdings ist dieses Gebiet für klinische Studien noch nicht
ausreichend erforscht (SILVA 2006; ALAM 2010).
Neueste Forschungen untersuchen die lokale Gabe von Antiepileptika in den
epileptischen Fokus im Gegensatz zur üblichen systemischen Applikation, die
Auswirkungen auf andere physiologische Systeme als das epileptische Gehirn haben
kann. Die Nebenwirkungen sind dabei nicht unerheblich. Praktikabilität und
Verfahrensweise der lokalen Gabe sind noch nicht vollständig untersucht, aber
mittels der lokalen Applikation der Antiepileptika könnte die Bioverfügbarkeit
gesteigert und die Nebenwirkungen verringert werden (BOON et al. 2012).
7

STAND DER FORSCHUNG
Bei der Suche nach neuen Antiepileptika gewinnen sogenannte Biomarker
immer mehr an Bedeutung. Biomarker werden als „objektiv messbare Charakteristika
eines normalen oder pathologischen biologischen Prozesses oder einer biologischen
Antwort auf eine therapeutische Invention“ definiert (Biomarkers Definitions Working
Group 2001). Biomarker können eine Möglichkeit bieten, Krankheiten festzustellen
oder deren Verlauf zu bestimmen (ENGEL 2011). Bei Epilepsien können Biomarker
auf mögliche Ziele neuer Therapien hinweisen und bei der Erforschung neuer
Antiepileptika abklären, ob und in welchem Ausmaß diese Einfluss auf relevante
biologische und erkrankungsspezifische Prozesse haben (SIMONATO et al. 2012).
Ebenso könnte es möglich sein, anhand von Untersuchungen der Expressionsprofile
bestimmter Gene und ihrer Proteinprodukte Biomarker für die Epileptogenese zu
entwickeln (PITKÄNEN & LUKASIUK 2011).
Sofern ein Fokus bei einer pharmakoresistenten Epilepsie vorhanden ist, kann
die chirurgische Entfernung dieses Fokus eine Alternative zur medikamentösen
Therapie darstellen (FOLDVARY et al. 2001). Dabei wird auf die Erhaltung wichtigen
funktionellen Gewebes geachtet. Derzeit gibt es Untersuchungen zur sogenannten
Radiochirurgie, mit der noch gezielter selektiv epileptisches Gewebe entfernt werden
kann (BOON et al. 2012). Weitere chirurgische Möglichkeiten stellen die Stimulation
des Nervus vagus oder die Tiefenhirnstimulation dar (HOLMES et al. 2004; BOON et
al. 2007a; ZHONG et al. 2011; VONCK et al. 2012). Der genaue Hintergrund der
Stimulation des Nervus vagus, dessen afferente Fasern auch zum Herz-Kreislauf-
Zentrum laufen, ist noch nicht endgültig geklärt. Die Tiefenhirnstimulation ist seit
2012 als therapeutische Maßnahme zugelassen, allerdings ist die Zahl der Patienten,
die auf diese Therapie reagieren, gering. Eine vollständige Heilung wird bislang
weder durch die Resektion noch durch die Stimulation erzielt, da viele Patienten
anschließend weiter mit Antiepileptika behandelt werden müssen (LÖSCHER &
SCHMIDT 2006a; BOON et al. 2007b; ZHONG et al. 2011; VONCK et al. 2012; WU
& SHARAN 2012).
8

STAND DER FORSCHUNG
2.2 Pharmakoresistenz
2.2.1 Definition und Bedeutung
Etwa 30-40 % der Epilepsiepatienten reagieren nicht oder nur unzureichend
auf die medikamentöse Behandlung und werden als pharmakoresistent eingestuft
(KWAN et al. 2011). Eine einheitliche allgemein anerkannte Definition des Begriffs
existierte lange nicht. Pharmakoresistenz wurde üblicherweise als ausbleibende
Anfallsfreiheit oder weniger als 50 %ige Anfallsreduktion trotz angemessener
Auswahl und einer ausreichend langen Applikation von mindestens zwei
Antiepileptika mit verschiedenen Wirkmechanismen in maximal tolerierbaren Dosen
beschrieben (REGESTA & TANGANELLI 1999; KWAN & BRODIE 2000; KWAN &
BRODIE 2010).
Die Zahl der pharmakoresistenten Epilepsiepatienten schwankt in den
einzelnen Untersuchungen, weil der Begriff Pharmakoresistenz lange nicht einheitlich
definiert wurde und in den Studien abweichende Kriterien für die Definition der
Pharmakoresistenz berücksichtigt wurden (SCHMIDT & LÖSCHER 2005; PATI &
ALEXOPOULOS 2010). Aus diesem Grund gründete die ILAE eine Projektgruppe,
um eine einheitliche international gültige Definition der Pharmakoresistenz zu
schaffen. Diese definierte den Begriff wie folgt: „adäquate Behandlungsversuche mit
zwei tolerierten und angemessen ausgewählten sowie angewandten Antiepileptika-
Behandlungsprotokollen, in Monotherapie oder in Kombination, führen zu keiner
anhaltenden Anfallsfreiheit“ (KWAN et al. 2010). Die Lebensqualität
pharmakoresistenter Epilepsiepatienten ist aufgrund der weiterhin auftretenden
Anfälle besonders durch mögliche Verletzungen bis hin zu einem frühzeitigen Tod
und psychosoziale Störungen eingeschränkt (KWAN et al. 2011).
Pharmakoresistenz kann auch durch eine Toleranz gegenüber bestimmten
Therapeutika verursacht werden (LÖSCHER & SCHMIDT 2006b), wobei Toleranz
als Adaptation des Körpers und der daraus folgenden verringerten Wirksamkeit eines
Medikaments nach mehrmaliger Gabe beschrieben wird (KOELLA 1986). Eine
bestehende Toleranz kann i.d.R. umgangen werden, wenn Medikamente mit einem
anderen Wirkungsmechanismus verabreicht werden.
Für die Erklärung der Pharmakoresistenz existieren viele Hypothesen (REMY
& BECK 2006), denen verschiedene Mechanismen zugrunde gelegt werden. Aus
9

STAND DER FORSCHUNG
diesem Grund beschrieb SISODIYA (2003) ähnlich der Koch`schen Postulate, die die
Bedeutung von Bakterien bei Infektionserkrankungen beschrieben (KOCH 1884;
FALKOW 1988), vier Kriterien, welche für die Akzeptanz einer Hypothese als
Ursache für Pharmakoresistenz bei Epilepsien erfüllt sein müssen. Der Mechanismus
muss
1) in epilepsie-assoziiertem Gewebe nachweisbar sein,
2) zur Pharmakoresistenz führen,
3) an der Resistenz gegenüber Medikamenten involviert sein und
4) bei der Inhibition zur Überwindung der Pharmakoresistenz führen.
Diese Kriterien lassen sich in einem gewissen Maß auch auf andere
Hirnerkrankungen wie z.B. Tumoren, die mit Pharmakoresistenz assoziiert werden,
anwenden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
Einzelne Hintergründe der Pharmakoresistenz sind nur unzureichend erforscht
und werden kontrovers diskutiert. Allerdings besteht die Annahme, dass nicht nur ein
einzelner Mechanismus verantwortlich ist, sondern dass Pharmakoresistenz bei
Epilepsiepatienten als Zusammenspiel mehrerer Faktoren zu erklären ist (REGESTA
& TANGANELLI 1999; KWAN & BRODIE 2000; SCHMIDT & LÖSCHER 2009).
2.2.2 Target-Hypothese
Die Target-Hypothese nimmt an, dass genetisch bedingte oder erworbene
Veränderungen der Zielstrukturen der Antiepileptika zu unzureichenden
pharmakodynamischen Effekten führen (SCHMIDT & LÖSCHER 2005; LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b; REMY & BECK 2006). Studien an Tiermodellen und an
Hirngeweben pharmakoresistenter Epilepsiepatienten brachten erste Hinweise.
Antiepileptika haben verschiedene Zielstrukturen, über die die Wirkung
vermittelt wird (ROGAWSKI & LÖSCHER 2004). GABA A -Rezeptoren stellen einen
Angriffspunkt für Antiepileptika wie Phenobarbital dar (ROGAWSKI & LÖSCHER
2004). GABA als ein inhibitorischer Neurotransmitter aktiviert diese Rezeptoren und
führt zu einem Einstrom von Chlorid-Ionen. Dadurch wird eine Hyperpolarisation
ausgelöst, die in einer verminderten Erregbarkeit mündet. Ein Status epilepticus kann
zu Veränderungen der Untereinheiten des GABA A -Rezeptors führen (GOODKIN et
al. 2008). In einem Tiermodell der TLE zeigten BETHMANN et al. (2008), dass
sowohl strukturelle als auch funktionelle Veränderungen dieses Rezeptors mit
10

STAND DER FORSCHUNG
Pharmakoresistenz in Zusammenhang stehen. Hierbei kam es nur zu ungenügenden
Effekten von Phenobarbital.
Spannungsabhängige Natrium-Kanäle, die maßgeblich an der Entstehung des
Aktionspotentials beteiligt sind, stellen ein weiteres Ziel der Antiepileptika dar. Dabei
sind v.a. Carbamazepin, Lamotrigin und Phenytoin zu nennen (ROGAWSKI &
LÖSCHER 2004), die auf diese Ionenkanäle einwirken. Bezüglich der Toleranz bzw.
Pharmakoresistenz wurde eine geringere Sensitivität der Na + -Kanäle für
Carbamazepin in resezierten Geweben epileptischer Patienten gezeigt (REMY et al.
2003; JANDOVA et al. 2006).
2.2.3 Genvarianz-Hypothese
Genetische Polymorphismen werden nicht nur mit Resistenzen und
Therapieversagen bei Antikonvulsiva, Zytostatika und Antibiotika assoziiert
(SCHWAB et al. 2003a; SIDDIQUI et al. 2003). Zusammen mit Wechselwirkungen
von Medikamenten und Überexpression der MDT gelten sie als Hauptgrund für
Therapieversagen, individuelle Variabilität und Ausmaß und Häufigkeit der
Nebenwirkungen (HO & KIM 2005; KERB 2006).
Die Genvarianz-Hypothese untersucht den Zusammenhang zwischen
genetischen Polymorphismen, beispielsweise des Efflux-Transporters Pgp, und der
verminderten Wirksamkeit der Antiepileptika. Solche Veränderungen könnten
ursächlich dafür sein, dass zwei Patienten bei gleicher Epilepsieerkrankung
unterschiedlich auf die gleiche Therapie reagieren (SIDDIQUI et al. 2003; LÖSCHER
& POTSCHKA 2005b; HUNG et al. 2008). Allerdings werden Polymorphismen im
ABCB1-Gen für Pgp im Zusammenhang mit Pharmakoresistenz bei
Epilepsiepatienten kontrovers diskutiert (BOURNISSEN et al. 2009).
2.2.4 Netzwerk-Hypothese
Zusätzlich zu den bereits genannten Erklärungen zur Pharmakoresistenz wird
die Netzwerk-Hypothese diskutiert. Diese geht von unterschiedlichen strukturellen
und funktionellen Netzwerken bei pharmakosensitiven und –resistenten Patienten
aus, die durch Krankheit oder eine veränderte Genetik bedingt sind (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b; SCHMIDT & LÖSCHER 2009). Beispielsweise zeigten mehrere
Untersuchungen in einem Epilepsiemodell der Ratte, dass Veränderungen des
11

STAND DER FORSCHUNG
Netzwerks in den Basalganglien auftreten (FEDROWITZ et al. 2002; GERNERT et
al. 2004; NOLTE et al. 2006).
2.2.5 Multidrug-Transporter-Hypothese
Diese Hypothese geht von einer Überexpression sogenannter MDT in der
BHS aus und stellt die bisher am besten untersuchte Hypothese der
Pharmakoresistenz dar (SCHMIDT & LÖSCHER 2009). MDT wie Pgp oder MRPs
sorgen für den Abtransport von Substanzen aus dem Gehirn zurück ins Blut. Dieser
Effekt ist bei potentiell gefährlichen Stoffen durchaus erwünscht, doch kann er bei
Überexpression dieser Proteine zu einem erhöhten Efflux der Medikamente führen
und folglich zu einer verringerten Konzentration und Wirkung im Zielgewebe
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
Erste Hinweise auf den Zusammenhang zwischen Pharmakoresistenz und der
Überexpression des MDT Pgp lieferten Arbeiten von TISHLER et al. (1995) an
Hirngeweben pharmakoresistenter Epilepsiepatienten. Eine erhöhte Expression
dieses Efflux-Transporters wurde durch andere Forschergruppen bestätigt
(DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al. 2003). Zusätzlich wurde in
Kapillarendothelien und Astrozyten eine Überexpression der Transporter MRP1 und
MRP2 nachgewiesen (LAZAROWSKI et al. 2007). VOLK & LÖSCHER (2005)
zeigten zudem auch in tierexperimentellen Untersuchungen, dass Ratten, die
gegenüber Antiepileptika resistent waren, eine Überexpression von Pgp aufwiesen.
Abbildung 2.1 stellt die Überexpression von MDT in epileptischem
Gehirngewebe dar. Epileptische Anfälle scheinen derartige Überexpressionen zu
verursachen. Studien mit verschiedenen Tiermodellen der TLE zeigten eine Pgp-
Überexpression in Hirnkapillarendothelzellen, Astrozyten und Neuronen (SISODIYA
2003; VOLK et al. 2004a; VOLK et al. 2005; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a). Diese
Untersuchungen unterstützen die Annahme, dass hohe Anfallsfrequenzen zu
Therapiebeginn mit dem Auftreten pharmakoresistenter Epilepsien korrelieren
(REGESTA & TANGANELLI 1999).
12

STAND DER FORSCHUNG
Abbildung 2.1: Physiologische Expression von MDT an der BHS (A) und Überexpression von
MDT in epileptischem Hirngewebe (B), nach LÖSCHER & POTSCHKA (2005a). Physiologisch
werden MDT fast ausschließlich an der luminalen Seite der Gehirnkapillarendothelien
exprimiert. Moleküle und Substanzen gelangen durch Diffusion vom Blut ins Gehirn. Im
epileptischen Fokus werden die MDT in der luminalen Membran der Gehirnkapillarendothelien
hochreguliert. Zudem werden sie in Gliazellen und Neuronen exprimiert. Aufgrund der
Hochregulation gelangen Wirkstoffe nicht in ausreichendem Maß in das Gehirngewebe.
Die Kriterien, die laut SISODIYA (2003) für die Bestätigung einer Hypothese
zur Pharmakoresistenz erfüllt sein müssen, werden von der MDT-Hypothese
bezüglich Pgp in Nagermodellen für Epilepsien erfüllt (SCHMIDT & LÖSCHER
2009).
1) Die Pgp-Expression ist aufgrund der Anfälle in Endothelzellen der
Gehirnkapillaren, Astrozyten und Neurone erhöht (RIZZI et al. 2002; SEEGERS et al.
2002; VOLK et al. 2004a; VOLK et al. 2005; BANKSTAHL & LÖSCHER 2008).
2) Der Vergleich pharmokosensitiver und –resistenter Ratten zeigte eine
erhöhte Pgp-Expression in den pharmakoresistenten Tieren (VOLK & LÖSCHER
2005).
3) Diese erhöhte Pgp-Expression steht in Zusammenhang mit einer
niedrigeren Konzentration der Antiepileptika im Gehirn pharmakoresistenter Tiere
(RIZZI et al. 2002; VAN VLIET et al. 2007).
13

STAND DER FORSCHUNG
4) Die Gabe des selektiven Pgp-Inhibitors Tariquidar führte zur Überwindung
der Resistenz gegenüber der Antiepileptika Phenobarbital und Phenytoin (BRANDT
et al. 2006; VAN VLIET et al. 2006).
Nach diesen Studien könnte Pgp eine große Rolle für pharmakoresistente
Epilepsien in Tiermodellen spielen. Allerdings ist das Ausmaß, mit dem sich diese
Kriterien auf humane Epilepsiepatienten übertragen lassen, noch unklar (LÖSCHER
& SILLS 2007). In humanen Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie wurde
bereits eine Überexpression von Pgp in reseziertem epileptischem Gewebe
nachgewiesen (TISHLER et al. 1995; DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al.
2004; MARCHI et al. 2004). Dabei ist nicht bekannt, ob diese Überexpression ein
Epiphänomen ist, welches durch epileptische Anfälle verursacht wird, oder ob ein
kausaler Zusammenhang mit der Antiepileptika-Resistenz besteht (LÖSCHER et al.
2011).
Es ist nicht sicher, ob mit der Administration spezifischer MDT-Inhibitoren die
Pharmakoresistenz beim Menschen umgangen werden kann. Zudem gibt es zurzeit
noch keine genauen Hinweise, ob bzw. welche weiteren Antiepileptika Substrate der
MDT in der BHS darstellen und demzufolge zurück ins Blut transportiert werden
(LÖSCHER et al. 2011).
2.3 Bluthirnschranke
2.3.1 Aufbau und Funktion der Barriere
Die Entdeckung der BHS geht auf Untersuchungen von Paul Ehrlich zurück.
Ehrlich stellte fest, dass ins Blut injizierte Farbstoffe sich nicht im Gehirn anreicherten
(EHRLICH 1885). Weitere Versuche ergaben, dass Farbstoffe, die direkt ins ZNS
appliziert wurden, auch nur dort verblieben und sich nicht im restlichen Körper
ausbreiteten (GOLDMANN 1913).
Die BHS bildet eine physiologische Barriere zwischen dem Blutkreislauf und
dem ZNS. Sie ist eine selektiv durchlässige Schranke, durch die ein kontrollierter
Stoffaustausch stattfinden kann. Mittels Diffusion und Transportprozessen wird über
diese Barriere die Nährstoffversorgung des Gehirns sichergestellt. Gleichzeitig wird
durch diesen hochselektiven Filter das innere Milieu des Hirns aufrechterhalten und
vor potentiell gefährlichen Substanzen geschützt. Die BHS trägt damit zur normalen
Funktion des ZNS bei (BALLABH et al. 2004).
14

STAND DER FORSCHUNG
Diese Schranke besteht aus Endothelzellen, die die Hirnkapillaren auskleiden
und deren Interzellularräume im Gegensatz zu anderen Stellen im Organismus durch
sogenannte Tight junctions eng miteinander verknüpft sind (KANDEL et al. 2000;
LÖSCHER & POTSCHKA 2002; ABBOTT et al. 2010). Die Barriere resultiert aus den
Eigenschaften der Endothelzellen, den interzellulären Verknüpfungen und fast
vollständig fehlenden Transport durch Vesikel (KANDEL et al. 2000). Abbildung 2.2
zeigt, dass die Endothelzellen der BHS zusätzlich von einer perivaskulären
Gliazellschicht, Astrozyten-Endfüßen, Perizyten und einer Basalmembran umgeben
sind, die zur Undurchlässigkeit von Bakterien sowie großer und hydrophiler Stoffe
beitragen.
Abbildung 2.2: Vergleich einer Kapillare (A) mit einer Hirnkapillare (B), nach DEEKEN &
LÖSCHER 2007. Aufgrund einer weniger dichten Anordnung der Zellen in peripheren
Kapillaren ist ein leichterer Durchtritt für Substanzen möglich. An der BHS tragen zusätzlich
Tight junctions zwischen den Endothelzellen, die Basalmembran, sowie Astrozyten und
Perizyten zur Dichtigkeit dieser Barriere bei. Aus diesem Grund können sowohl Fremdstoffe
als auch Medikamente nicht ohne Weiteres ins Gehirn gelangen.
Die Astrozyten stehen in engem Kontakt mit den Kapillarendothelzellen der
BHS. Astrozyten-Endfüße liegen eng von der Gewebeseite bis an die Hirnkapillaren
an. Astrozyten sind durch die Sekretion bestimmter Faktoren an der Ausbildung der
spezifischen Eigenschaften der BHS beteiligt. Beispielsweise scheinen diese
Gliazellen Einfluss auf die Ausbildung von Tight junctions (DEHOUCK et al. 1990;
15

STAND DER FORSCHUNG
WOLBURG et al. 1994; CECCHELLI et al. 1999) und die Expression von MDT zu
haben (GAILLARD et al. 2000; HAWKINS et al. 2002; WILLIS et al. 2007).
Perizyten lagern sich nur teilweise um die Endothelzellen in der BHS, teilen
sich aber die gleiche Basalmembran mit den Endothelzellen. Sie tragen zur Struktur
der BHS bei und sind in der Lage, den Durchmesser der Blutgefäße als Reaktion auf
verschiedene Stimuli anzupassen (THOMAS 1999; HASELOFF et al. 2005;
PEPPIATT et al. 2006). Zudem scheinen auch sie an der Ausbildung der Tight
junctions beteiligt zu sein (DOHGU et al. 2005).
Die Tight junctions zwischen den Endothelzellen unterdrücken die
parazelluläre Diffusion nahezu vollständig, was in einem Widerstand
(transendothelial resistance) der Gefäßwand resultiert, der bei etwa 5-10 Ω*cm 2 liegt.
Tight junctions sind zwischen allen Endothelzellen zu finden, aber nur an den
Kapillargefäßen der BHS in vivo führt dies zu einem hohen Widerstand von bis zu
2000 Ω*cm 2 (LATERRA & GOLDSTEIN 2000). In vitro liegen die Widerstände
humaner Hirnkapillarendothelien je nach Präparation zwischen 20 und 1400 Ω*cm 2
(GRANT et al. 1998).
Es bleibt also festzuhalten, dass diese Barriere aus der Selektivität durch:
1) Tight junctions zwischen den Endothelzellen der Gehirnkapillaren,
2) Transporterproteine für den kontrollierten transzellulären Eintritt der
Moleküle ins Gehirn und
3) Enzyme, die Substanzen vor ihrem Durchtritt verändern oder
degradieren (PETERSON 2012), resultiert.
Ob auch Neurone eine Rolle bei der Modulation der BHS spielen, ist unklar
und wird noch diskutiert (ROUX & COURAUD, 2005; LIM et al. 2007). LIM et al.
(2007) fanden aber heraus, dass neuronale Vorläuferzellen die Pgp-Expression in
vitro beeinflussen können.
2.3.2 Selektivität und Substanztransport über die Bluthirnschranke
Es existieren zwei grundsätzliche Wege, über die Substanzen die Barriere
überwinden und ins Gehirn gelangen können (ABBOTT et al. 2006), erstens direkt
durch die Zellen (transzellulär) oder zweitens zwischen den Zellen hindurch
(parazellulär). Der parazelluläre Weg kommt v.a. für wasserlösliche Stoffe in
Betracht. Da aber die anatomischen Gegebenheiten wie Tight junctions den
parazellulären Weg weitestgehend versperren, spielt dieser für die BHS kaum eine
16

STAND DER FORSCHUNG
Rolle. Aus diesem Grund müssen viele Stoffe, die für die Funktion notwendig sind,
aktiv ins Gehirn transportiert werden. Zum Beispiel gelangen hydrophile Substanzen,
die nicht von Trägermolekülen transportiert werden, über rezeptorvermittelte
Transzytose (z.B. Insulin) ins Gehirn (Abbott et al. 2006). Weitere Wege stellen der
konzentrationsabhängige Transport, z.B. für Glukose mittels GLUT1 (TSUJI & TAMAI
1999), und der Transport über spezifische Proteine dar. Dieser aktive Transport steht
allerdings v.a. körpereigenen Stoffen, Nährstoffen und Abbauprodukten zur
Verfügung (KANDEL et al. 2000; ABBOTT et al. 2006). Körperfremde Stoffe
(Xenobiotika) werden nur in geringem Maß auf diese Weise transportiert. Allerdings
gelangen so auch Arzneimittel, die aufgrund ihres hydrophilen Charakters die BHS
nicht passieren würden, wie z.B. einige Chemotherapeutika, Immunsuppressiva (z.B.
Cyclosporin A) und L-DOPA ins Gehirn (TSUJI & TAMAI 1999).
Demnach müssten lipophile Stoffe, zu denen auch toxische Substanzen
gehören, relativ einfach ins Gehirn gelangen. Allerdings wird die Passage dieser
Stoffe durch spezifische Efflux-Transporter eingeschränkt. Aufgrund der Polarität der
Hirnendothelzellen sind Transporter entweder an der luminalen Seite (dem Blut
zugewandt) oder an der abluminalen Seite (dem Gehirn zugewandt) der Zellen
exprimiert (Abbildung 2.3). Die Expression auf der luminalen Seite ermöglicht den
Transportern, lipophile Substanzen zurück ins Blut zu befördern (PARDRIDGE
2003).
Es können also kleine (< 500 Da), lipidlösliche, ungeladene Stoffe (z. B.
Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid, Hormone) die BHS gut passieren, vorzugsweise über
transzelluläre Diffusion (PARDRIDGE 2003). Auf diese Weise erreichen die meisten
zentralwirksamen Medikamente das Gehirn. Antiepileptika sind hoch permeable
Substanzen, weshalb die Diffusion dieser Substanzen über die BHS eine wichtige
Rolle spielt.
2.4 Multidrug-Transporter
Bei MDT handelt es sich um Membranproteine, die u.a. in Leber, Darm und
Niere lokalisiert sind. Dort haben sie Einfluss auf die Kumulation und den Ausstrom
von Substanzen. Des Weiteren werden diese Proteine in der BHS, in den Hoden und
in der Plazentaschranke exprimiert, wo sie den Einstrom vieler Substanzen limitieren
(SCHINKEL & JONKER 2003) und demzufolge eine Schutzfunktion einnehmen
(SCHERRMANN 2005; GEDEON et al. 2006; ENOKIZONO et al. 2008).
17

STAND DER FORSCHUNG
MDT gehören zur Superfamilie der Adenosintriphosphat-(ATP) Binding
Cassette- (ABC-) Transporter. Diese Superfamilie lässt sich in sieben Subfamilien
einteilen, die mit den Buchstaben „A“ bis „G“ gekennzeichnet sind. Gemeinsames
Charakteristikum dieser Proteinfamilie ist die stark konservierte ATP-Bindedomäne
(HIGGINS 1995), die für die Bindung und Hydrolyse von ATP verantwortlich ist. ABC-
Transporter bestehen aus zwei hydrophoben transmembranalen Domänen und zwei
hydrophilen ATP-bindenden Domänen (DEAN et al. 2001; REES et al. 2009). Aus
der Abspaltung einer Phosphatgruppe vom ATP-Molekül wird die Energie für
Konformationsänderungen der Transmembrandomäne gewonnen. Aufgrund dessen
können Stoffe aktiv auch entgegen eines Konzentrationsgefälles durch Membranen
transportiert werden (HOLLENSTEIN et al. 2007).
Abbildung 2.3: Expression und Lokalisation der MDT an der BHS, aus LÖSCHER & POTSCHKA
2005a. Die meisten Transporter, darunter auch das bekannte Pgp, befinden sich an der
blutzugewandten Seite der Endothelzellen. Auf diese Weise können Fremdstoffe schnell zurück
ins Blut transportiert werden. Die Polarität und Verteilung der MDT an der BHS scheint
unterschiedlich stark ausgeprägt zu sein. Des Weiteren existieren mehr Transporter an der
BHS als hier dargestellt (MERTSCH & MAAS 2002), von denen aber die Rolle im
Substanztransport unklar ist.
Neben der physikalischen Barriere durch die Anordnung der Endothelzellen in
der BHS bieten die Transportproteine die Möglichkeit, kleine lipophile und damit
membrangängige Moleküle wieder aus dem Gehirn zu transportieren. Was bei
schädlichen Substanzen durchaus sehr nützlich ist, kann bei Medikamenten zu
18

STAND DER FORSCHUNG
erniedrigten und damit nicht wirksamen Konzentrationen am Wirkungsort Gehirn
führen.
Viele MDT wie das Pgp gehören zur Familie der ABC-Transporter. Sie sind
u.a. in der BHS zu finden. Dort weisen sie oft nur eine geringe Substratspezifität auf.
Zudem zeigen die MDT ein weit überlappendes Substratspektrum (SHAPIRO & LING
1995), wie z.B. bei Pgp und MRP2, was zur Annahme führt, dass beide Transporter
koreguliert sind (FROMM et al. 2000; JEDLITSCHKY et al. 2006).
2.4.1 P-Glykoprotein (Pgp)
Bei diesem phosphorylierten Glykoprotein handelt es sich um ein gut
untersuchtes Membranprotein, welches zur Subfamilie ABCB der ABC-Transporter
gehört. Es wurde erstmalig in Hamster-Ovarialzellen, die gegenüber dem
Zytostatikum Colchicin unempfindlich waren, entdeckt (JULIANO & LING 1976). Es
ist das Produkt des ABCB1- oder MDR1-Gens (CHEN et al. 1986). Pgp besteht aus
1280 Aminosäuren und weist in seiner glykosylierten und phosphorylierten Form ein
Molekulargewicht von 170 kDa auf. Pgp ist in die Membran eingebettet, wobei sich
die ATP-Bindedomäne außerhalb der Zellmembran befindet. Die Substanzbindung
erfolgt gleichzeitig mit der Bindung und Hydrolyse von ATP. Durch die aus der
Abspaltung einer Phosphatgruppe gewonnene Energie erfolgt eine
Konformationsänderung des Transporterproteins, und das Substrat wird transportiert
(NERVI et al. 2010). Pgp besteht aus zwei sich wiederholenden Tandems aus
Transmembran- und hydrophoben N-terminalen Domänen (LOO & CLARKE 1995;
KAST et al. 1996). LOO & CLARKE (1999) wiesen zudem nach, dass lediglich die
Transmembrandomäne dieses Transporters für die Substratbindung verantwortlich
ist, und die N-terminalen Domänen auch für den Transport zur Membran keine Rolle
spielen.
Pgp ist in Organen mit exkretorischer Funktion wie Leber, Darm und Niere zu
finden (THIEBAUT et al. 1987; CORDON-CARDO et al. 1989; Abbildung 2.4).
Zusätzlich ist es in der BHS exprimiert (SCHINKEL 1999). In allen Lokalisationen ist
es an der Absorption, Verteilung und Exkretion von Substanzen beteiligt
(MARZOLINI et al. 2004a). Die physiologische Pgp-Expression scheint deshalb
einen wichtigen Schutzmechanismus gegen potentiell toxische Stoffe darzustellen
(FROMM 2004). In der Barriere zwischen ZNS und Blut trägt es wesentlich zur
Funktion der BHS bei (SCHINKEL 1999).
19

STAND DER FORSCHUNG
Abbildung 2.4: Schema der Pgp-Expression im menschlichen Körper, nach MARZOLINI et al.
(2004a). Pgp kommt sowohl in exkretorischen Organen wie Leber, Darm und Nieren als auch in
den wichtigen Barrieren zum Gehirn, Hoden und zur Plazenta vor.
Mit der Expression an der luminalen Seite des Endothels, also der zum Blut
zugewandten Seite, ist Pgp am Schutz des Gehirns vor körperfremden Stoffen
beteiligt (SCHERRMANN 2005). Gleichzeitig kann auch eine Vielzahl an
Medikamenten wieder ins Blut zurücktransportiert werden, sodass effektive
therapeutische Konzentrationen nicht erreicht werden. Die Schutzfunktion dieses
Effluxproteins konnte in Pgp-defizienten bzw. Pgp-Knockout-Mäusen nachgewiesen
werden, die nach Verabreichung verschiedener Substanzen vermehrt neurotoxische
und fetusschädigende Effekte zeigten (SCHINKEL et al. 1994 und 1995; LANKAS et
al. 1998; SCHINKEL 1999; SMIT et al. 1999).
Pgp ist in der Lage, viele unterschiedliche Substanzen zu transportieren.
Beispielsweise zählen Chemotherapeutika, Lipide, Steroide, Peptide, Xenobiotika,
Immunsuppressiva, Glukokortikoide, Humanes Immundefizienz Virus- (HIV-)
Protease-Inhibitoren und Antiepileptika zu den Substraten dieses MDT (AMBUDKAR
& GOTTESMAN 1998; DEAN et al. 2001; SCHINKEL & JONKER 2003; SAKAEDA
et al. 2003; LUNA-TORTÓS et al. 2008). Mit diesem breiten Substratspektrum ist
20

STAND DER FORSCHUNG
Pgp an mehreren Prozessen beteiligt, wie z.B. die Regulation der Verteilung und
Bioverfügbarkeit von Substanzen, Efflux von Metaboliten in Urin, Galle und Darm und
Transport von Stoffen über die BHS (TANIGAWARA 2000). Pgp scheint zudem
zusammen mit anderen MDT eine weitere physiologische Rolle zu spielen: Es
schützt die Astrozyten und andere Zelltypen vor der Apoptose (PALLIS et al. 2002;
GENNUSO et al. 2004).
Pgp sowie auch andere MDT werden mit der Pharmakoresistenz bei einigen
Erkrankungen wie Epilepsien in Verbindung gebracht (SIDDIQUI et al. 2003). Ob die
Überexpression von MDT, die als Ursache für die Pharmakoresistenz diskutiert wird,
durch die Krankheit selbst oder auch durch die Antiepileptika-Therapie hervorgerufen
wird, ist unklar.
2.4.2 Weitere Multidrug-Transporter
Weitere wichtige ABC-Transporter, die ebenfalls mit Pharmakoresistenz in
Verbindung gebracht werden, sind die MRPs und das Breast Cancer Resistance
Protein (BCRP). Diese sind ebenso wie das Pgp in Membranen eingelagert, wobei
die Expression an der luminalen Seite der Hirnendothelzellen (SUGIYAMA et al.
2003; NIES et al. 2004; ZHANG et al. 2004) auch bei diesen Effluxproteinen auf eine
Schutzfunktion schließen lässt.
Die erste Beschreibung des BCRPs erfolgte 1998 als überexprimiertes Protein in
Brustkrebszellen (ALLIKMETS et al. 1998; DOYLE et al. 1998). Es gehört zur
Subfamilie der ABCG, dessen Mitglieder Halbtransporter sind (DOYLE & ROSS
2003). BCRP ist ein Homodimer, wobei Disulfidbrücken den Zusammenhalt
gewährleisten und nur bei der Anlagerung zweier Dimere ein Transport möglich ist.
Dieses Protein transportiert in der BHS u.a. Antibiotika, Calciumkanalblocker und
Chemotherapeutika (ROBEY et al. 2009). Es zeigt dabei ein leicht überlappendes
Substratspektrum mit Pgp (DOYLE & ROSS 2003; LÖSCHER & POTSCHKA
2005a). Unklar ist, ob Antiepileptika durch BCRP transportiert werden. CERVENY et
al. (2006) konnten allerdings in BCRP-überexprimierenden MDCK II-Zellen keinen
Transport der Antiepileptika Phenobarbital, Phenytoin, Ethosuximid, Primidon,
Valproat, Carbamazepin, Clonazepam und Lamotrigin nachweisen.
MRP1 wurde als erstes Multidrug-Resistance Protein entdeckt (COLE et al.
1992). Es gehört zur ABCC-Subfamilie. Die luminale Lokalisation an der BHS stellt
für MRP1 eine Ausnahme dar. Außerhalb der BHS wird MRP1 an der basolateralen
21

STAND DER FORSCHUNG
Membran (dem Gewebe zugewandt) von Kapillarendothelien exprimiert (EVERS et
al. 1996; PENG et al. 1999; LESLIE et al. 2005). MRP1 transportiert Glutathion und
organische Anionen. Diese können an Glukuronate sowie an Sulfate konjugiert sein.
Für den Transport anderer Substanzen durch MRP1 wird Glutathion benötigt.
Außerdem werden Chemotherapeutika und HIV-Protease-Inhibitoren durch MRP1
transportiert (RENES et al. 1999; BAKOS & HOMOLYA 2007).
Wie für Pgp (TISHLER et al. 1995) konnte auch für MRPs ein Zusammenhang
zwischen einer Resistenz und der Überexpression dieser Transporter nachgewiesen
werden (SISODIYA et al. 1999; DOMBROWSKI et al. 2001).
2.5 Andere Transporter-Familien
Wie in Abbildung 2.3 zu sehen ist, sind noch weitere Transporter an der
Absorption, Verteilung und Elimination von Stoffen beteiligt. Die Familien der Organic
Anion Transport Polypeptides (OATP) und Organic Anion Transporters (OAT)
benötigen im Unterschied zu den ABC-Transportern kein ATP, weshalb auch kein
Transport entgegen eines Konzentrationsgradienten möglich ist. Der Transport
erfolgt in Form eines Austauschs von Molekülen entlang eines
Konzentrationsgefälles. Wird ein Molekül auf die eine Seite der Membran
transportiert, erfolgt im Gegenzug der Transport eines Moleküls auf die andere
Membranseite. So können diese Proteine Substanzen sowohl ins Gehirn
transportieren als auch für den Efflux zurück ins Blut dieser Substanzen
verantwortlich sein (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a).
Diese Transporter-Familien kommen nicht nur in der BHS vor, sondern auch in
vielen anderen Geweben (PIZZAGALLI et al. 2002; HAGENBUCH & MEIER 2003).
Dort bewerkstelligen sie den Transport von körpereigenen Stoffen (z.B.
Gallensäuren, Schilddrüsenhormone) als auch anionischen Arzneimitteln wie z.B. der
HMG-CoA Reduktase-Inhibitor Pravastatin, das Zytostatikum Methotrexat, das
Antibiotikum Benzylpenicillin und das Herzglykosid Digoxin (HAGENBUCH & MEIER
2003; MIKKAICHI et al. 2004). Diese Transporter kommen in vielen Formen vor und
auch hier können Polymorphismen Einfluss auf die Funktionen von MDTs nehmen
(MARZOLINI et al. 2004a; KERB 2006; GIRARDIN 2006). Es können
Wechselwirkungen mit Arzneimitteln auftreten, allerdings ist die Bedeutung für
Antiepileptika und die Pharmakoresistenz bei Epilepsiepatienten unklar.
22

STAND DER FORSCHUNG
2.6 Wechselwirkungen mit Pgp
Die Substanzen, die mit Pgp interagieren, weisen sehr unterschiedliche
Strukturen auf. Deshalb können sie in vier verschiedene Kategorien eingeteilt
werden: 1) Substrate, 2) Inhibitoren, 3) Modulatoren und 4) Induktoren (COLABUFO
et al. 2010). Die Wechselwirkungen für Pgp sind vielfältig. Der MDT kann sowohl
gehemmt als auch induziert werden, wobei Substrate von Pgp häufig auch Substrate
der Cytochrom-P 450 -Enzyme sind, genauer des Cytochroms CYP3A (BRINKMANN &
EICHELBAUM 2001; BECKER & DREWE 2006; siehe Tabelle 2.1), welches das
häufigste Cytochrom-P 450 -Enzym in Leber und Darm darstellt (KLIEWER &
WILLSON 2002). Die Regulation der Expression und Aktivität von CYP3A und Pgp
scheint zumindest teilweise über die gleichen Mechanismen zu erfolgen, weshalb die
Differenzierung der Effekte erschwert wird.
23

STAND DER FORSCHUNG
Tabelle 2.1: Übersicht über Substrate, Induktoren und Inhibitoren des MDT Pgp (nach
BRINKMANN & EICHELBAUM 2001; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a und BECKER &
DREWE 2006).
Induktoren Substrate Inhibitoren
Dexamethason
Antiallergika:
Terfenadin
Alkaloide:
Colchicin, Reserpin, Staurosporin
Doxorubicin
Antiarrhythmika:
Amiodaron, Digoxin, Propafenon,
Antiarrhythmika:
Amiodaron 1 , Chinidin 1 , Lidocain
Quinidin
Flavonoide:
Kämpferol,
Antibiotika:
Cefazolin, Cefaperazon
Anti-Malaria-Medikamente:
Chloroquin, Primaquin
Quercetin
Johanniskraut
Antiepileptika:
Carbamazepin A, x , Felbamat A, x ,
Antimykotika:
Itraconazol, Ketoconazol
Lamotrigin A, x , Phenobarbital A ,
Phenytoin A
Phenobarbital A
Beta-Blocker:
Carvedilol, Celiprolol, Talinolol
Calciumantagonisten:
Diltiazem, Felodipin, Nicardipin,
Nifedipin, Nitrendipin, Verapamil 1
Phenytoin A Calciumantagonisten:
Diltiazem, Nicardipin, Verapamil
HIV-Protease-Hemmer:
Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir,
Saquinavir
Rifampicin
Chemotherapeutika:
Daunorubicin, Doxorubicin,
Immunsuppressiva:
Cyclosporin A 1 , Tacrolimus
Etoposid, Mitomycin C,
Mitoxantron, Paclitaxel,
Tamoxifen, Teniposid, Vincristin,
Vinblastin
Vinblastin
H 1 -Blocker:
Fexofenadin, Terfenadin
Neuroleptika:
Flupentixol, Phenothiazin,
Thioxanthen
HIV-Protease-Hemmer:
Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir,
Saquinavir
Steroide:
Ethinylestradiol, Norgestrel,
Progesteron, Testosteron
24

STAND DER FORSCHUNG
x
A
Induktoren Substrate Inhibitoren
Immunsuppressiva:
Cyclosporin, Sirolimus,
Makrolid-Antibiotika:
Clarithromycin, Erythromycin
Tacrolimus
Morphine:
Morphin 6-Glucoronid, Morphin,
Loperamid
Weitere:
Mifepriston, Paroxetin, Talinolol,
Tamoxifen, Terfenadin,
Trifluoperazin, Vincristin,
Carbamazepin A , Detergenzien
(Cremophor)
Steroide:
Aldosteron, Dexamethason,
Hydrocortison
Entwickelte Inhibitoren:
2. Generation: Elacridar, Valspodar
(PSC833), Biricodar, Dexverapamil
3. Generation:, Laniquidar,
Tariquidar, Zosuquidar
Weitere:
Chlorpromazin, Colchicin,
Furosemid, Methadon,
Midazolam, Quetiapin, Rifampicin,
Simvastatin
widersprüchliche Angaben
Antiepileptika
1
Pgp-Inhibitoren der ersten Generation
25

STAND DER FORSCHUNG
Die Tabelle 2.1 verdeutlicht das breite Substratspektrum von Pgp. Die Effekte
der einzelnen Substanzen könnten auf der unterschiedlichen Expression der
sogenannten Orphan Nuclear Receptors (ONR) beruhen, die v.a. in der Leber und im
Darm exprimiert werden und dort den Abbau von Substanzen über metabolisierende
Enzyme vermitteln. Sie sind an der Funktion der Cytochrom-P 450 -Enzyme und der
Efflux-Transporter wie Pgp beteiligt (WANG & LECLUYSE 2003; XU et al. 2005;
KÖHLE & BOCK 2009). Diese Rezeptoren wirken induzierend auf den
Metabolismus, gleichzeitig können sie die Induktion von Pgp bewirken. Dabei findet
die transkriptionelle Regulation durch beispielsweise den Pregnane X Receptor
(PXR), Constitutive Androstane Receptor (CAR) oder den Farnesoid X Receptor
(FXR) statt. Alle drei sind in der Leber und dem Darm lokalisiert, des Weiteren
werden PXR und CAR zusätzlich in der Niere exprimiert. PXR wurde außerdem in
Hirnkapillaren nachgewiesen (BAUER et al. 2004). Die Substanzen Dexamethason
und Rifampicin haben eine induzierende Wirkung auf PXR (BAUER et al. 2004).
Aufgrund unterschiedlicher Bindedomänen sind die ONRs je nach Gewebe und
Spezies unterschiedlich stark exprimiert (KLIEWER & WILLSON 2002; ZHOU et al.
2009), wodurch Substanzeffekte variieren können. Für Pgp und MRP2 konnte
gezeigt werden, dass die Expression durch PXR und CAR stark reguliert wird
(SYNOLD et al. 2001; WANG & LECLUYSE 2003; TIMSIT & NEGISHI 2007).
Pgp zeigt ein breites Substratspektrum. Viele Substanzen können also von
diesem MDT aus dem jeweiligem Zielgewebe ausgeschleust werden. Deshalb wird
angestrebt, Medikamente zu entwickeln, die keine Pgp-Substrate darstellen und den
Efflux durch MDT wie Pgp umgehen können (BEGLEY 2004).
2.6.1 Bekannte Pgp-Substrate
Pgp transportiert sehr viele unterschiedliche Substrate, wobei die Spezifität
gegenüber einem Substrat oft relativ gering ist (DIDZIAPETRIS et al. 2003). Stoffe,
die gute Pgp-Substrate darstellen, gelangen i.d.R. gar nicht oder nur in einem
geringen Ausmaß ins Gehirn. Dabei scheint die Lipophilie und die Größe (oft > 500
Da) der Substanz keine größere Rolle zu spielen (PARDRIDGE 2003). Die Substrate
können sich gegenseitig in Form eines kompetitiven Antagonismus beeinflussen
(HAIT & AFTAB 1992; FORD & HAIT 1993). Klinisch relevant wird dies v.a. bei
Arzneimitteln mit einer geringen therapeutischen Breite, da bereits geringfügig
erhöhte Plasmakonzentration toxische Effekte hervorrufen können.
26

STAND DER FORSCHUNG
Antiepileptika sind relativ kleine und lipophile Substanzen, weshalb sie die
BHS gut passieren können (LÖSCHER & FREY 1984). Mehrere Studien in Bezug
auf Epilepsie weisen darauf hin, dass es sich bei mindestens 13 Antiepileptika um
Pgp-Substrate handelt: Acetazolamid, Carbamazepin, Carbamazepine-10,11-Epoxid,
Eslicarbazepinacetat, Felbamat, Gabapentin, Lamotrigin, Levetiracetam,
Oxcarbazepin, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat (LÖSCHER 2005;
MARCHI et al. 2005; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012). Darüber hinaus
scheinen einige Antiepileptika wie Carbamazepin, Phenytoin und Valproat auch
durch MRPs transportiert zu werden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005c).
2.6.2 Bekannte Pgp-Induktoren
Für viele Substanzen ist bekannt, dass sie durch den MDT Pgp transportiert
werden (BAUER et al. 2005). Das breite Substratspektrum ermöglicht den Efflux
einer Vielzahl an Substanzen zurück ins Blut, um einen größtmöglichen Schutz des
Organismus vor potentiell gefährlichen Stoffen zu erreichen. Zusätzlich zum Efflux
vieler Substanzen führen einige dieser Stoffe zu einer Induktion des Transporters
Pgp. Das Glukokortikoid Dexamethason und die Zytostatika Doxorubicin, Rifampicin
und Puromycin stellen dabei nur einige der Stoffe dar, die die Expression von Pgp
induzieren (FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999; PASCUSSI et al. 2000;
DEMEUSE et al. 2004; CHEN et al. 2006; NARANG et al. 2008). Weitere
Substanzen, die zur Pgp-Induktion führen können, sind Antiepileptika wie
Phenobarbital, Phenytoin und Carbamazepin (LOMBARDO et al. 2008; WEN et al.
2008). Induktionen dieses Efflux-Transporters wurden in Leberzellen (FARDEL et al.
1997; MARTIN et al. 2008), in Darmzellen (DIXIT et al. 2002; MARTIN et al. 2008)
und auch in der BHS nachgewiesen (BAUER et al. 2007; HARTZ et al. 2008). Es ist
aber nicht ausreichend bekannt, inwieweit die Lokalisationen in den Organen eine
Rolle spielen. Die Speziesunterschiede können aber erheblich sein und wurden u.a.
von BALTES et al. (2007a) und MARTIN et al. (2008) beschrieben. Für die oben
genannten Stoffe konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Pgp nicht direkt
erfolgt, sondern über nukleare Rezeptoren wie z.B. PXR und CAR vermittelt werden
kann. Diese Rezeptoren kommen u.a. auch in der BHS vor (BAUER et al. 2006) und
sorgen über den Weg von Enzymen und Transportern für den Efflux von Xenobiotika.
Somit sind sie an der Schutzfunktion des Gehirns beteiligt (WANG & LECLUYSE
2003; XU et al. 2005; KÖHLE & BOCK 2009).
27

STAND DER FORSCHUNG
2.6.3 Bekannte Pgp-Inhibitoren
Eine erhöhte Funktionalität bzw. Expression des MDT Pgp ist ein Phänomen,
das bei vielen Erkrankungen auftritt. Erstmals wurde dies mit therapieresistenten
Tumoren in Verbindung gebracht (JULIANO & LING 1976). Deshalb wurden in der
Tumorforschung bereits Inhibitoren auf ihr Vermögen Pharmakoresistenzen
aufzuheben in klinischen Studien getestet (THOMAS & COLEY 2003; ILLMER et al.
2004; ROBEY et al. 2008b; LAGAS et al. 2009). Bei gleichzeitiger Verabreichung
eines Pgp-Substrats und eines Pgp-Inhibitors wurde die Bioverfügbarkeit des
Substrats erhöht (YU 1999). Der Nachweis, dass die Inhibition von Pgp in der BHS
durch lokale Applikation des Inhibitors zu einer erhöhten Konzentration
verschiedener Substanzen wie z.B. Antiepileptika im Gehirn führt, wurde bereits
erbracht (SAWCHUK & ELMQUIST 2000; LÖSCHER & POTSCHKA 2002).
Noch werden Inhibitoren für MDT nicht regulär in der Epilepsietherapie
eingesetzt. Dies ist u.a. darin begründet, dass Pgp nicht nur in der BHS exprimiert
wird, sondern auch in anderen Organen und Geweben lokalisiert ist (Abbildung 2.4)
und die Inhibition zum einen Auswirkungen auf die Bioverfügbarkeit und
Pharmakodynamik anderer Substanzen, zum anderen toxische Nebenwirkungen auf
gesunde Organe haben kann (DOYLE & ROSS 2003). Aus diesem Grund sollte die
Applikation des jeweiligen Inhibitors möglichst lokal erfolgen, um Nebenwirkungen zu
vermeiden. Dennoch könnte die zumindest transiente Inhibition von Pgp und weiterer
MDT durch kurzzeitige Administration der Inhibitoren nützlich sein, um
Pharmakoresistenzen aufgrund gesteigerter MDT-Funktionen aufzuheben oder gar
zu vermeiden (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a).
Zu den Pgp-Inhibitoren zählt eine Reihe an Arzneimitteln (siehe Tabelle 2.1)
mit unterschiedlichen Einsatzgebieten sowie eigens zu diesem Zweck entwickelte
Substanzen. Auch Hilfsstoffe der jeweiligen Formulierung eines Medikaments,
beispielsweise Emulgatoren, können hemmend auf Pgp wirken (MARTIN-FACKLAM
et al. 2002; LÖSCHER & POTSCHKA 2005c).
Für Cyclosporin A, einem Immunsuppressivum und Pgp-Inhibitor der ersten
Generation, wurde dessen inhibierende Wirkung auf Pgp sowohl in Zelllinien (NOBILI
et al. 2006) als auch in Tiermodellen (SLATER et al. 1986; SIKIC et al. 1997; EYAL
et al. 2009) nachgewiesen. Allerdings wird es aufgrund seiner immunsuppressiven
Wirkung eher bei Organtransplantationen eingesetzt und nicht zur Behandlung
pharmakoresistenter Epilepsien (LIU et al. 2007).
28

STAND DER FORSCHUNG
Ein weiterer Pgp-Inhibitor der ersten Generation ist der Calciumantagonist
Verapamil, der zur Behandlung koronarer Herzerkrankungen, Arrhythmien und
Bluthochdruck eingesetzt wird (SCHWARTZ & TRIGGLE 1984). Allerdings wiesen
klinische Studien für eine Inhibition von Pgp notwendigen Plasmakonzentrationen
herztoxische Nebenwirkungen nach (DALTON et al. 1989; MILLER et al. 1991).
Ähnliche toxische Effekte und eine zu geringe Spezifität waren für andere Pgp-
Inhibitoren zu verzeichnen (DOYLE & ROSS 2003), was auf ihre ursprüngliche
Indikation und nicht auf die Pgp-Hemmung zurückzuführen ist.
Valspodar, ein Pgp-Inhibitor der zweiten Generation, schien eine größere
Selektivität und Toleranz aufzuweisen, um die Nebenwirkungen für den Organismus
gering zu halten. Allerdings traten auch hier Wechselwirkungen mit anderen
Transportern auf (BATES et al. 2002; THOMAS & COLEY 2003; LÖSCHER &
POTSCHKA 2005a). Pgp-Inhibitoren der dritten Generation, z.B. Elacridar und
Tariquidar, erschienen hinsichtlich ihrer Spezifität der Pgp-Inhibition, der wenigen
Wechselwirkungen mit dem Cytochrom-P 450 -System und Nebenwirkungen sehr
vielversprechend (BATES et al. 2002; THOMAS & COLEY 2003), dennoch zeigten
weiterführende Studien Interaktionen mit dem MDT BCRP (DE BRUIN et al. 1999;
ROBEY et al. 2004; KANNAN et al. 2010).
Die in Abschnitt 2.1.3 beschriebenen Strategien zur Überwindung des Efflux
durch die MDT und der BHS in Form von Nanopartikeln und Liposomen, könnten
auch für die Applikation von MDT-Inhibitoren an der BHS genutzt werden.
Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass unerwünschte Nebenwirkungen der
Inhibitoren durch den Einschluss in Liposomen eingegrenzt werden (FISHER & HO
2002; FRICKER & MILLER 2004).
2.6.4 Pgp-Trafficking
Pgp ist in der Membran lokalisiert und in intrazellulären Kompartimenten wie
Endoplasmatischem Retikulum (ER), Golgi-Apparat, Endosomen und Lysosomen zu
finden. Es zirkuliert zwischen diesen Kompartimenten und der Zellmembran
(intrazelluläres Trafficking) (FU & ARIAS 2012).
Das Trafficking beschreibt im Wesentlichen den Transport innerhalb der Zellen
vom Ort der Entstehung eines Proteins an seinen Wirkort einschließlich der
Bereitstellung in Speichervesikeln und des Abbaus. Daran ist v.a. der Golgi-Apparat
beteiligt, der für die Sortierung und den Transport der Proteine verantwortlich ist.
29

STAND DER FORSCHUNG
Proteine, die nicht im Zytosol sondern in Membranen oder extrazellulär benötigt
werden, werden nach ihrer Synthese im rauhen Endoplasmatischen Retikulum zum
Golgi-Apparat weitergeleitet und dort für den weiteren Transportweg modifiziert und
in Endosomen verpackt.
Zur Untersuchung des Traffickings nutzen Studien dazu v.a. das grünfluoreszierende
Protein (GFP), welches Untersuchungen der Zellen als dynamisches
System ermöglicht (LIPPINCOTT-SCHWARTZ 1998) und die direkte Beobachtung
intrazellulärer Strukturen ermöglicht. Mit Zeitraffer-Aufnahmen von GFP-markierten
sekretorischen Transportmolekülen war es möglich, den zeitlichen Ablauf vom
Ursprung des Proteins über seinen Transportweg bis zum Zielort zu ermitteln
(LIPPINCOTT-SCHWARTZ 2000).
Mittels Pgp-Trafficking können weiterführende Untersuchungen zur Modulation
des Transporters durchgeführt werden. Es wird davon ausgegangen, dass Pgp nicht
permanent neu synthetisiert wird, sondern in Vesikeln zwischengelagert und erst
später an die Membran transportiert wird (FU & ARIAS 2012), wo es dann aktiv am
Efflux von Substanzen beteiligt ist. Die Aktivität dieses Pgps wurde z.B. in
Rattenhirnendothelzellen gezeigt (MCCAFFREY et al. 2012). Das bedeutet, dass
Pgp in einem relativ kurzen Zeitraum (innerhalb von Stunden) an seinen Wirkort
gelangt und längere Phasen der Neusynthese damit umgangen werden können.
Kenntnisse zu den Abläufen des Pgp-Trafficking könnten Hinweise zur
Inhibition des Transporters geben. Dies könnte neue Therapiestrategien und
Möglichkeiten aufzeigen, Pharmakoresistenzen zu umgehen. Es konnte
nachgewiesen werden, dass die Unterbrechung des Pgp-Traffickings zur
Zellmembran zu einem Anstieg der intrazellulären Konzentration von Antitumor-
Medikamenten führte (FU et al. 2004; FU et al. 2007). Auf diese Weise könnten auch
Einflüsse der Antiepileptika auf das Protein-Trafficking und auf die Bereitstellung von
funktionellem Pgp sowie potentielle Behandlungs-möglichkeiten pharmakoresistenter
Epilepsien untersucht werden.
2.7 In-vivo-Untersuchungen
Für In-vivo-Untersuchungen der MDT und deren Transport sowie
Modulationen stehen funktionelle bildgebende Verfahren wie z.B. die
Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (Singular Photon Emission
Computed Tomographie; SPECT) und die Positron-Emissions-Tomographie (PET)
30

STAND DER FORSCHUNG
zur Verfügung. Auf diese Weise können radioaktiv-markierte Substrate oder
Inhibitoren nicht-invasiv im lebenden Organismus nachgewiesen werden (LÖSCHER
& LANGER 2010; LÖSCHER et al. 2011).
Außerdem werden genetisch veränderte Tiere, vorzugsweise Mäuse,
eingesetzt, um Funktionen bestimmter Proteine bzw. MDT, zu untersuchen. Dabei
werden gezielt ein oder mehrere MDT ausgeschaltet, sodass Vergleiche dieser
sogenannten Knockout-Tiere mit den unveränderten Wildtyp-Tieren angestellt
werden können. Man geht davon aus, dass, sofern es sich um ein Substrat handelt,
ein ausgeschalteter Transporter an der BHS zu einer erhöhten Substratkonzentration
im Gehirn führt (DORAN et al. 2005). Allerdings muss dabei beachtet werden, dass
durch den Knockout eines Transporters die Funktionen oder Expressionen anderer
MDT verändert werden können, da sich die Transporter in ihren Funktionen
möglicherweise gegenseitig ersetzen. Dies wurde bereits in Tierstudien gezeigt, bei
denen Transporter oder deren mRNA an der BHS oder anderen Geweben
heraufreguliert waren (SCHINKEL et al. 1994; CISTERNINO et al. 2004;
HOFFMANN & LÖSCHER 2007). Derartige kompensatorische Mechanismen
konnten auch in vitro nachgewiesen werden (KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010).
2.8 In-vitro-Untersuchungen
Für Untersuchungen der BHS, des Transports an der Barriere sowie deren
Modulation werden seit langem unterschiedliche Techniken und Modelle verwendet
(DELI et al. 2005). Mit Tiermodellen sind Untersuchungen zellulärer und molekularer
Mechanismen allerdings nur begrenzt möglich. Daher wurden In-vitro-Modelle der
BHS entwickelt, die viele In-vivo-Charakteristika der BHS zeigen. Gerade für die
Untersuchung der Expression und Funktionalität der Transportsysteme der BHS
haben sich In-vitro-Modelle bewährt (TAKAKURA et al. 1991; BONATE 1995; DELI
et al. 2005), die u.a. zur Untersuchungen von Substraten der MDT eingesetzt werden
(HOCHMAN et al. 2002). In-vitro-Modelle mit immortalisierten Zelllinien bieten die
Vorteile, dass weder Tierhaltung noch aufwendige Primärzellpräparationen
erforderlich sind. Mit In-vitro-Modellen lassen sich Substanzen auf ihre
modulatorischen Eigenschaften gegenüber MDT in hohem Durchsatz testen. Sie sind
i.d.R. günstiger als In-vivo-Modelle und lassen gezieltere Untersuchungen einzelner
Sachverhalte sowie Analysen auf molekularer Ebene zu (LUNDQUIST & RENFTEL
2002).
31

STAND DER FORSCHUNG
Letztlich zeigen alle zurzeit verfügbaren In-vitro-BHS-Modelle Vor- und
Nachteile, und nicht für alle Modelle werden Zellen der BHS verwendet.
Primärkulturen der BHS oder auch Kokulturen mit Astrozyten sollen eher geeignet
sein (CARDOSO et al. 2010; HATHERELL et al. 2011), können aber nicht für alle
Untersuchungen eingesetzt werden.
In-vitro-Modelle können in direkte und indirekte Methoden unterteilt werden.
2.8.1 Indirekte In-vitro-Modelle
Der ATPase-Assay stellt eine indirekte Möglichkeit dar, die Aktivität eines
Transporters zu untersuchen. Dabei werden Substrate eines Transporters ermittelt,
indem die ATPase-Aktivität des Transporters quantifiziert wird. Dieser Assay macht
sich die Eigenschaft der ABC-Transporter zunutze, die für den Transport einer
Substanz über die BHS notwendigerweise Energie aus der Spaltung von ATP
benötigen. Die Menge des bei der ATP-Hydrolyse freigesetzten Phosphats ist
proportional der Aktivität eines Transporters (GLAVINAS et al. 2008).
Der Calcein-AM-Assay dient in erster Linie dazu, vitale Zellen zu markieren.
Dabei nutzt man die Eigenschaft intrazellulärer Esterasen, die die
Acetoxymethylester (AM)-Gruppe des Calcein-AMs nach Aufnahme in vitale Zellen
abspalten. Das freiwerdende Calcein kann die Zellen aufgrund des hydrophilen
Charakters nicht verlassen und der Nachweis mittels Fluoreszenz-Messung ist
möglich. Calcein-AM wird aber von Pgp und MRP1 transportiert (SZAKÁCS et al.
1998; GLAVINAS et al. 2008), sodass mögliche Substrate der MDT um die Bindung
an diese mit dem Calcein-AM konkurrieren und z.B. Vergleiche zwischen normalund
MDT-überexprimierenden Zellen möglich sind. Es müssen aber nicht
zwangsläufig eine Korrelation zwischen Substraten und Inhibitoren der MDT
bestehen (FENG et al. 2008). Deshalb bedeutet das Ausbleiben einer Inhibition des
Calcein-AM-Efflux nicht, dass eine Substanz nicht transportiert wird.
2.8.2 Direkte In-vitro-Modelle
Zu den direkten Methoden gehört beispielsweise der Kumulations-Assay
(auch Uptake-Assay), mit dessen Hilfe und unter Verwendung spezifischer
Inhibitoren die Anreicherung bestimmter Substanzen in Zellen in einem definierten
Zeitraum untersucht werden kann. Sofern ein Stoff von einem Transporterprotein aus
den Zellen heraustransportiert wird, verringert sich die Konzentration in den Zellen.
32

STAND DER FORSCHUNG
Dieser Umstand kann durch Inhibitoren verhindert werden. Ein Nachteil dieser
Methode ist die hohe Permeabilität kleiner lipophiler Substanzen, die mit diesem
Assay nicht erfasst werden können.
Mit den Transport-Assays ist es möglich herauszufinden, ob Substanzen
durch MDT transportiert werden (SCHWAB et al. 2003b). Dazu muss aber die
parazelluläre Diffusion vermieden bzw. ausgeschlossen werden, was durch
konfluente und dichte Zellmonolayer erreicht werden kann. Wie in der Abbildung 2.5
zu sehen ist, werden die Zellen in einem dreidimensionalen Transwell-Modell auf
einer semi-permeablen Membran kultiviert (GROBSTEIN 1953).
Abbildung 2.5: Modell des Transwell-Systems, nach LUNA-TORTÓS et al. (2008).
Das Transwell-System dient der Erkennung der Substrate von MDT. Die Zellen werden auf einer
feinporigen Membran des Kammereinsatzes kultiviert und bilden einen Monolayer mit engen
Verbindungen (Tight junctions) zwischen den Zellen aus. Medium wird in beide Kammern
eingefüllt. Aufgrund der Trennung der apikalen (blutzugewandt) und der basolateralen
(hirnseitig) Kammer, ist ein Durchtritt nur durch die Zellmembran möglich.
Diese Membran unterteilt das System in eine apikale und basolaterale
Kammer. Die Testsubstanz wird in eine der Kammern gegeben (bidirektionaler
Transport-Assay). Proben werden auf der jeweils anderen Seite entnommen. Bei
dieser Variante des Assays kann der Einfluss der passiven und parazellulären
Diffusion einer Substanz nicht ausgeschlossen werden, weshalb die Methode in der
hiesigen Arbeitsgruppe modifiziert wurde. Für den Konzentrationsgleichgewichts-
Assay (Concentration Equilibrium Assay, CETA) wird die Testsubstanz in der
33

% Digoxin
% Digoxin
STAND DER FORSCHUNG
gleichen Konzentration sowohl in die apikale als auch basolaterale Kammer gegeben
und Proben aus beiden entnommen (LUNA-TORTÓS et al. 2008).
Man spricht von einem Transport, wenn sich die Konzentrationen der zu
untersuchenden Substanz zwischen der apikalen und basolateralen Kammer
signifikant unterscheiden. Werden keine Unterschiede zwischen den
Konzentrationen einer Substanz in beiden Kammern nachgewiesen, geht man
zunächst davon aus, dass dieser Transport entweder inhibiert wurde oder die
Testsubstanz nicht von dem untersuchten Transporter transportiert wird (siehe
Abbildung 2.6 B).
A
180
160
140
120
100
Digoxin (10 nM)
LLC-Zellen
* * * * *
80
apikal
60
basolateral
40
0 120 240 360 480 600
min
B
180
160
140
120
100
80
60
Digoxin (10 nM) + TQD (0,5 µM)
LLC-Zellen
40
0 120 240 360 480 600
min
Abbildung 2.6: Beispielhafte CETAs mit Pgp-überexprimierenden LLC-Zellen +/- Inhibitor von
K. Römermann.
A: Transportversuch mit Digoxin. Die apikale Digoxin-Konzentration steigt an, die basolaterale
Konzentration des Pgp-Substrats sinkt. Die Konzentrationsunterschiede waren signifikant
verschieden. Ein Transport des Pgp-Substrats Digoxin wurde nachgewiesen.
B: Digoxin-Transportversuch nach Zugabe des Pgp-Inhibitors Tariquidar (TQD; 0,5 µM). Die
Konzentrationsunterschiede zwischen apikaler und basolateraler Kammer wurden aufgehoben.
Der Transport wurde inhibiert.
Aber auch beim CETA kann die Diffusion der Testsubstanzen nicht vollständig
eliminiert werden. Beispielsweise sollten Untersuchungen der Dichtigkeit eines
Monolayers durchgeführt werden. Für beide Varianten des Transportversuchs sind
dichte Monolayer eine Voraussetzung. Die Endothelzellen der BHS zeigen diese
Barriere-Eigenschaften in vivo. NICOLAZZO et al. (2006) wiesen aber nach, dass Invitro
BHS-Modelle eine geringere oder gar ausbleibende Expression wichtiger Tight
34

STAND DER FORSCHUNG
junction-Proteine sowie höhere Permeabilitäten zeigen. URICH et al. (2012)
berichteten ebenfalls, dass primäre Hirnkapillarendothelien der Maus außerhalb ihrer
In-vivo-Umgebung ihre einzigartigen Charakteristika verlieren. Deshalb werden
häufig LLC- und MDCK II-Zellen, die aus dem Nierenepithel des Schweins bzw. des
Hundes stammen, verwendet. Diese zeigen aufgrund dichter Monolayer ausreichend
hohe transepitheliale elektrische Widerstände (transepithelial/-endothelial electrical
resistance, TEER) und niedrige Permeabilitäten parazellulärer Marker wie Mannitol
oder Sucrose (LUNA-TORTÓS et al. 2008), weshalb sie für
Transportuntersuchungen geeignet sind.
Parazelluläre polare und folglich nicht lipophile Markersubstanzen (z.B.
Sucrose oder Mannitol) (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010), die aufgrund dieser
Eigenschaften nicht in die Zellen gelangen, sowie der transendotheliale Widerstand,
der auf die Ausbildung der Tight junctions zurückgeführt wird (STANNESS et al.
1997; LUNA-TORTÓS et al. 2008; HATHERELL et al. 2011), stellen Parameter der
Dichtigkeit dar. Einen festgelegten TEER-Wert gibt es nicht, er ist von der Zelllinie
sowie den Bedingungen in den einzelnen Laboren abhängig und somit ein
Erfahrungswert. Für Mannitol und Sucrose gilt: je niedriger die Permeabilität, desto
höher die Dichtigkeit der Zellmembran und der Tight junctions zwischen den Zellen.
Wenn also der TEER-Wert sehr hoch und die Permeabilität der Markersubstanz sehr
gering ist, ist die Wahrscheinlichkeit am höchsten, dass die zu untersuchende
Substanz den Weg durch die Zellen nimmt und ein Transport nachgewiesen werden
kann.
2.8.3 Primärkulturen
Dauerhafte immortalisierte Zellkulturen können im Vergleich zu primären
Zellen des Ursprungsgewebes Veränderungen aufweisen, beispielsweise in der
Expression bestimmter Transporter. Deshalb werden Primärkulturen aus
Hirnkapillarendothelien, die direkt aus dem Gehirn verschiedener Spezies präpariert
und in Kultur gebracht werden können, in Untersuchungen eingesetzt (FRANKE et
al. 2000). Die so gewonnenen Hirnzellen werden nicht immortalisiert, d.h. sie können
sich nicht unbegrenzt teilen und sind demnach nur über einen kurzen Zeitraum für
Experimente verwendbar.
Eine weitere Schwierigkeit besteht in dem offensichtlichen Verlust der
Barriere-Eigenschaften der Hirnkapillarendothelien in vitro. Dieser Zelltyp kann seine
35

STAND DER FORSCHUNG
Charakteristika wie die Ausbildung der Tight junctions und der nahezu vollständig
unterbundenen Permeation von Substanzen nicht nur durch
Immortalisierungsprozesse verlieren (NICOLAZZO et al. 2006). Die Kultivierung der
Primärzellen kann zu Verlusten der BHS-Eigenschaften führen, auch wenn die
Passagenzahl der Zellen gering gehalten wird (URICH et al. 2012).
Hirnkapillarendothelien und deren Eigenschaften sind von ihrer Umgebung abhängig
und dies muss bei der Entwicklung von BHS-Modellen beachtet werden. Aus diesem
Grund werden Kokulturen mit beispielsweise Astrozyten als Modelle der BHS
eingesetzt (NAKAGAWA et al. 2007).
2.8.4 Ko- und Trikulturen
Wenn auch einige Zelllinien für Transport-Assays geeignet sind, können sie
die BHS und ihre Eigenschaften nur zu einem gewissen Teil nachahmen. Ähnlich
verhält es sich mit primären Hirnendothelzellen. Oft werden Tight junctions nicht oder
nur unvollständig ausgebildet oder die Permeabilitäten bestimmter parazellulärer
Marker sind zu hoch (BEREZOWSKI et al. 2004). Deshalb wurden zur besseren
Simulation der In-vivo-Situation und zur Verbesserung der Integrität der
Zellmonolayer Ko- oder Trikulturen mit Astrozyten und/oder Perizyten und den
Endothelzellen untersucht (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003;
HATHERELL et al. 2011). Kokultur-Versuche von Hirnendothelzellen mit Astrozyten
und Perizyten zeigten u.a., dass die Ausbildung der Tight junctions erhöht wird
(DEMEUSE et al. 2002; HAYASHI et al. 2004), was wiederum positiven Einfluss auf
die Dichtigkeit der Zellen hat. Dabei scheint die Kontakt-Kokultur, bei der die
Endothelzellen auf der einen Seite der Membran und die Astrozyten oder Perizyten
auf der anderen Seite kultiviert werden, besser geeignet zu sein als die Nichtkontakt-
Kokultur (ABBOTT 2002). GAILLARD et al. (2000) und GARCIA et al. (2004) fanden
heraus, dass durch die Kontakt-Kokultur mit Astrozyten die Expression von Pgp und
Tight junction-Proteinen wie Occludin heraufreguliert wird.
Trikulturen mit Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten kommen der In-vivo-
Situation noch näher (NAKAGAWA et al. 2007). Außerdem stabilisieren sie die Tight
junctions (SCHIERA et al. 2003) und führten zu den höchsten transendothelialen
Widerständen in diesem Modell (NAKAGAWA et al. 2007). Dies konnten
HATHERELL et al. (2011) bestätigen. Die Kokultur der immortalisierten humanen
36

STAND DER FORSCHUNG
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 mit humanen Astrozyten zeigte im Vergleich
zur Monokultur der Endothelzellen höhere transendotheliale Widerstände.
2.8.5 Humanes dynamisches In-vitro-Bluthirnschranken-Modell
Für Untersuchungen von Epilepsieerkrankungen existieren viele verschiedene
Modelle, sowohl Tier- als auch In-vitro-Modelle. Dennoch gibt es zurzeit kein ideales
Modell der BHS (DELI et al. 2005). Ein Versuchsaufbau, der einem optimalen Modell
sehr nahe kommt, ist das von STANNESS et al. (1996 & 1999) entwickelte humane
dynamische In-vitro-BHS-Modell (humanized dynamic in vitro blood-brain barrier
model, hDIV-BBB), welches von anderen Gruppen weiter optimiert wurde und
Anwendung in Untersuchungen der Epilepsien gefunden hat (JANIGRO et al. 1999;
CUCULLO et al. 2002 & 2007). In diesem Modell werden die Scherkräfte des
Blutstroms der Gehirngefäße nachgestellt, sodass sich Charakteristika der BHS
nahezu vollständig ausbilden. Auf diese Weise kann das Problem der mangelnden
Integrität der Primärkulturen umgangen werden, und Transportversuche können
durchgeführt werden.
Beispielsweise zeigten Cucullo et al. (2007) in Untersuchungen mit
Primärkulturen aus gesundem Hirngewebe und Gewebe pharmakoresistenter
Epilepsiepatienten in Kokultur mit humanen Astrozyten Unterschiede im Transport
des Antiepileptikums Phenytoin. Dabei wurde Phenytoin in Zellen aus epileptischem
Hirngewebe in stärkerem Ausmaß von Pgp transportiert als in den Zellen aus dem
gesunden Gewebe. Dies lässt auf eine erhöhte Pgp-Expression in
pharmakoresistentem epileptischem Gewebe schließen. Allerdings sind auf diese
Weise keine Untersuchungen mit einem hohen Durchsatz möglich. Deshalb sollten
mehrere verschiedene Methoden angewendet werden, um Aussagen darüber treffen
zu können, ob Substanzen die Pgp-Funktion modulieren können (SCHWAB et al.
2003b). Dies ist auch für die immer größer werdende Zahl unterschiedlicher Modelle
wichtig, da sich der Vergleich der Studien, die zur Identifizierung von Substraten der
MDT genutzt werden, durch verschiedene Protokolle und Interpretation der
Ergebnisse, schwierig gestaltet.
37

FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT
3 FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT
Die Folgen von Pharmakoresistenz bei Epilepsien sind erheblich (DEVINSKY
2003; SPERLING 2004; KANNER et al. 2012). Als ein Grund für die
Pharmakoresistenz wird die Überexpression von MDT in der BHS diskutiert, die in
epileptischem Hirngewebe bereits nachgewiesen wurde (TISHLER et al. 1995;
SISODIYA et al. 1999; DOMBROWSKI et al. 2001; ARONICA et al. 2003).
Vermutungen zufolge könnte das vermehrte Auftreten dieser Transporter in der BHS
u.a. auch durch die Antiepileptika selbst hervorgerufen werden (BAUER et al. 2007;
HARTZ et al. 2008; LOMBARDO et al. 2008).
Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die MDT-Hypothese, die eine der
favorisiertesten Erklärungen für die Pharmakoresistenz darstellt. Ausgangspunkt für
das Promotionsprojekt waren Untersuchungen an Darm- und Leberzellen, in denen
eine Induktion von Pgp durch Antiepileptika nachgewiesen wurde (SCHUETZ et al.
1996; MARTIN et al. 2008). Ich konnte mit In-vitro-Untersuchungen bereits zeigen,
dass die Behandlung mit bestimmten Antiepileptika zu einer Induktion der Pgp-
Funktionalität und Expression in den Rattenhirnendothelzelllinien GPNT und RBE4
führt (NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Daraus ergab sich die Frage, ob Antiepileptika
auch in Hirnkapillarendothelzellen humanen Ursprungs zur Pgp-Induktion führen. Für
die Bearbeitung des Themas wurde die immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3
eingesetzt, die aus reseziertem Gewebe des Temporallappens einer
therapieresistenten Epilepsiepatientin gewonnen wurde (WEKSLER et al. 2005). Mit
diesen Zellen besteht nicht nur die Nähe zum Thema der Pharmakoresistenz bei
Epilepsiepatienten, sondern auch zur MDT-Hypothese, die die Überexpression von
MDT in der BHS für die Pharmakoresistenz verantwortlich macht.
Ein weiterer wichtiger Aspekt, der in diesem Projekt untersucht werden sollte,
war die Etablierung eines In-vitro-BHS-Modells mit humanen Zellen, das sensitiv
genug ist, den Transport von Antiepileptika zu untersuchen. Mehrere Studien
belegten bereits den Transport von Antiepileptika durch Pgp. Der Nachweis erfolgte
u.a. in der hiesigen Arbeitsgruppe in Epithelzellen der Niere, die aufgrund ihrer
Eigenschaften gut für Transportuntersuchungen geeignet sind (LUNA-TORTÓS et al.
2008 & 2009). Allerdings sind kaum Daten aus Studien mit humanem Gewebe bzw.
Zellen vorhanden, da es lange Zeit keine geeigneten BHS-Modelle gab. Zur
Entwicklung neuer und besserer Modelle für die BHS wurden bereits
38

FRAGESTELLUNGEN UND ZIELE DER ARBEIT
Untersuchungen an hCMEC/D3-Zellen durchgeführt (WEKSLER et al. 2005;
CUCULLO et al. 2008; POLLER et al. 2008; TAI et al. 2009). Dabei zeigte sich die
mögliche Eignung der hCMEC/D3-Zellen für Transportversuche (POLLER et al.
2008; CARL et al. 2010). Derartige Versuche an Hirnendothelien humanen
Ursprungs bieten eine vielversprechende Möglichkeit zur Untersuchung der
Pharmakoresistenz bei Epilepsien. Deshalb könnten Transportversuche mit den
hCMEC/D3-Zellen, sofern sie sich für diese Methode als geeignet erweisen, einen
großen Wissensfortschritt ermöglichen und zur Klärung beitragen, ob Antiepileptika
auch durch MDT in Hirnendothelzellen humanen Ursprungs transportiert werden.
Zusätzlich zu den Experimenten mit den immortalisierten Zelllinien sollte zur
Gewinnung von Primärkulturen Hirnendothel aus der Ratte entnommen werden.
Diese Primärzellen sollten ebenfalls als Transportmodell eingesetzt werden, um den
Transport von Antiepileptika in primären Zellen zu untersuchen. Durch den Einsatz
von immortalisierten Zelllinien und Primärkulturen sollte unter Berücksichtigung von
Speziesunterschieden untersucht werden, welche Antiepileptika Substrate von MDT
an der BHS sind, und welche in der Lage sind, die Funktion von
Transporterproteinen zu beeinflussen. Aufgrund dieser Kenntnisse könnte eine
gezieltere und effektivere Epilepsiebehandlung möglich sein.
39

MATERIAL UND METHODEN
4 MATERIAL UND METHODEN
Hinweis:
Im Anhang befinden sich die ausführlichen Protokolle der nun im Folgenden
beschriebenen Methoden. Weiterhin sind alle verwendeten Substanzen,
Verbrauchsmaterialien und Geräte samt der jeweiligen Bezugsquelle sowie die
Zusammensetzungen verwendeter Puffer und Lösungen im Anhang aufgelistet.
4.1 Immortalisierte Zelllinien
Für die vorliegende Arbeit wurden drei verschiedene immortalisierte Zelllinien
verwendet (hCMEC/D3, GPNT und RBE4) sowie Primärkulturen aus dem
Rattenhirnendothel.
GPNT- und RBE4-Zellen wurden freundlicherweise von Prof. F. Roux
(INSERM U26, Unité de Neuro-Pharmaco-Nutrition, Hôpital Fernand Widal, Paris,
Frankreich), die hCMEC/D3-Zellen von Dr. P.-O. Couraud (The Cochin Institute:
INSERM (Unit 1016), CNRS (UMR 8104) und Descartes Universität Paris,
Frankreich, UPD (UMR-S 1016)) zur Verfügung gestellt.
4.1.1 Humane Hirnkapillarendothelzellen: hCMEC/D3
Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 (human Cerebral
Microvessel Endothelial Cells) wurde im Zuge einer chirurgischen Entfernung des
epileptischen Fokus aus dem Gewebe des Temporallappens einer
pharmakoresistenten Epilepsiepatientin gewonnen (WEKSLER et al. 2005). Die
Zellen wurden mittels einer sequentiellen lentiviralen Transduktion mit hTERT
(human telomerase catalytic unit) und SV40 T-Antigen transfiziert. Nach folgenden
Klonierungsschritten wurde der Klon hCMEC/D3 für die Entwicklung der Zelllinie
verwendet. Er zeigte die Expression der Endothelial-Marker PECAM-1, ß-Catenin,
ZO-1 und Willebrand-Faktor.
Die Zellen zeigen in Kultur Kontaktinhibition, Charakteristika der BHS wie
Expression von Tight junction-Proteinen sowie der Multidrug-Transporter Pgp, MRP1
und BCRP (WEKSLER et al. 2005). Diese Transporterproteine befähigen die Zellen,
aktiv Substanzen herauszutransportieren. Sie gelten deshalb als geeignetes
Werkzeug für Untersuchungen der Entzündungs- und Infektionsantworten und der
Funktion der BHS (POLLER et al. 2010; FASLER-KAN et al. 2010; DANIELS et al.
2012). Es gibt erste Untersuchungen zur Eignung der hCMEC/D3-Zellen als BHS-
40

MATERIAL UND METHODEN
Modell für Transportuntersuchungen (POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). Diese
Anwendung wird aber kontrovers diskutiert (URICH et al. 2012). Weiterhin wurden
bereits Studien zu Ko- oder Trikulturen mit dieser immortalisierten Zelllinie
durchgeführt, die die Optimierung von In-vitro-BHS-Modellen durch die Kultivierung
mit Astrozyten und Perizyten aufzeigen (HATHERELL et al. 2011).
Die Hirnkapillarendothelzellen wurden in folgendem Medium kultiviert:
- EBM-2 Medium
- 5 % (v/v) fetales Kälberserum
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)
- 1 % Chemically defined Lipid Concentrate (1/100)
- 10 mM HEPES (1 M)
- 5 µg/ml Ascorbinsäure
- 1,4 µM Hydrocortison
- 1 ng/ml basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach WEKSLER et al. (2005).
Für die Verwendung in Transport-Assays, für die dichte Monolayer der Zellen
eine Notwendigkeit darstellen, wurden vergleichende Untersuchungen mit Seren
unterschiedlicher Herkunft durchgeführt. Dazu wurden ein nicht-standardisiertes und
ein standardisiertes fetales Kälberserum sowie humanes Serum zur Kultivierung der
Zellen auf den Inserts verwendet. Unter den im Folgenden beschriebenen
Bedingungen für die Transportversuche wurden allerdings keine Unterschiede
festgestellt, sodass die hCMEC/D3-Zellen für Transportstudien mit nichtstandardisiertem
Serum bovinen Ursprungs kultiviert wurden. Welches Serum für die
einzelnen Versuche, die im Abschnitt Ergebnisse dargestellt sind, verwendet wurde,
ist angegeben.
4.1.2 Rattenhirnkapillarendothelzellen: GPNT
Diese immortalisierten Zellen stammen von einer gut charakterisierten
Endothelzelllinie (GP8) aus Rattenhirn (GREENWOOD et al. 1996). Diese wurden
mit einem Puromycin-Resistenzgen-enthaltenden Plasmid transfiziert und nach GP8
und der Firma NeuroTech S:A: benannt. Das Zytostatikum Puromycin diente bei
dieser Zelllinie der Selektion Pgp-exprimierender Zellen. Zudem führt es zu einer
verstärkten Pgp-Expression (DEMEUSE et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit
41

MATERIAL UND METHODEN
wurde Puromycin abgesehen von der Behandlung lediglich über die ersten zwei
Passagen dem Medium zugefügt.
RÉGINA et al. (1999) wiesen für diese Endothelzelllinie nach, dass sie
morphologische Kriterien und Eigenschaften der BHS zeigt. Dies und die
Überexpression der Multidrug-Transporter waren bei der Auswahl dieser Zelllinie
ausschlaggebend.
Das zur Kultivierung der GPNT-Zellen verwendete Medium bestand aus:
- MEM + GlutaMAX-I/Ham‘s F-10 + GlutaMAX-I im Verhältnis 1:1
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert; 30 min bei 56 °C
hitzeinaktiviert)
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
- 1 ng/ml bFGF
- 5 µg/ml Puromycin
Das Zytostatikum Puromycin wurde lediglich über die ersten Passagen nach
Auftauen als Mediumszusatz verabreicht und anschließend abgesetzt.
Die Zusammensetzung des Medium wurde mit Modifikationen RÉGINA et al.
(1999) nachempfunden.
4.1.3 Rattenhirnkapillarendothelzellen: RBE4
RBE4-Zellen (Rat Brain Endothelial cells) wurden ebenso wie GPNT-Zellen
aus Rattenhirnendothel gewonnen, allerdings handelt es sich hierbei um eine andere
Endothelzelllinie. Diese wurde durch die Transfektion mit einem E1A-Adenovirusenthaltenden
Plasmid immortalisiert (ROUX et al. 1994) und zeigte den Phänotyp
von Endothelien. RBE4-Zellen stellen eine etablierte Zelllinie dar und werden als ein
In-vitro-Modell der BHS verwendet (ROUX et al. 1994). Des Weiteren weisen diese
Zellen Eigenschaften auf, die auch von Hirnendothelien in vivo gezeigt werden
(ROUX & COURAUD 2005; ASCHNER et al. 2006). Die Zellen zeigen ähnliche
Charakteristika wie Primärzellkulturen, z.B. die Expression spezifischer Endothel-
Marker (z.B. Alkalische Phosphatase ALP). Zudem konnte die Expression des
Glukose-Transporters GLUT1 und der Effluxpumpe Pgp für RBE4-Zellen
nachgewiesen werden (BEGLEY et al. 1996; RÉGINA et al. 1998). Beide Transporter
kommen in der BHS vor.
Die RBE4-Zellen wurden in folgendem Medium kultiviert:
- MEM + GlutaMAX-I/Ham’s F-10 + GlutaMAX-I (1:1)
42

MATERIAL UND METHODEN
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht standardisiert; 30 min bei 56 °C
hitzeinaktiviert)
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
- 1 % (v/v) L-Glutamin (200 mM)
- 1 ng/ml bFGF
Die Zusammensetzung des Mediums erfolgte nach BEGLEY et al. (1996).
Sowohl GPNT- als auch RBE4-Zellen weisen typische Marker der BHS auf.
Aufgrund fehlender oder nur in geringen Maß ausgeprägter parazellulärer
Begrenzungen sind transendotheliale Permeabilitätsversuche und Transport-Assays
nicht möglich (ROUX & COURAUD 2005). GPNT- und RBE4-Zellen können aber für
Kumulations-Assays eingesetzt werden, die die Funktionalität zu untersuchender
Transporter wiedergeben.
4.1.4 Primäre Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten der Ratte
Da immortalisierte Zellen Veränderungen im Vergleich zum Ursprungsgewebe
aufweisen können, und diese sich auch auf die Ausbildung der Tight junctions und
somit die Barriere-Eigenschaften auswirken können, werden seit langem
Primärkulturen der Hirnkapillarendothelien verschiedener Spezies als In-vitro-
Modelle der BHS verwendet (FRANKE et al. 2000). Es ist bekannt, dass Astrozyten
durch die Induktion von Tight-junction-Proteinen zu einem dichten Zellmonolayer
beitragen (JELIAZKOVA-MECHEVA & BOBILYA 2003; HATHERELL et al. 2011).
Deshalb wurden Studien zu Kokulturen von Endothelzellen und Astrozyten
durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Primärkulturen des Hirnkapillarendothels,
welche im Weiteren rBCEC (rat Brain Capillary Endothelial Cells) genannt werden,
und der Astrozyten der Ratte eingesetzt.
4.1.4.1 Tierhaltung
Es wurden zwei verschiedene Rattenstämme, CD ® -IGS- und Wistar-Ratten im
Tierstall des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover gezüchtet. Die Tiere wurden nach
Geschlechtern getrennt in verschiedenen Käfigen aber im gleichen Tierraum
gehalten. Die initialen Zuchttiere wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland)
bezogen. CD ® -IGS-Ratten entsprechen dabei Sprague-Dawley-Ratten. Bei beiden
43

MATERIAL UND METHODEN
verwendeten Rattenstämmen handelte es sich um Auszuchtstämme. Die für die
Präparation benötigten Tiere (Versuchstiere) stammten aus zwei Generationen der
institutseigenen Zucht. Wasser und Futter in Form von Pellets (Altromin 1324
Standarddiät, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) standen den Tieren ad libitum zur
Verfügung. Einmal wöchentlich wurden die Tiere in neue Käfige mit frischem Einstreu
umgesetzt. Die Auswechslung des Futters und Wassers erfolgte einmal bzw.
zweimal pro Woche. Die Tiere wurden bei einer Lufttemperatur von 20-24 °C und
einer Luftfeuchtigkeit von 50–60 % gehalten. Zwischen 06:00 Uhr und 18:00 Uhr
waren die Tiere einer 12-stündigen Hellphase mit einer Leuchtstärke von 19–30 Lux
in den Makrolonkäfigen ausgesetzt. Es wurden maximal zwei Generationen der
Ratten gezüchtet.
4.1.4.2 Präparation des Hirnkapillarendothels
Für die Präparation des Endothelgewebes wurden 2–3 Wochen alte Ratten
verwendet. Die Präparation erfolgte mit leichten Modifikationen nach Protokollen von
RÉGINA et al. (1999) und PERRIÈRE et al. (2005). Pro Präparation wurden
abhängig von Wurfgröße und benötigter Zellzahl 5–16 Tiere nach CO 2 -Narkose
dekapitiert. Die Köpfe wurden kurz in 70 %igen Ethanol getaucht und bis zur
weiteren Aufarbeitung auf Eis gehalten. Alle nun folgenden Schritte fanden unter der
Sterilwerkbank statt. Die Schädel wurden eröffnet. Die Gehirne wurden
herauspräpariert und in eiskalter PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin auf Eis
gesammelt. Das Stammhirn, der Plexus und das Kleinhirn wurden abgetrennt und
die Meningen mittels Pinzette, Filterpapier und Wattestäbchen entfernt. Die Cortices
wurden in eine neue Petrischale mit frischer PBS + 1 % Penicillin/Streptomycin
überführt. Anschließend wurde die Lösung abgesaugt und die Cortices mit Skalpellen
zu einer homogenen Masse zerkIeinert und für 1,5 h in einem 37 °C warmen
Wasserbad mit 15 ml einer Enzymlösung (DMEM/F-12, Dispase II, DNAse I,
Collagenase II und Penicillin/Streptomycin (Volumina und Konzentrationen siehe
Anhang S. 210) inkubiert. Das Gemisch wurde während der Inkubation mehrere Male
geschwenkt, um einen gleichmäßigen Verdau des Gewebes zu gewährleisten. Zum
Stoppen der Reaktion wurde der Verdau nach der Inkubationszeit mit 20 ml einer
20 % (w/v) Lösung von Bovinem Serumalbumin (BSA) versetzt, auf zwei 50 ml-
Röhrchen verteilt und für 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand,
der u.a. Myelin enthält, wurde dekantiert, die verbliebenen Pellets erneut mit der
44

MATERIAL UND METHODEN
Enzymlösung (5 ml) versetzt, in einem Falcon-Röhrchen gesammelt und 1 h im
Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Einige Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit
wurde eine Nylonmembran (Porendurchmesser = 80 µm) 3x mit je 5 ml DMEM/F-12
Medium gespült. Der Verdau wurde anschließend durch das Nylongewebe filtriert
und die zurückgehaltenen Kapillarzellen 3x vorsichtig mit DMEM/F-12 Medium
gewaschen. Die Zellen wurden dann mit Medium vom Filter gespült und auf 2-3
kleine Zellkulturschalen (A = 28 cm 2 ) à 5 ml verteilt. Anschließend wurde der
Zellsuspension Puromycin in der Konzentration von 4 µg/ml zugefügt und die Zellen
im Brutschrank kultiviert.
Die Zusammensetzung des Mediums wurde Zhang et al. (2006) entnommen.
- EBM-2 Medium
- 20 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
- 1 mM HEPES
- 1 % (v/v) L-Glutamin (Stocklösung: 200 mM)
- 500 ng/ml Hydrocortison.
In diesem Medium wurden die Zellen über die ersten drei Tage kultiviert. Nach
drei Tagen wurden die Zellen mit PBS gespült und im gleichen Medium mit dem
Zusatz von 2 ng/ml bFGF bis zum Erreichen der Konfluenz und der Aussaat für
Transport- und Kumulationsstudien weiter kultiviert.
4.1.4.3 Präparation der Astrozyten
Die Präparation primärer Astrozyten erfolgte mit Modifikationen nach Zhang et
al. 2006. Die Astrozyten wurden aus neonatalen Ratten (P0–P3) gewonnen. Nach
der CO 2 -Narkose der Tiere wurden diese dekapitiert. Die Köpfe wurden mit 70 %igen
Ethanol weitestgehend desinfiziert und anschließend auf Eis gehalten. Die folgenden
Arbeitsschritte fanden unter der Sterilbank statt.
Die Schädel wurden eröffnet. Die Gehirne wurden herauspräpariert,
Stammhirn und Kleinhirn entfernt und in eiskalter PBS + 2 % Penicillin/Streptomycin
auf Eis gesammelt. Anschließend wurden die Meningen und der Hippocampus
entfernt. Die Cortices wurden in ein 15 ml-Röhrchen mit frischer PBS + 2 %
Penicillin/Streptomycin überführt und weiter auf Eis gelagert. Der Puffer wurde
abgesaugt und die Cortices in 10 ml der Dissoziationslösung (DMEM Low Glucose,
10x Trypsin/EDTA-Lösung, HEPES, DNAse I und Penicillin/Streptomycin; Volumina
45

MATERIAL UND METHODEN
und Konzentrationen siehe Anhang S. 212) aufgenommen und mit einer 10 ml-
Pipette homogenisiert. Das Gemisch wurde in einem 37 °C warmen Wasserbad für
30 min inkubiert und dabei regelmäßig geschwenkt. Der Verdau wurde im Folgenden
sorgfältig mit einer 10 ml-Pipette dissoziiert und bei 400xg für 5 min zentrifugiert. Der
Überstand wurde dekantiert, das Pellet in 10 ml des Astrozyten-Kulturmediums
resuspendiert und erneut für 5 min bei 200xg zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgesaugt und das Pellet in 1 ml/Gehirn aufgenommen. Die Zellsuspension wurde
zunächst durch ein Nylon-Gewebesieb mit 70 µm filtriert, anschließend erfolgte die
Filtration durch ein feinmaschigeres Sieb (Porendurchmesser 40 µm). Das Filtrat
wurde auf 25 cm 2 -Zellkulturflaschen verteilt (3–4 Gehirne/Flasche) und im
Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag erfolgte die mikroskopische Kontrolle. Wenn
die Astrozyten nahezu konfluent (konfluent = vollständige Bedeckung der
Plattenoberfläche mit Zellen) waren, wurden diese zur Entfernung der
Oligodendrozyten und Mikroglia für einige Stunden bzw. über Nacht bei bis zu 250
Umdrehungen/min im Brutschrank geschüttelt.
Die Astrozyten wurden in nachstehendem Medium kultiviert:
- DMEM Low Glucose
- 10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)
- 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Nach drei Tagen wurden die Zellen mit PBS gespült und im gleichen Medium mit
dem Zusatz von 2 ng/ml bFGF bis zum Erreichen der Konfluenz und der Aussaat für
Transport- und Kumulationsstudien weiter kultiviert.
4.2 Kultivierung der Zellen
Sämtliche Arbeitsschritte, welche das Öffnen von Medium- und
Zellkulturgefäßen erforderten, wurden zur Vermeidung von Kontaminationen unter
einer Sterilwerkbank vorgenommen. Des Weiteren wurden alle verwendeten
Chemikalien, Puffer und Lösungen sterilfiltriert oder autoklaviert. Alle Gefäße und
Verbrauchsmaterialien wurden vor der Verwendung unter der Sterilbank mit 70 %
Ethanol desinfiziert.
Die Kultur aller verwendeten Zellen erfolgte in einem CO 2 -Brutschrank bei
einer Temperatur von 37 °C, einer relativen Luftfeuchte von 95 % und einem CO 2 -
Gehalt von 5 %. Sofern Probenentnahmen für den Western Blot erfolgten (siehe
Abschnitt 4.4), wurden die Zellen nach Erreichen der Konfluenz für weitere 5–8 Tage
46

MATERIAL UND METHODEN
in Kultur gehalten, geerntet und bis zur Aufarbeitung im Western Blot bei -20 °C
gelagert.
Für Kumulations- und Transportuntersuchungen wurden die Zellen nach dem
Auftauen maximal 15-mal passagiert. Die immortalisierten Zellen wurden jedoch
frühestens ab der dritten Passage für den Versuch ausgesät. Die Primärzellen
wurden maximal zweimal passagiert bevor sie für Untersuchungen eingesetzt
wurden. Eine Übersicht der der Testsubstanzen und eingesetzten Inhibitoren kann
Tabelle 4.1 (siehe S. 49 f.) entnommen werden.
4.2.1 Passagierung
Der Wechsel des Kulturmediums wurde alle 2-3 Tage vorgenommen. Dies
geschah als bloßer Austausch des Mediums oder nach Erreichen von 80-90 %iger
Konfluenz der Monolayer im Rahmen einer Zellpassagierung.
Hierfür wurde nach Absaugen des Kulturmediums sterile PBS auf die Zellen
gegeben, für ca. 10 min im Brutschrank inkubiert, der Puffer wieder entfernt und 2-3
ml einer 1:5 mit PBS verdünnten Trypsin/EDTA-Lösung (Endkonzentration: 0,1 %
Trypsin, 0,04 % EDTA) auf die Zellen pipettiert und wiederum bis zu 10 min im
Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgten die Aufnahme der sich nun sichtbar
ablösenden Zellen in frischem Medium in einem Falcon-Röhrchen und die 5-minütige
Zentrifugation bei 800xg. Nach Absaugen des Überstands wurde das Zellpellet in
frischem Medium resuspendiert und die Zellsuspension auf neue Kulturgefäße
gegeben. Die Verdünnung der Zellsuspension in Medium erfolgte abhängig von der
Zelllinie im Verhältnis 1:10 bis 1:80. Bis zur nächsten Passage der Zellen erfolgte alle
2-3 Tage ein Mediumswechsel.
Bei allen verwendeten immortalisierten Zelllinien handelt es sich um adhärente
Zellen. Für die Anheftung benötigten alle Zellen vor der Aussaat eine Beschichtung
der Zellkulturgefäße mit Collagen Typ I. Dazu wurde das pulverförmige Collagen
zunächst in steriler 0,2 %iger Essigsäure gelöst, um eine Stocklösung mit einer
Konzentration von 2 mg/ml zu erhalten. Anschließend wurde die Lösung 1:20 (v/v) in
sterilem PBS verdünnt. Die Collagenlösung wurde auf die Schalen pipettiert, für eine
Stunde im Brutschrank inkubiert, wieder abgenommen und unter der Sterilbank
getrocknet. Die Kultivierung der Astrozyten erfolgte auf ebenfalls mit Collagen I
beschichteten Zellkulturgefäßen.
47

MATERIAL UND METHODEN
Die Primärhirnendothelzellen benötigten ebenfalls eine Beschichtung, um sich
an den Zellkulturgefäßen anheften zu können. Collagen Typ IV wurde dazu in A.
bidest. gelöst, sodass eine Stocklösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml
entstand. Diese wurde in 1:10 in A. bidest. verdünnt und auf die Zellkulturschalen
gegeben. Diese wurden 1 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das
Collagen abgenommen und die Schalen wurden unter der Sterilbank getrocknet. Für
Transportstudien mit den primären Zellen wurden die Transwell-Inserts vor der
Aussaat der Zellen mit einem Gemisch aus Collagen Typ IV und Fibronectin (1:2)
beschichtet. Dies erfolgte für 2 h bei 37 °C. Das Gemisch wurde anschließend von
den Transwell-Inserts abgesaugt und diese unter der Sterilwerkbank getrocknet.
4.2.2 Kryokonservierung
Zum Einfrieren wurden die Zellen nach Abtrypsinierung und Zentrifugation
(s.o.) in fetalem Kälberserum, welches mit 10 % DMSO versetzt wurde,
aufgenommen und resuspendiert. Die Zellen einer 78 cm 2 großen Petrischale
wurden dazu in etwa 5 ml Einfriermedium aufgenommen und auf 5 Kryoröhrchen (à 1
ml) verteilt. Anschließend wurden die Röhrchen in einem vorgekühlten Behältnis über
Nacht bei -80 °C gelagert, um am nächsten Tag in einen Flüssigstickstoffbehälter (-
196 °C) für die permanente Lagerung überführt zu werden.
4.2.3 Auftauen der Zellen
Die Kryoröhrchen wurden zu diesem Zweck kurz in einem 37 °C warmen
Wasserbad geschwenkt. Der flüssige Inhalt wurde in ein 15 ml-Röhrchen überführt
und nach Zugabe von 5 ml warmen Medium bei 800xg zentrifugiert. Das Medium
wurde anschließend abgesaugt, die Zellen in 5 ml frischem Medium aufgenommen
und in einer kleinen Petrischale (A = 28 cm 2 ) kultiviert.
4.3 Untersuchung der Funktionalität
Zur Untersuchung der Funktionalität des Multidrug-Transporters Pgp wurden
in der vorliegenden Arbeit zwei Methoden angewendet: der Kumulations-Assay und
der Transport-Assay.
Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über alle verwendeten Substanzen in den
funktionalen Assays, wobei der mögliche Einfluss auf Pgp aufgezeigt wird.
48

MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 4.1: Übersicht über verwendete Substanzen zur Behandlung der Zellen für
Kumulations-Assays und der Untersuchung in Transportversuchen.
Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet
Einfluss
auf Pgp
Digoxin K, T DMSO/Opti-
MEM ® 10 nM Glykosid Substrat
Rhodamin123 K, T Ethanol
2 µM
5 µM Fluoreszenzfarbstoff Substrat
10 µM
Verapamil K, T Ethanol/Opti-
MEM ® 10 nM Calciumantagonist Substrat
Dexamethason K A. bidest.
0,5 µM
1 µM
5 µM
Glukokortikoid Induktor
10 µM
Doxorubicin K PBS
0,23 µM
0,46 µM Zytostatikum Induktor
0,92 µM
Glutamat K Medium 100 µM
Erregender
Neurotransmitter
Induktor
Puromycin K Medium
0,5 µM
1 µM
2,65 µM Zytostatikum Induktor
5,3 µM
10,6 µM
Rifampicin K
2,5 µM
A. bidest.
5 µM
(mit NaOH auf
10 µM
pH 12
20 µM
eingestellt)
50 µM
Zytostatikum Induktor
Vincristin K A. bidest.
20 nM
40 nM
Zytostatikum Induktor
49

MATERIAL UND METHODEN
Substanz Vehikel Konzentration Anwendungsgebiet
Einfluss
auf Pgp
Carbamazepin K Ethanol
10 µM
30 µM
50 µM
Antiepileptikum ?
100 µM
Levetiracetam K A. bidest.
100 µM
300 µM
Antiepileptikum Substrat
Phenobarbital K Medium
100 µM
300 µM
Antiepileptikum Substrat
Phenytoin K Ethanol
10 µM
30 µM
50 µM
Antiepileptikum Substrat
100 µM
Topiramat K A. bidest.
30 µM
100 µM Antiepileptikum Substrat
300 µM
Valproat K A. bidest.
50 µM
100 µM Antiepileptikum ?
300 µM
Tariquidar K, T DMSO 0,5 µM Inhibitor Inhibitor
Valspodar Ethanol/Tween
(PSC833) T 80 (9:1)
10 µM Inhibitor Inhibitor
K
T
Substanzen, die im Kumulations-Assay eingesetzt wurden
Substanzen, die im Transport-Assay eingesetzt wurden
Die Substrate Digoxin und Rhodamin 123, die Pgp-Induktoren Dexamethason,
Puromycin und Rifampicin und die Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und
Valproat wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim bezogen, das radioaktiv markierte
Digoxin von Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim, Valspodar von Novartis
Pharma (Nürnberg), Doxorubicin von ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach, Phenobarbital
von Serva, Heidelberg. Tariquidar wurde freundlicherweise von Xenova Ltd.
(Berkshire, UK), Levetiracetam von UCB Pharma (Brüssel, Belgien) und Topiramat
vom R. W. Johnson Research Institute (Pennsylvania, USA) zur Verfügung gestellt.
50

MATERIAL UND METHODEN
Radioaktiv markiertes 3 H-Digoxin wurde mit unmarkiertem Digoxin, welches
zuvor in DMSO gelöst wurde, gemischt und in serumfreiem Medium (Opti-MEM ® )
aufgenommen. Die Endkonzentration betrug 0,1 % DMSO. Verapamil wurde
ebenfalls mit unmarkiertem Verapamil gemischt. Dieses wurde vorher in Ethanol
gelöst und in Opti-MEM ® aufgenommen. Die Endkonzentration des Ethanols betrug <
0,1 %. Sofern Ethanol als Lösungsmittel für einige Antiepileptika eingesetzt wurde,
betrug die Endkonzentration ≤ 0,5 %.
4.3.1 Kumulations-Assay
Der Kumulations-Assay, auch Uptake-Assay genannt, diente in dieser Arbeit
der Überprüfung der Funktionalität von Pgp. Das Prinzip dieser Methode besteht in
der Messung bestimmter markierter Substrate in den Zellen. Bei diesen Stoffen, die
Substrate für Pgp sind, kann es sich um Fluoreszenzfarbstoffe oder auch um
radioaktiv markierte Substrate handeln. Man macht sich hier Fähigkeit des Pgps
zunutze, Substanzen aktiv aus den Zellen zu pumpen. Aus diesem Grund kann
immer nur eine gewisse Menge Substrat von den Zellen aufgenommen werden.
Aussaat der Zellen
Die Zellen wurden für alle Kumulationsversuche so ausgesät, dass sich nach
2-3 Tagen konfluente Monolayer gebildet haben. Die Ablösung der Zellen erfolgte
wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben. Die Kultivierung der Zellen für Kumulations-
Assays erfolgte auf 6Well-Platten mit einem Volumen von 3ml/Well. In zwei
Kumulationsversuchen erfolgte die Aussaat der rBCEC-Zellen auf 12Well-Platten mit
einem Volumen von 1,5 ml Zellsuspension pro Well.
Substanzbehandlung der Zellen
Die Behandlung der Zellen begann am 3. Tag der Konfluenz. Bei jedem
Behandlungszyklus wurden neben den zu testenden Antiepileptika immer eine
Kontrollgruppe und bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren mitgeführt, um
Aussagen zur Sensitivität des Assays machen zu können. Dazu wurden zu Beginn
dieser Versuche verschiedene Induktoren für Pgp in den einzelnen Zelllinien
ausgetestet und die Substanz, die eine reproduzierbare Induktion der Pgp-
Funktionalität erzielte, für weitere Versuche verwendet. Angaben zu den
verwendeten Substanzen und Konzentrationen sind Tabelle 4.1 zu entnehmen.
51

MATERIAL UND METHODEN
Die Dauer der Behandlung betrug 3 Tage. Dabei wurde täglich immer zum
gleichen Zeitpunkt das Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem Medium,
welches die für die jeweilige Behandlungsgruppe bestimmte Substanz enthielt,
versorgt. Die Kontrollgruppen wurden stets nur mit Medium ohne weitere Zusätze
behandelt. Ausnahmen bildeten Versuche, bei denen im Kontrollmedium die Vehikel
(z.B. Ethanol) der zu testenden Antiepileptika oder auch Induktoren mitgeführt
wurden. Wenn zwischen den Kontrollen keine Unterschiede nachweisbar waren,
wurden diese Kontrollgruppen in der Statistik zusammen ausgewertet. DMSO wurde
als Lösungsmittel für die einzelnen Substanzen vermieden, da es ab einem längeren
Behandlungszeitraum induzierend auf die Pgp-Expression wirkt (AMBROZIAK et al.
2010).
Durchführung des Kumulations-Assays
Im Anschluss an die Behandlungsdauer der Zellen (i.d.R. 6 Tage nach
Erreichen der Konfluenz) und nach mikroskopischer Kontrolle der Zellen wurden
diese für den Kumulationsversuch auf ein serumfreies Medium umgestellt (Opti-
MEM ® ), um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verhindern. Dazu
wurde das Behandlungsmedium entfernt und die Zellen für eine Stunde mit Opti-
MEM ® mit und ohne den spezifischen Pgp-Inhibitor Tariquidar (0,5 µM) auf einem
Schüttler inkubiert. Tariquidar sollte in Zellen, die funktionelles Pgp exprimieren, zur
Inhibition dieses Transporters und somit zu einem erhöhten Gehalt des eingesetzten
Substrats in den Zellen führen.
Nach Ablauf dieser Vorinkubation wurde das Medium abgesaugt und durch
Medium mit dem Pgp-Substrat ( 3 H-Digoxin oder Rhodamin 123) ersetzt und für
weitere 2 Stunden inkubiert. In dieser Zeit konnte das Substrat in Abhängigkeit von
der Pgp-Funktionalität unter Behandlung in die Zellen gelangen und dort verbleiben.
Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde der Versuch durch Absaugen des
Mediums und Waschen mit eiskaltem PBS zügig abgestoppt. Die Zellen wurden
dann von den Wells geschabt, mit Lysispuffer (Zusammensetzung siehe Anhang S.
213) aufgeschlossen und nach Zentrifugation der Messung zugeführt. Abhängig vom
Substrat wurde der Zellinhalt mit einem Szintillationszähler (Liquid Scintillator System
LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) oder Fluoreszenzmessgerät (BMG
Labtech GmbH, Offenburg) gemessen.
52

MATERIAL UND METHODEN
Bestimmung der Proteinkonzentration
Der Proteingehalt der Zellen wurde mit Hilfe des Bicinchonsäure-Assays
(Bicinchonicic Acid BCA, Thermo Scientific, Rockford, USA) ermittelt. Dieser beruht
ähnlich wie der Bradford-Assay auf der kolorimetrischen und quantitativen Messung
der Proteinmenge. Dazu wird sich ebenfalls die Biuret-Reaktion zunutze gemacht,
die auf der Reduktion von Kupfer-Ionen in alkalischer Lösung beruht (Cu 2+ Cu + ).
BCA ist ein Chelatbildner. Bei der Bindung von zwei BCA-Molekülen um ein Cu + -Ion
kommt es zu einer Violettfärbung. Dies ist ein wasserlöslicher Komplex, der die
stärkste Absorption bei 562 nm aufweist.
Als Standard für die Ermittlung der Proteinkonzentration der Proben wurde
BSA verwendet. Aus verschiedenen Konzentrationen an BSA-Lösungen wurde eine
Eichkurve erstellt. Standardmäßig wurden alle Proben einmal unverdünnt und 1:2
verdünnt mit einem Volumen von 10 µl auf eine 96Well-Platte aufgetragen. Die
Reaktionslösung aus Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung wurde auf jede
Standardkonzentration und jede Probe aufgetragen (à 200 µl) und für 30 min bei
37 °C dunkel inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte.
Nach Ermittlung der Eichkurve wurden die Konzentrationen der Proben anhand der
Kurve berechnet und in mg/ml angegeben.
Berechnung des Substratgehalts der Proben
Nach der Berechnung der Proteinkonzentration wurde der Substratgehalt auf
diese bezogen. Der Zellinhalt wurde analysiert und die erhaltenen Werte für das
Substrat 3 H-Digoxin als DPM/mg Protein (decays per minute; Zerfallsrate, bezogen
auf den Proteingehalt) und für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als
Fluoreszenz/mg Protein angegeben.
4.3.2 Transport-Assay
Aussaat der Zellen
Die Zellen wurden für Transportversuche auf Polyester- oder Polycarbonat-
Membranen der Hersteller Corning Costar Corporation (Transwell ® ) und Greiner Bio-
One GmbH (ThinCerts ® ) kultiviert. Eine Übersicht einzelner Parameter wie
Porengröße und dergleichen sind der Tabelle 4.2 zu entnehmen. Die Membran-
Inserts der Multiwell-Platten unterteilen die Zellkulturschalen in eine apikale und eine
basolaterale Kammer (siehe Abschnitt 2.8.2, Abbildung 2.5, S. 33) und erlauben so
53

MATERIAL UND METHODEN
die Quantifizierung und den Vergleich der Substratkonzentrationen in beiden
Kammern und lassen Rückschlüsse auf den Transport einer Substanz zu.
Tabelle 4.2: Übersicht zu den Parametern verwendeter Membraneinsätze für die
Transportstudien.
Material
Polyester
Polycarbonat
Polyester
Format
Membrangrößtumsflächdichtkeit
der
Wachs-
Poren-
Sichtbar-
PorenØ
(µm)
(mm) (cm 2 )
(pro cm 2 ) Zellen
Transwell ®
(Corning Costar Corporation)
6Well 24 4,67 0,4 4x10 6 Sichtbar
12Well 12 1,12 0,4 4x10 6 Sichtbar
Schlecht
6Well 24 4,67 0,4 1x10 8 sichtbar
Schlecht
12Well 12 1,12 0,4 1x10 8 sichtbar
ThinCerts ®
(Greiner Bio-One)
Nicht
6Well 24,85 4,254 0,4 1x10 8 sichtbar
12Well 13,85 1,132 0,4 2x10 6 Sichtbar
Die Inserts wurden mindestens eine Stunde vor Aussaat der Zellen mit dem
jeweiligen Medium im Brutschrank inkubiert. Dabei wurden für das 6Well-Format 1,5
ml für die apikale und 2,5 ml Medium für die basolaterale Kammer verwendet. Inserts
im 12Well-Format wurden mit 0,5 ml apikal und 1,5 ml basolateral befüllt. Während
der gesamten Kultivierung wurden diese Volumina für die Inserts beibehalten. Die
Ablösung der Zellen wurde wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben vorgenommen. Die
Zellen wurden für die spätere Vergleichbarkeit vor der Aussaat ausgezählt. Die
Zellzählung erfolgte mit Hilfe einer Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal. Diese weist
eine Zählfläche von 16 mm 2 und eine Tiefe von 0,2 mm auf. Die Zählfläche besteht
aus 16 Großquadraten, die sich jeweils aus 16 Kleinquadraten zusammensetzen. Es
wurde pro Probe ein Volumen von 200 µl ausgezählt. Dazu wurde eine Probe der
Zellsuspension 1:5 mit Medium und Trypanblau verdünnt, wobei stets 40 µl
54

MATERIAL UND METHODEN
Zellsuspension, 120 µl des jeweiligen Kulturmediums und 40 µl Trypanblau
verwendet wurden. Trypanblau hat die Eigenschaft, tote Zellen aufgrund nicht mehr
intakter Zellmembranen blau zu färben und macht es somit möglich, lebende und
tote Zellen voneinander zu unterscheiden. Pro Probe wurden 6 Großquadrate (vier
diagonale und 2 an den gegenüber liegenden Ecken) ausgezählt, dabei wurden
ausschließlich vitale Zellen gezählt. Die Zellzahl/ml wurde mit nachfolgender
Gleichung bestimmt:
gezählte Zellzahl
Zellzahl/ml = x Verdünnungsfaktor (5) x Kammerfaktor (5000)
Anzahl ausgezählter Quadrate
Die Aussaat der hCMEC/D3-Zellen erfolgte mit einer Zellzahl von 50.000
Zellen/cm 2 in einem Volumen von 0,5 ml bzw. 1,5 ml (12Well- bzw. 6Well-Format).
Bei den Primärzellen war die Anzahl der Wells und damit der Umfang des Versuchs
von der Zahl der präparierten Tiere abhängig. Die Zellen, die aus fünf bis sechs
Tieren gewonnen wurden, reichten für 18-24 12Well-Inserts. Die Volumina zur
Aussaat waren die gleichen. Die Zellen bildeten i.d.R. 1–2 Tage nach der Aussaat
konfluente Monolayer und wurden 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz für
Transport-Assays eingesetzt.
Am folgenden Tag wurde die Konfluenz der Zellmonolayer auf den
transparenten Inserts beurteilt und die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen, wobei
nicht angeheftete Zellen entfernt wurden. Alle 2-3 Tage fand ein Mediumswechsel
statt. Um das Ablösen der Zellen durch den Druck der Flüssigkeiten zu vermeiden,
wurde dazu zunächst das Medium der basolateralen Kammer abgesaugt,
anschließend in der apikalen Kammer. Die Zugabe frischen Mediums erfolgte in
derselben Reihenfolge.
Für Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode
wurden die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen auch mit Astrozyten der Ratte kokultiviert.
Dazu wurden zunächst die Astrozyten für die Kontakt-Kokultur auf den Unterseiten
der Membraneinlagen kultiviert. Nach Anheftung dieser Zellen wurden diese noch für
2-3 Tage allein kultiviert. Anschließend erfolgte die Aussaat der
Hirnkapillarendothelien auf der apikalen Seite der Membran. Die Endothelzellen und
Astrozyten wurden mit ihrem jeweiligen Medium kultiviert, auch wenn durch die
Membran eine Vermischung bzw. Verdünnung des jeweiligen Kulturmediums und
55

MATERIAL UND METHODEN
den darin enthaltenen Zusätzen stattfand. Deshalb wurden in einzelnen Versuchen
beide Zelltypen mit dem Medium der jeweiligen Hirnkapillarendothelien kultiviert.
Durchführung des bidirektionalen Transport-Assays
Zur Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 und Digoxin in
hCMEC/D3 und rBCEC wurden bidirektionale Transportstudien durchgeführt. Die
Zellen wurden wie bereits im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ausgesät. Die
Transport-Assays fanden 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz statt. Vor Beginn
des Versuchs wurden die Monolayer mittels Mikroskop auf Unversehrtheit
untersucht. Wie beim Kumulations-Assay erfolgte zunächst die Umstellung der Zellen
auf das serumfreie Medium Opti-MEM ® und die einstündige Vorinkubation der Zellen
mit und ohne Inhibitor bzw. mit und ohne Vehikel des Inhibitors auf dem Schüttler bei
50 Umdrehungen/min. Das Versuchsmedium, das ebenfalls mit Opti-MEM ®
angesetzt wurde, enthielt das entsprechende Substrat bzw. die Testsubstanz sowie
den Inhibitor oder dessen Lösungsmittel. Andere Arbeitsgruppen verwendeten für
ihre Transportstudien den Puffer HBSS, der HEPES (10 mM) und Natriumpyruvat (1
mM) enthielt (CARL et al. 2010). Aus diesem Grund erfolgten weitere
Untersuchungen mit diesem Versuchspuffer.
Zum Ende der Vorinkubation wurde die Messung des transendothelialen
Widerstands vorgenommen. Für Inserts im 6Well-Format erfolgte dies in einer
entsprechend großen Messkammer, für das 12Well-Format mit einer Messpinzette.
Die Messung mit der Pinzette wurde deshalb erforderlich, weil die Messkammer für
das 6Well-Format ausgerichtet ist. Dabei wurde die Messung so durchgeführt, dass
die Pinzette an drei verschiedenen Lokalisationen der Inserts zur basolateralen
Kammer hin eingesetzt und der Mittelwert der drei Messwerte gebildet wurde. Der
TEER wurde bestimmt, indem der Messwert mit der Wachstumsfläche (je nach
Hersteller bzw. Format A=4,67/4,254 bzw. 1,12 cm 2 ) multipliziert und gegebenenfalls
der Mittelwert gebildet wurde.
Für die Inkubation mit der Testsubstanz waren die Volumina je nach Format
apikal: 0,7 bzw. 2 ml und basolateral: 1,5 bzw. 2,7 ml Medium in den Kammern der
12Well- und 6Well-Inserts. Zusätzlich zur TEER-Messung erfolgte die Untersuchung
der Dichtigkeit mittels [ 14 C]-markiertem Mannitol in mindestens einem Insert pro
Zelllinie und Versuchsansatz. Dies diente dazu, die parazelluläre Permeabilität eines
Zellmonolayers zu beurteilen (LUNA-TORTÓS et al. 2008) und sollte einen
56

MATERIAL UND METHODEN
apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (P app ) für Mannitol von der
basolateralen in die apikale Kammer (b-A) von 12 nm/s (nach LUNA-TORTÓS et al.
2008) nicht überschreiten, wobei sich die Einheit aus dem Bezug zur
Wachstumsfläche der Monolayer ergibt. In einigen Transportversuchen wurde die
Permeabilität für Mannitol nicht über die gesamte Versuchsdauer untersucht. Die
Zellen wurden stattdessen am Ende des Versuchs für 60 min mit Mannitol inkubiert.
Anschließend wurde eine Probe entnommen. Eine Berechnung der Steigung ist aus
diesem Grund nicht möglich, weshalb die Angabe für Mannitol dann in %/h erfolgte.
Bei dieser Variante des Transport-Assays wird die Testsubstanz lediglich in
eine der beiden Kammern appliziert. Wurden Inhibitoren mitgeführt, wurden diese in
beide Kammern eingefüllt, dementsprechend wurde das gleiche Volumen des
jeweiligen Lösungsmittels in die Kammern ohne Inhibitor gegeben. Die Entnahmen
der Proben erfolgten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und sind in den Ergebnissen
widergegeben. Die Versuchsdauer betrug aber für die meisten Transport-Assays
entweder 240 oder 360 min, mindestens aber 120 min. Das Probenvolumen für das
6Well-Format betrug immer 100 µl, wobei aus den jeweils kontralateralen Kammern
Ausgleichsvolumina entnommen wurden (apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl). Auf diese
Weise wurden die Flüssigkeitsstände der beiden Kammern gleichgehalten, um den
Druck auf die Zellen zu vermindern. Mannitol hingegen wurde lediglich in die
basolaterale Kammer gegeben, Proben wurden der apikalen Kammer entnommen.
Wenn die Testsubstanzen fluoreszenz-markiert waren, wurde diese direkt zur
Probenentnahme auf eine schwarze 96Well-Platte pipettiert. Handelte es sich um
radioaktiv-markierte Substanzen wurden die Proben in 1,5 ml Eppendorf-Gefäße
pipettiert und bis zur Vorbereitung für die Messung im Szintillationscounter (Liquid
Scintillator System LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) bei +4 °C
gelagert.
Nach Entnahme der letzten Proben wurden die Monolayer erneut
mikroskopisch untersucht und der TEER bestimmt. Sofern radioaktiv markierte
Substanzen eingesetzt wurden, wurde das Medium in entsprechende Behältnisse
umgefüllt und entsorgt.
Die Darstellung der Substanz-Konzentrationen in beiden Kammern erfolgte in
Prozent. Die initiale Konzentration entspricht dabei 100 %. Die Permeabilitäten (P app )
von der basolateralen in die apikale Kammer (b-A) und umgekehrt (a-B) für die
57

MATERIAL UND METHODEN
getesteten Substanzen wurde nach ARTURSSON (1990) berechnet und in nm/s
angegeben.
Gleichung nach ARTURSSON:
P app [nm/s]
=
dQr/dt
A x C 0 x 60
dQr/dt (DPM/min): Steigung der Konzentration über die Zeit in der beprobten Kammer
A: die Wachstumsfläche der Monolayer
C 0 : Initialkonzentration der Substanz zum Zeitpunkt t=0
Der Quotient der Koeffizienten Papp (b-A) und Papp (a-B) entsprach der
Transportratio (TR) einer Substanz. Man spricht von Transport, wenn TR > 1,5 ist.
Ein spezifischer Inhibitor sollte eine deutliche Verminderung der TR im Vergleich zu
den Zellen ohne Inhibitor zeigen.
Durchführung des Konzentrationsgleichgewichts-Transport-Assays
Mit den Pgp-Substraten Digoxin, Rhodamin 123 und Verapamil wurden
ebenfalls Konzentrationsgleichgewichts-Assays (CETA) durchgeführt, um die
Eignung der Zelllinie hCMEC/D3 und der primären rBCEC für Transportversuche
festzustellen. Die Aussaat und Kultivierung erfolgte wie bereits beschrieben. Der
CETA wurde 5-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Vorinkubation
und Messung der TEER-Werte erfolgte genauso wie für den bidirektionalen
Transport-Assay. Im Unterschied zum bidirektionalen Transport-Assay, wurden die
Testsubstanzen in die apikale sowie in die basolaterale Kammer gegeben. Die
Initialkonzentrationen der beiden Kammern waren gleich. Die Proben wurden
zunächst der basolateralen Kammer entnommen (100 µl), anschließend der apikalen
Kammer mit einem Volumen von 130 μl. Die Versuchsdauer betrug auch hier
maximal 360 min. Abhängig von der Quantifizierungs-Methode des Substrats wurden
die Proben entweder direkt auf schwarze 96Well-Platten pipettiert oder in 1,5 ml-
Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bis zur Aufbereitung bei +4 °C gelagert.
Die Daten wurden sowohl für die apikale als auch die basolaterale Kammer in
Prozent der Initialkonzentration über die Zeit dargestellt (LUNA-TORTÓS et al.
2008). Für die Bestimmung des Transports wurden die Mengen der Substanz in der
apikalen mit der in der basolateralen Kammer verglichen. Es wurde von Transport
58

MATERIAL UND METHODEN
einer Substanz ausgegangen, wenn der Gehalt dieser in den beiden Kammern zu
den einzelnen Zeitpunkten signifikant verschieden war.
Für die Überprüfung des Transports wurden spezifische Inhibitoren eingesetzt,
die den Transport hemmen sollten. Für die Beschreibung des Transports bzw. der
Inhibition wurde die Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) des
Konzentrationsanstiegs in der apikalen Kammer in Prozent gegen die Zeit über der
Initialkonzentration berechnet. Die AUC des nachgewiesenen Transports wurde mit
der AUC der Zellen mit spezifischem Inhibitor verglichen. Ein Transport wurde als
spezifisch bewertet, wenn die AUC/h nach Zugabe des Inhibitors um > 50 %
abnahm.
4.4 Untersuchung der Expression: Western Blot
Diese Methode dient der Detektion einzelner Proteine aus einem
Proteingemisch aus Zellen oder Geweben. Bei Western Blot-Analysen werden
elektrophoretisch aufgetrennte Proteine aus dem Trenngel auf einen geeigneten
Träger übertragen. Die Bindung der Proteine an eine Membran, i.d.R. Nitrocellulose
oder Polyvinylidenfluorid (PVDF), erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen und
Wasserstoffbrücken. Dabei bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung
erhalten und einzelne Proteine können über das Prinzip der Antigen-Antikörper-
Bindung detektiert werden. Mit Hilfe des Western Blots ist es möglich, Aussagen
über die Expression gesuchter Proteine zu treffen.
Mit dem Western Blot wurde die Expression von Pgp in den genannten
Zelllinien und Primärkulturen nachgewiesen. Neben dem gesuchten Protein Pgp
wurde in allen Proben die Expression von ß-Aktin bestimmt. Das Strukturprotein ß-
Aktin gehört zu den häufigsten Proteinen und kommt in allen eukaryotischen Zellen
vor. Das Protein ß-Aktin diente als Housekeeper für die Normierung der Pgp-
Expression. Housekeeper sind Proteine, die an den grundlegenden Zellprozessen
beteiligt sind und in gleichem Ausmaß in allen Zellen der Kultur exprimiert werden.
So können Aussagen darüber getroffen werden, ob der Gesamtproteingehalt einer
Probe oder allein der Pgp-Gehalt in den Zellen verändert ist.
Für den Western Blot wurden 15-40 µg Proteinlysat pro Probe eingesetzt. Die
Herstellung der Proteinlysate, die Vorbereitung der Proben sowie die weitere
Beschreibung und Durchführung sind im Anhang (siehe S. 218 ff.) einzusehen.
59

MATERIAL UND METHODEN
4.5 Quantifizierung der Substanzen
4.5.1 Quantifizierung der Substanzen mittels Fluoreszenz-Reader
Bei der Substanz Rhodamin 123 handelt es sich um einen
Fluoreszenzfarbstoff. Die Quantifizierung des Farbstoffs erfolgte mittels
Fluoreszenzmessgerät und der OPTIMA Control Software (BMG Labtech GmbH,
Offenburg). Die Proben der Zelllysate und des Mediums wurden mit einem Volumen
von 50 bzw. 100 µl pipettiert und bis zur Messung abgedeckt bei RT gelagert. Die
Messung erfolgte nach einer Anregung des Rhodamins 123 bei 485 nm und einer
Emission bei 520 nm. Die Daten für die Kumulations-Assays wurden zusätzlich auf
den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe Abschnitt 4.3.1).
4.5.2 Quantifizierung der Substanzen mittels Szintillationscounter
Die Substanzen Digoxin und Verapamil waren [ 3 H]-markiert, Mannitol [ 14 C]-
markiert. Auf diese Weise konnten die Substanzen mittels der Messung des
radioaktiven Zerfalls im β-Szintillations-Counter (Liquid Scintillator System LS 5000
TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA) quantifiziert werden. Dazu wurden 40 μl der
Medium- oder Zelllysat-Proben der Kumulations- und Transport-Assays in
Szintillationsröhrchen pipettiert und mit 4,5 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt. Die
Proben wurden bis zur Messung etwa eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In
Abhängigkeit vom radioaktiven Isotop erfolgte die Messung der Zerfallsraten mit dem
entsprechenden Programm im β-Counter. Die Daten für die Kumulations-Assays
wurden zusätzlich auf den Proteingehalt der jeweiligen Probe bezogen (siehe
Abschnitt 4.3.1).
4.6 Auswertung der Daten und Statistik
Sofern nicht anders angezeigt, wurden alle Einzelversuche mit einer
Mindestgruppengröße von n=3 durchgeführt. Sämtliche Berechnungen der
Substratkonzentrationen in den Zellen, der Transportraten und des Proteingehalts
erfolgten mit dem Programm Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim).
Die Daten der Kumulations-Assays sind für alle verwendeten Zelllinien neben
bespielhaften Einzelversuchen auch in einer Zusammenfassung aller Versuche
dargestellt. Die Ergebnisse der Einzelversuche wurden als DPM/mg Protein bzw. als
Fluoreszenz/mg Protein angegeben. Für die zusammenfassende Gesamtdarstellung
60

MATERIAL UND METHODEN
wurden für alle Kontrollgruppen der einzelnen Versuche die Mittelwerte gebildet und
in Prozent umgesetzt. Die Gruppen der behandelten Zellen wurden prozentual auf
die jeweilige Kontrolle bezogen. Anschließend erfolgte die Zusammenfassung aller
Versuche in eine Gesamtdarstellung und –auswertung. Die Einheit ist hierfür als
Prozent (%) zur Kontrolle angegeben. Alle Daten der einzelnen Versuche und
Gesamtdarstellungen sind als Mittelwerte + Standardfehler (SEM) dargestellt.
Die Auswertung der Daten wurde mit dem Programm Prism5 ® (GraphPad
Software Incorporation, San Diego, USA) durchgeführt. Alle Daten der Kumulations-
Assays wurden mit dem Student’s t-Test oder der Varianzanalyse (One-way ANOVA)
analysiert, gefolgt von dem Dunnett’s oder Bonferroni Posthoc-Test. Alle Vergleiche
der Ergebnisse wurden zweiseitig und stets gegen die Kontrolle getestet. Die
Ergebnisse für Tariquidar wurden immer mit dem Student’s t-Test statistisch
ausgewertet, weil es sich hier mit der kürzeren Inkubationszeit von 3 h nicht um eine
Behandlung im Sinne aller anderen Substanzen (72 h) handelt.
Die Ergebnisse der Transport-Assays wurden mit der Varianzanalyse Twoway
ANOVA und dem Posthoc-Test Bonferroni ausgewertet. Für die Evaluierung der
Integrität der Zellmonolayer in den Transportuntersuchungen wurden die Mittelwerte
der TEER-Werte in den einzelnen Graphen angegeben. Signifikante Unterschiede
der vergleichenden Western Blots wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt. P-Werte
< 0,05 wurden als statistisch signifikant erachtet.
61

ERGEBNISSE
5 ERGEBNISSE
5.1 Die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3
5.1.1 Charakterisierung der hCMEC/D3-Zellen
Für die Charakterisierung der humanen Zellen wurden u.a. die Zellgröße und
die Zellzahl bestimmt. Dazu wurden die ebenfalls immortalisierten
Rattenhirnendothelzelllinien GPNT und RBE4 kultiviert. Diese wurden in früheren
Versuchen der hiesigen Arbeitsgruppe bereits charakterisiert und wurden für
vergleichende Untersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen herangezogen.
Dazu wurden alle drei Zelllinien über 3 Passagen kultiviert, auf 6Well-Platten
ausgesät und am 5. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die Bilder und die
anschließende Zellzählung verwendet. Die Zellzählung wurde dabei wie in Abschnitt
4.3.2 (S. 54 f.) beschrieben durchgeführt.
Abbildung 5.1: Bilder der humanen hCMEC/D3-Zellen (A) im Vergleich mit den
Rattenhirnkapillarendothelzelllinien GPNT (B) und RBE4 (C). Die Bilder wurden mit einer 200x
Vergrößerung aufgenommen. Die GPNT- und RBE4-Zellen sind kleiner und weisen auf der
gleichen Fläche eine etwa 2,5-mal höhere Zellzahl/ml auf als die humanen Zellen (A).
Die humanen Zellen waren nach diesen Bildern durchschnittlich etwa 40-50
µm groß und damit etwa doppelt so groß wie die Zellen der Rattenzelllinie GPNT. Die
GPNT-Zellen zeigten eine rundere Form als die anderen beiden Zelllinien. Beide
Rattenzelllinien (GPNT und RBE4-Zellen) zeigten im Gegensatz zu den hCMEC/D3-
Zellen auf der gleichen Fläche (A = 9,6 cm 2 ) dichter gepackte Zellen. Dies wurde
zusammen mit den Unterschieden in der Zellgröße mit Hilfe der Zellzahlbestimmung
62

ERGEBNISSE
bestätigt. Die kleineren Rattenzellen zeigten auf der gleichen Fläche eine ca. 2,5-mal
höhere Zellzahl als die humanen Zellen.
5.1.2 Western Blot: Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen
Die Bestimmung der Expression des MDTs Pgp in hCMEC/D3-Zellen erfolgte
mit der Methode des Western Blots. Der Nachweis wurde mittels eines Protokolls
durchgeführt, das in der hiesigen Arbeitsgruppe für Pgp etabliert wurde und im Detail
im Anhang (siehe S. 218 ff.) nachzulesen ist. Für die Untersuchung der Pgp-
Expression wurden vergleichende Western Blots mit den immortalisierten
Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 durchgeführt. Bei allen drei
verwendeten Zelllinien hCMEC/D3, GPNT und RBE4 wurden die Pgp-Signale, die
sich bei etwa 170 kDa befanden, und Signale für ß-Aktin bei ca. 42 kDa gemeinsam
ausgewertet. Für die statistische Auswertung der Expression von Pgp wurden die
Signale, die mittels Antigen-Antikörperbindung detektiert werden konnten, auf ß-Aktin
normiert.
RBE4- und GPNT-Zellen wurden in den Western Blots mitgeführt, um zu
überprüfen, ob in den Kumulations-Assays ein unterschiedliches Ausmaß des
Rhodamin-Efflux durch Pgp (siehe Abschnitt 5.1.3.1, Abbildung 5.4) auf die
Expression dieses MDTs zurückgeführt werden kann. Mit Hilfe der Western Blots
konnte gezeigt werden, dass die GPNT-Zellen die stärkste Pgp-Expression
aufwiesen. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen exprimierten signifikant weniger Pgp im
Vergleich zu GPNT-Zellen.
63

Pgp-Expression
(%; normiert auf ß-Aktin)
Pgp-Expression
(%; normiert auf ß-Aktin)
ERGEBNISSE
A
B
300
250
Pgp-Expression
*
200
150
100
50
0
hCMEC/D3 RBE4 GPNT
C
D
500
Pgp-Expression
520 * *
480
50
40
30
20
10
0
hCMEC/D3 GPNT RBE4
Abbildung 5.2: Immunoblots (A & C) von zwei unterschiedlichen Western Blots und
entsprechende graphische Darstellungen der Pgp-Expression (B & D) in den drei
Hirnendothelzelllinien hCMEC/D3 (Mensch), GPNT und RBE4 (beide Ratte). Es wurde jeweils 1
Probe pro Zelllinie 3-mal aufgetragen und die Pgp-Expression auf die des Housekeepers ß-
Aktin normiert. Für die hCMEC/D3-Zellen wurden Zellen der Passagen 29 (A & B) und 33 (C &
D), für GPNT-Zellen die Passagen 29 (A & B) und 30 (C & D) und für die RBE4-Zellen die
Passagen 61 (A & B) und 62 (C & D) verwendet. Beide Western Blots zeigten, dass die drei
Zelllinien Pgp exprimierten. Die quantifizierten Signale der einzelnen Zelllinien (siehe B & D)
wurden als Mittelwerte + SEM angegeben. Die Rattenhirnendothelzelllinie GPNT zeigte im
Vergleich die höchste Pgp-Expression. RBE4- und hCMEC/D3-Zellen wiesen eine etwa gleich
hohe Expression des MDTs auf, wobei die humanen Zellen tendenziell mehr Pgp exprimierten.
Signifikanzen wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (One-Way ANOVA) und dem
Bonferroni-Posttest ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.
64

ERGEBNISSE
5.1.3 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Kumulations-Assays
Die hCMEC/D3-Zellen wurden in den Passagen 31-43, GPNT-Zellen wurden
von Passage 30–59 und RBE4-Zellen von Passage 61-71 für Kumulationsversuche
verwendet. Die Substanzbehandlung der Zellen erfolgte dabei i.d.R. über 72 h mit
Beginn 3 Tage nach Erreichen der Konfluenz (siehe Abschnitt 4.3.1). Dabei wurde
täglich frisches Medium mit der jeweilig zu testenden Substanz und der
entsprechenden Konzentration vorbereitet und auf die Zellen gegeben. Der
Hemmstoff Tariquidar, der neben bekannten Pgp-Induktoren wie beispielsweise
Dexamethason ebenfalls in jedem Versuch mitgeführt wurde, wurde lediglich für
insgesamt 3 h (1 h Vorinkubation, 2 h Inkubation während des Versuchs) auf vorher
unbehandelten Zellen belassen.
Der Substratgehalt in den Zellen, der mit Hilfe des Kumulations-Assays
gemessen werden kann, stellt ein Maß für den Einfluss von Pgp auf die Kumulation
des Substrats dar. Man spricht von einer Induktion der Funktionalität, wenn der
Substrat-Gehalt in den Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Kontrolle)
abfällt. Ist der Gehalt des Substrats höher als in der Kontrollgruppe, geht man von
einer Hemmung der Transporter-Funktion aus. Der Inhibitor Tariquidar wurde in
jedem Versuch mitgeführt, um die Funktionalität des Transporters zu überprüfen und
sollte Aufschluss darüber geben, ob eine vorhergehende Induktion des Pgps wieder
aufgehoben werden kann.
5.1.3.1 Auswahl des Substrats
Die FDA empfiehlt für Untersuchungen der Pgp-Funktionalität das spezifische
Pgp-Substrat Digoxin. Für die humane Zelllinie hCMEC/D3 wurde deshalb ein
Kumulationsversuch mit radioaktiv-markiertem Digoxin durchgeführt, wobei lediglich
eine Kontrollgruppe und eine Gruppe von Zellen, dessen Efflux durch Tariquidar
gehemmt wurde, miteinander verglichen wurden.
65

ERGEBNISSE
25000
hCMEC/D3 P:30
n=6
3 H-Digoxin
(DPM/mg Protein)
20000
15000
10000
5000
0
Kontrolle
TQD 0,5 µM
Abbildung 5.3: Digoxin-Kumulation in einem beispielhaften Versuch mit hCMEC/D3-Zellen.
Tariquidar zeigte in der erprobten Konzentration von 0,5 µM keine Inhibition des Efflux von
Digoxin im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Zellen wurden über 3 Tage täglich mit frischem
Medium versorgt. Der Versuch fand 6 Tage nach Erreichen der Konfluenz statt. Die Inkubation
mit dem Substrat Digoxin erfolgte mit einer Konzentration von 1 µM Digoxin + 10 kBq/ml 3 H-
Digoxin. Die Zellen wurden am Tag des Kumulations-Assays für 3 h mit dem spezifischen
Inhibitor Tariquidar inkubiert. Die Werte sind als Mittelwerte + Standardfehler (SEM) in DPM/mg
Protein angezeigt.
Abkürzung: TQD: Tariquidar.
Aufgrund des ausbleibenden Effekts durch Tariquidar wurden alle nun im
Folgenden beschriebenen Kumulations-Assays mit den hCMEC/D3-Zellen sowie die
vergleichenden Assays mit GPNT- und RBE4-Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Rhodamin 123 durchgeführt. In der folgenden Abbildung (5.4) wird deutlich, dass
Rhodamin 123 für die gewählten Versuchsbedingungen als Pgp-Substrat geeignet
ist, da sowohl signifikante Unterschiede im Substratgehalt zwischen dem
dargestellten Pgp-Induktor Dexamethason und den Kontrollgruppen, als auch
zwischen dem Inhibitor Tariquidar und den Kontrollen nachgewiesen werden
konnten.
66

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
300000
200000
100000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:31
n=3
*
Dex 1 µM
*
TQD 0,5 µM
B
GPNT P:34
n=3
300000
*
200000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
Dex 1 µM
TQD 0,5 µM
C
300000
200000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
RBE4 P:66
n=3
*
Dex 1 µM
*
TQD 0,5 µM
Abbildung 5.4: Vergleichender Kumulations-Assay mit hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen
nach der Behandlung mit dem Pgp-Induktor Dexamethason und dem Inhibitor Tariquidar. Alle
drei Zelllinien exprimierten funktionelles Pgp.
A: Der Efflux von 10 µM Rhodamin 123 wurde durch Dexamethason induziert, Tariquidar zeigte
eine Inhibition der Pgp-Funktionalität.
B & C: Der Substratgehalt der Kontrollgruppen der GPNT- und RBE4-Zellen unterschied sich in
großem Ausmaß. Der Efflux in GPNT-Zellen war höher. Eine Induktion durch Dexamethason
war nicht nachweisbar. Der hohe Rhodamin-Gehalt in RBE4-Zellen wurde durch eine Induktion
des Efflux signifikant verringert. Tariquidar zeigte jeweils eine signifikante Inhibition, der
Substratgehalt im Vergleich zur Kontrolle war erhöht.
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, TQD: Tariquidar.
Die in Abbildung 5.4 dargestellten Versuche zeigten funktionelles Pgp in allen
drei Zelllinien. Tariquidar inhibierte den Efflux von Rhodamin 123. Nach der
Behandlung mit 1 µM Dexamethason war die Pgp-Funktionalität im Vergleich zur
Kontrollgruppe in hCMEC/D3-Zellen und in RBE4-Zellen erhöht, es wurde mehr
67

ERGEBNISSE
Rhodamin 123 aus den Zellen transportiert. Ausnahme bildeten die GPNT-Zellen, in
denen keine induzierende Wirkung nach Dexamethason nachgewiesen werden
konnte.
5.1.3.2 Auswahl geeigneter Kontrollen zur Überprüfung der Pgp-Funktionalität
Zu Beginn der Versuche wurden zunächst Pgp-Induktoren in den hCMEC/D3-
Zellen getestet. Dies diente dazu, geeignete Substanzen zu finden, die für den
Kumulations-Assay sensitiv genug sind und zusammen mit dem spezifischen Pgp-
Inhibitor Tariquidar zur Überprüfung der Sensitivität des Kumulations-Assays
eingesetzt werden können. Nachdem die Auswahl eines Pgp-Substrats erfolgt war,
wurden hCMEC/D3-Zellen hinsichtlich der Auswirkungen bekannter Pgp-Induktoren
untersucht. Zunächst wurde der Pgp-Induktor Dexamethason (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005a) in verschiedenen Konzentrationen getestet. Die nachfolgenden
Graphen zeigen exemplarisch die Effekte in den Kumulations-Assays. Tariquidar ist
als Kontrolle zur Überprüfung des Assays angezeigt.
Da die Ergebnisse für Dexamethason nicht eindeutig waren, wurden weitere
Konzentrationen sowie andere bekannte Pgp-Induktoren wie die Zytostatika
Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin getestet.
68

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:30
n=4
Dex 1 µM
*
TQD 0,5 µM
B
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:31
n=3
*
Dex 1 µM
*
TQD 0,5 µM
C
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:36
n=3
Dex 20 µM
*
TQD 0,5 µM
D
Kontrolle
hCMEC/D3 P:35
n=3
150000 *
100000
70000
60000
50000
40000
p=0,0881
30000
20000
10000
0
Dex 5 µM
Dex 10 µM
Puro 0,5 µM
TQD 0,5 µM
E
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC P:32
n=3
Puro 0,5 µM
*
TQD 0,5 µM
F
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC P:31
n=6
Puro 1 µM
* *
Vin 20 nM
*
TQD 0,5 µM
G
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
Dex 1 µM
hCMEC/D3 P:32
n=3
* * *
Dex 5 µM
Dex 10 µM
Rif 20 µM
*
Puro 1 µM
*
TQD 0,5 µM
H
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:39
n=3
Dox 0,23 µM
Rif 2,5 µM
Abbildung 5.5: Kumulation des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 nach Behandlung mit den
Pgp-Induktoren Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin, Vincristin und dem Pgp-
Inhibitor Tariquidar in acht unabhängigen Versuchen in hCMEC/D3-Zellen. Tariquidar führte in
allen Versuchen zur signifikanten Erhöhung der Kumulation. Dexamethason und Rifampicin
zeigten inkonsistente Effekte. Doxorubicin führte in der gewählten Konzentration nicht zu einer
Induktion des Efflux. Puromycin (1 µM) und Vincristin induzierten den Efflux, der Rhodamin-
Gehalt war im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen reduziert.
Die Zellen wurden ab dem 3. Tag der Konfluenz über 72 h mit den Induktoren behandelt.
Tariquidar wurde erst zu Beginn des Versuchs einer Gruppe von unbehandelten Zellen zugefügt.
Die Versuche wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Versuche
69

ERGEBNISSE
erfolgten unter einer Rhodamin-Konzentration von 10 µM. Die Werte sind als Mittelwerte + SEM
angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Student’s t-Test festgestellt und sind mit
Sternen (p < 0,05) angegeben. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle sind die
p-Werte < 0,1 angegeben.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Puro: Puromycin, Rif: Rifampicin, Vin:
Vincristin, TQD: Tariquidar.
Für alle hier verwendeten Pgp-Induktoren wurden mehrere Konzentrationen
getestet. Sofern die Zellen mit Ablösungen auf eine der Konzentrationen reagierten,
wurden diese nicht graphisch dargestellt und wurden auch in der
zusammenfassenden Darstellung (Abbildung 5.7) nicht berücksichtigt. Es stellte sich
heraus, dass Dexamethason und Rifampicin in einzelnen Versuchen zu einer
Induktion führten (Abbildung 5.5 B & G). Wenn diese Experimente mit den gleichen
und auch weiteren Konzentrationen wiederholt wurden, waren die Effekte oft nicht
reproduzierbar. Puromycin und Vincristin zeigten die robustesten induzierenden
Effekte. Beide Substanzen wurden zusammen mit Doxorubicin und Rifampicin auch
in höheren Konzentrationen (Puromycin 2,65 µM, Vincristin 40 nM, Doxorubicin 0,92
µM und Rifampicin 200, 500 und 1000 µM) getestet, wobei sich während der
Behandlungen Zellen ablösten (Daten nicht dargestellt). Im Kumulations-Assay
konnten zwar in diesen Versuchen Effekte auf den Efflux nachgewiesen werden
(Abbildung 5.7), welche aber aufgrund der Zellablösungen aus der Gesamtwertung
ausgeschlossen und hier nicht dargestellt wurden.
Die Induktion der Pgp-Funktionalität durch Glutamat in der Konzentration von
100 µM wurde bereits in In-vitro-Versuchen mit Rattenhirnkapillaren nachgewiesen
(BAUER et al. 2008). In den Kumulations-Assays mit hCMEC/D3-Zellen war diese
Induktion nicht zu erkennen (Abbildung 5.6), weshalb diese Substanz nicht weiter
eingesetzt wurde.
70

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:31
n=3
Glu 100 µM
TQD 0,5 µM
B
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
hCMEC/D3 P:36
n=3
Glu 100 µM
*
TQD 0,5 µM
Abbildung 5.6: Rhodamin-Kumulation nach der Behandlung mit 100 µM Glutamat in hCMEC/D3-
Zellen. In keinem der beiden Versuche war eine Induktion des Efflux nachweisbar. Tariquidar
führte zur Inhibition des Efflux. Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Signifikante
Unterschiede im Vergleich Kontrolle vs. Tariquidar wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt und
sind mit einem Stern (p < 0,05) angegeben.
Abkürzungen: Glu: Glutamat, TQD: Tariquidar.
Eine Induktion der Pgp-Funktionalität bedeutet, dass der Substratgehalt im
Vergleich zum Grundtransport (Kontrolle) abfällt, weil durch die induzierende
Wirkung mehr Substrat aus den Zellen transportiert wird. Die dargestellten Versuche
zeigten, dass die Induktoren nur in bestimmten Konzentrationen induzierend auf den
Efflux des Pgp-Substrats Rhodamin 123 wirkten. Keiner der verwendeten Pgp-
Induktoren zeigte in allen Versuchen konsistente Effekte, weshalb i.d.R. mehrere
dieser Substanzen mitgeführt wurden.
Inhibitoren wie Tariquidar führen zu einem Anstieg des Substrats in den
Zellen, weil der Efflux durch Pgp gehemmt wird. Tariquidar zeigte im Vergleich zu
den bekannten Pgp-Induktoren stets eine Inhibition des Efflux, der Rhodamin-Gehalt
in den Zellen war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht.
71

ERGEBNISSE
Zusammenfassung der Effekte bekannter Pgp-Induktoren
In Abbildung 5.7 sind die Einzelversuche mit den Induktoren zur Übersicht in
einem Graphen zusammengefasst. Dazu wurden alle Kontrollgruppen der Versuche,
in denen der jeweilige Induktor eingesetzt wurde, zusammengefasst, die Mittelwerte
berechnet, die Einzelwerte auf diese bezogen und als % angegeben. Die einzelnen
Werte der Substanzgruppen wurden dann auf die jeweilige Kontrolle (= 100 %)
bezogen.
In der Zusammenfassung der Versuche mit Pgp-Induktoren in hCMEC/D3-
Zellen zeigten Dexamethason, Puromycin und Vincristin die vergleichsweise
robustesten Resultate bezüglich der Induktion des Rhodamin-Efflux und führten
folglich zu einer Abnahme des Rhodamin-Gehalts in den Zellen (Abbildung 5.7).
Rifampicin stellte den schwächsten Induktor dar. Letztlich wurden in den folgenden
Versuchen oftmals zwei oder mehr Induktoren bzw. Konzentrationen eines Induktors
mitgeführt. Vier der sechs getesteten Substanzen führten in einer oder mehreren
Konzentrationen zu einem signifikanten Abfall des Substratgehalts in den Zellen, die
Pgp-Funktionalität wurde signifikant induziert. Dabei wurde die Induktion nicht immer
durch die höchste Konzentration erzielt. Die höchsten für Doxorubicin (0,92 µM),
Puromycin (2,65 µM), Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) und Vincristin (40 nM)
untersuchten Konzentrationen zeigten zelltoxische Wirkungen in Form von
Zellablösungen, die teilweise schon ab dem ersten Behandlungstag zu erkennen
waren. Tariquidar stellte einen verlässlichen Inhibitor dar.
In der vergleichenden Betrachtung mit GPNT- und RBE4-Zellen zeigte
Dexamethason in der Konzentration von 1 µM robustere Effekte in hCMEC/D3- und
RBE4-Zellen als in GPNT-Zellen (Abbildung 5.4 bzw. 5.11 A).
72

Rhodamin 123 (% Kontrolle)
ERGEBNISSE
350
325
300
120
100
80
60
hCMEC/D3 - Induktoren
*
**
** *
** *
40
20
0
91 21 32 15
Kontrolle
Dex 1 µM
Dex 5 µM
Dex 10 µM
Dox 0,23 µM
3 6 12 18 9 6 6 6 3 9 79
Glu 100 µM
Puro 0,5 µM
Puro 1 µM
Rif 2,5 µM
Rif 5 µM
Rif 10 µM
Rif 20 µM
Rif 50 µM
Vin 20 nM
TQD 0,5 µM
Abbildung 5.7: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in hCMEC/D3-Zellen der Passagen
31-43, in denen Pgp-Induktoren untersucht wurden. Vier der sechs getesteten Induktoren führten
in mindestens einer Konzentration zu einer Induktion des Efflux. Dexamethason, Puromycin und
Vincristin zeigten die robustesten Effekte. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einem
signifikant erhöhten Rhodamin-Gehalt, also zur Inhibition des Efflux. Daten sind als Mittelwerte +
SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen Versuche mit Pgp-Induktoren wurden
zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf diese bezogen. Die Gruppengröße n
ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Oneway
ANOVA (Posthoc Dunnett’s) ermittelt und sind als Sterne (p < 0,05) angezeigt.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Glu: Glutamat, Puro: Puromycin, Rif:
Rifampicin, Vin: Vincristin, TQD: Tariquidar.
73

ERGEBNISSE
5.1.3.3 Modulationen der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika
Im Folgenden werden Versuche mit therapeutisch eingesetzten Antiepileptika
in den humanen Hirnkapillarendothelien hCMEC/D3 gezeigt. Die Antiepileptika
wurden hinsichtlich möglicher induzierender Wirkungen auf die Pgp-Funktionalität
untersucht. In Tabelle 5.1 werden die verwendeten Konzentrationen der
Antiepileptika im Vergleich zu den therapeutischen Plasmakonzentrationen in
Epilepsiepatienten gezeigt. Zudem wurden sie in Bezug zu den therapeutischen
Plasmakonzentrationen in Epilepsiepatienten gesetzt.
Tabelle 5.1 Verwendete Konzentrationen der untersuchten Antiepileptika sowie deren
Bereich der therapeutischen Plasmakonzentrationen in Epilepsiepatienten (nach
PATSALOS et al. 2008).
Antiepileptikum
Therapeutische Plasma-
In der These verwendete
konzentrationen
Konzentrationen (µM)
µg/ml µM
Carbamazepin 4-12 17-51 10-100
Levetiracetam 12-46 70-270 100-300
Phenobarbital 10-40 43-172 100-300
Phenytoin 10-20 40-79 10-100
Topiramat 5-20 15-59 30-300
Valproat 50-100 347-693 50-300
Die verwendeten Konzentrationen der untersuchten Antiepileptika liegen im
Bereich therapeutisch eingesetzter Konzentrationen bei Epilepsiepatienten, teils
darüber. Für Valproat liegen die Konzentrationen unterhalb dieses Bereichs.
74

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
C
E
300000
250000
200000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
200000
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
300000
200000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
n=6
Kontrolle
Kontrolle
Dex 5 µM
hCMEC/D3 P:33
n=3
p=0,0604
Dex 5 µM
n=2
Dex 5 µM
PB 100 µM
PB 300 µM
* *
TPM 30 µM
hCMEC/D3 P:37
n=3
CBZ 100 µM
* *
PHT 10 µM
PHT 30 µM
hCMEC/D3 P:30
n=3
CBZ 100 µM
LEV 100 µM
LEV 300 µM
G
*
TPM 100 µM
PHT 50 µM
* *
VPA 100 µM
VPA 300 µM
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Kontrolle
*
TQD 0,5 µM
*
TQD 0,5 µM
*
TQD 0,5 µM
Puro 1 µM
B
D
F
300000
250000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
150000
100000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
125000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
hCMEC/D3 P:31
n=6
* *
Vin 20 nM
n=6
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Dex 5 µM
Dex 10 µM
hCMEC/D3 P:36
n=3
* *
CBZ 50 µM
CBZ 100 µM
PB 300 µM
hCMEC/D3 P:34
n=3
*
CBZ 100 µM
Dex 10 µM
p=0,0642
PHT 100 µM
TPM 100 µM
TPM 100 µM
TPM 300 µM
hCMEC/D3 P:35
n=3
PHT 100 µM
LEV 100 µM
VPA 300 µM
LEV 300 µM
*
TQD 0,5 µM
*
TQD 0,5 µM
150000
*
VPA 50 µM
VPA 100 µM
p=0,0881
*
TQD 0,5 µM
TQD 0,5 µM
75

ERGEBNISSE
Abbildung 5.8: Ausgewählte Kumulationsversuche mit Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen nach
der Behandlung mit den Antiepileptika Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin,
Topiramat und Valproat in verschiedenen Konzentrationen (A-G). In allen Versuchen wurden
bekannte Pgp-Induktoren (Dexamethason, Puromycin und Vincristin) und der Pgp-Inhibitor
Tariquidar mitgeführt. Alle Antiepileptika führten in einzelnen Versuchen zu einer Induktion des
Efflux. Diese Effekte konnten oft nicht wiederholt werden. Carbamazepin zeigte die robustesten
Induktionen. Tariquidar führte in allen Experimenten zu einer Inhibition des Rhodamin-Efflux.
Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Die statistische Auswertung wurde mit dem
Student’s t-Test vorgenommen. Signifikante Unterschiede sind mit Sternen (p < 0,05)
gekennzeichnet. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle sind die p-Werte < 0,1
angegeben.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Puro: Puromycin, Vin: Vincristin, CBZ: Carbamazepin, LEV:
Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin, TPM: Topiramat, VPA: Valproat, TQD:
Tariquidar.
Die einzelnen Versuche mit den sechs untersuchten Antiepileptika
Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat in
verschiedenen Dosierungen ließen kein eindeutiges Ergebnis erkennen. Von den
sechs untersuchten Therapeutika zeigte Carbamazepin die robustesten Effekte (5.8
B, C & D). In der niedrigeren Konzentration von 50 µM zeigten sich Tendenzen zu
einer Induktion, in der höheren Dosierung von 100 µM führte diese Substanz zur
signifikanten Induktion von Pgp in hCMEC/D3-Zellen. Für Phenytoin wurden
Tendenzen zur Induktion erst bei den höheren Konzentrationen sichtbar (100 µM; 5.8
D). Eine Ausnahme bildete dabei die niedrigste Dosierung (10 µM), für die ein
inhibitorischer Effekt nachgewiesen wurde (Abbildung 5.8 C). Für Phenobarbital war
in einem einzelnen Versuch eine Induktion nachweisbar. Der Effekt war aber nicht
reproduzierbar (Abbildung 5.8 A & B). Für Levetiracetam (5.8 E & F), Topiramat (5.8
A, B & D) und Valproat (5.8 D, E & G) galt das Gleiche, einzelne Induktionen ließen
sich nicht erneut nachweisen. In einem einzelnen Kumulations-Assay zeigte Valproat
auch eine Tendenz zur Inhibition des Efflux (5.8 E). Des Weiteren wurde die
Behandlung für Valproat einmalig auf 6 Tage ausgedehnt. Es waren aber keine
Unterschiede im Vergleich zur 3-tägigen Behandlung nachweisbar. Für keines der
untersuchten Antiepileptika war eine Abhängigkeit von der Passage der Zellen zu
erkennen.
Tariquidar zeigte in allen Versuchen eine Inhibition des Efflux, der
Substratgehalt war im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht.
76

ERGEBNISSE
Zusammenfassung möglicher induzierender Effekte durch Antiepileptika
Abbildung 5.9 zeigt eine Zusammenfassung der Einzelversuche mit
Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen. Dazu wurden für alle Versuche, in denen
Antiepileptika getestet wurden, die Mittelwerte der einzelnen Kontrollgruppen
berechnet, die Einzelwerte auf diese bezogen und als % angegeben. Die einzelnen
Werte der Substanzgruppen wurden dann auf die jeweilige Kontrolle (= 100 %)
bezogen.
Carbamazepin zeigte in fast allen Einzelversuchen signifikante Effekte. Nach
der Normierung war ein induzierender Effekt nachweisbar, Carbamazepin zeigte im
Vergleich zur Kontrolle einen verringerten Substratgehalt. Für Valproat (300 µM)
konnte in der Zusammenfassung ebenfalls eine Induktion des Rhodamin-Efflux
nachgewiesen werden. Für die anderen Antiepileptika Levetiracetam, Phenobarbital,
Phenytoin und Topiramat waren keine induzierenden Effekte nachweisbar. In
einzelnen Konzentrationen sind allerdings Tendenzen zur Induktion erkennbar. Sie
zeigten aber unter den gewählten Bedingungen keine Unterschiede zur Kontrolle.
Tariquidar führte in allen Versuchen zu einem signifikant erhöhten Rhodamin-Gehalt,
also zur Inhibition des Efflux. Es bleibt festzuhalten, dass einige Antiepileptika unter
den gewählten Kultur- und Versuchsbedingungen zur Induktion von Pgp führten.
77

Rhodamin 123 (% Kontrolle)
ERGEBNISSE
120
hCMEC/D3 - Antiepileptika
100
80
*
*
60
40
20
0
Kontrolle
91 6 30 6
CBZ 50 µM
CBZ 100 µM
LEV 100 µM
LEV 300 µM
11 3 9 3 3 3 12 3 12 6 6 10 15
PB 100 µM
PB 300 µM
PHT 10 µM
PHT 30 µM
PHT 50 µM
PHT 100 µM
TPM 30 µM
TPM 100 µM
TPM 300 µM
VPA 50 µM
VPA 100 µM
VPA 300 µM
Abbildung 5.9: Zusammenfassung der Kumulations-Assays mit therapeutisch eingesetzten
Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen der Passagen 31-43. Carbamazepin (100 µM) und Valproat
(300 µM) führten zu einer Induktion des Rhodamin-Efflux. Nach der Behandlung mit
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin und Topiramat waren keine induzierenden Effekte
nachweisbar. Tariquidar führte in allen Versuchen zur Inhibition des Efflux (nicht gezeigt). Die
Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Für die Auswertung wurden die Kontrollen der
Versuche, in denen Antiepileptika mitgeführt wurden, zusammengefasst und in % angegeben.
Einzelne Werte der Substanzgruppen wurden auf die Kontrolle des jeweiligen Versuchs bezogen.
Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede
wurden mit einer One-way ANOVA (Posthoc Dunnett’s) ermittelt und sind als Sterne (p < 0,05)
angezeigt.
Abkürzungen: CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin,
TPM: Topiramat, VPA: Valproat.
In den Tabellen 5.2 und 5.3 sind noch einmal alle Ergebnisse aus den
Kumulations-Assays zusammengefasst. Die Daten zu den Induktoren stammen aus
dem unter Abbildung 5.7 gezeigten Graphen. Auswirkungen der Antiepileptika-
Behandlung entsprechen dem Graphen der Abbildung 5.9.
78

ERGEBNISSE
Tabelle 5.2: Übersicht der Ergebnisse aus Kumulations-Assays mit dem Substrat
Rhodamin 123 nach der Behandlung mit Pgp-Induktoren in hCMEC/D3-Zellen (nach
Abbildung 5.7).
Pgp-Induktor Konzentration Effekt
1 µM -
Dexamethason
5 µM +
10 µM +
Doxorubicin 0,23 µM -
Glutamat 100 µM -
Puromycin
0,5 µM +
1 µM +
2,5 µM -
5 µM Inhibition!
Rifampicin
10 µM Inhibition!
20 µM -
50 µM +
Vincristin 20 nM +
+ Induktion - Induktion nicht nachweisbar
79

ERGEBNISSE
Tabelle 5.3: Übersicht der Ergebnisse aus Kumulations-Assays mit dem Substrat
Rhodamin 123 nach der Behandlung mit Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen (nach
Abbildung 5.9).
Antiepileptikum Konzentration Effekt
Carbamazepin
Levetiracetam
Phenobarbital
50 µM -
100 µM +
100 µM -
300 µM -
100 µM -
300 µM -
10 µM -
Phenytoin
30 µM -
50 µM -
100 µM -
30 µM -
Topiramat
100 µM -
300 µM -
50 µM -
Valproat
100 µM -
300 µM +
+ Induktion - Induktion nicht nachweisbar
Die Abbildungen 5.7 und 5.9 und die Tabellen 5.2 und 5.3 machen deutlich, dass
bekannte Pgp-Induktoren und einzelne Antiepileptika in der Lage sind, die Pgp-
Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen zu modulieren.
80

ERGEBNISSE
5.1.3.4 Einfluss des Serums während des Kumulationsversuchs
Für den Kumulationsversuch wurden die Zellen für die Dauer des Versuchs (3
Stunden) auf ein serum- und wachstumsfaktorfreies Versuchsmedium (Opti-MEM ® )
umgestellt, um mögliche Wechselwirkungen mit dem Substrat Rhodamin 123
auszuschließen. Die unter den Abbildungen 5.4, 5.5 und 5.8 dargestellten Versuche
zeigten keine einheitlichen Effekte der einzelnen Substanzen. Zudem führten
einzelne Induktoren (Doxorubicin, Puromycin und Vincristin) zu Zellablösungen
während der Behandlung. Zur Untersuchung, ob das im Versuchsmedium fehlende
Serum einen Einfluss hat, wurden einzelne Versuche mit Serum-versetztem Opti-
MEM ® durchgeführt (nicht dargestellt). Dabei wurde die gleiche Serumkonzentration
wie im Kulturmedium der hCMEC/D3-Zellen verwendet. In diesen Versuchen wurden
keine Unterschiede zur Modulation der Pgp-Funktionalität zwischen dem
Versuchsmedium mit und ohne Serum nachgewiesen. Veränderungen in Bezug auf
Messbarkeit und Beeinflussung der Funktionalität des MDT Pgp konnten nicht
festgestellt werden, weshalb nach dem üblichen Protokoll verfahren wurde, in dem
für den Versuch die Umstellung der Zellen auf serumfreies Medium erfolgte.
5.1.3.5 Hydrocortison und dessen Einfluss auf den Efflux
Die hCMEC/D3-Zellen wurden nach dem Protokoll von Dr. P.-O. Couraud mit
1,4 µM Hydrocortison kultiviert. Dieser Mediumszusatz soll zu einer Erhöhung der
Dichtigkeit, die für Transportversuche notwendig ist, beitragen. Für
Kumulationsversuche sind dichte Monolayer nicht notwendig. Hydrocortison kann
das Zellwachstum mindern, sodass beispielsweise weniger Zellen mit den
Testsubstanzen inkubiert werden und sich dies auf die Resultate der Kumulations-
Assays auswirken kann. Zudem ist für Hydrocortison bekannt, dass es die
Funktionalität Pgps induziert (MAINES et al. 2005). Um die Effekte von Hydrocortison
abschätzen zu können, wurden hCMEC/D3-Zellen ab der Aussaat für die Versuche
mit und ohne Hydrocortison kultiviert und für zwei Kumulationsversuche mit dem
Pgp-Induktor Dexamethason und verschiedenen Antiepileptika behandelt.
81

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
800000.0
400000.0
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Kontrolle
Vergleich + und - Hydrocortison
hCMEC/D3 P:36
n=3
Dex 1 µM
PB 300 µM
*
TQD 0,5 µM
Kontrolle
*
*
Dex 1 µM
*
PB 300 µM
*
TQD 0,5 µM
+ Hydrocortison - Hydrocortison
B
800000.0
400000.0
250000
200000
150000
100000
50000
0
p=0,0889
Kontrolle
Dex 1 µM
*
Vergleich + und - Hydrocortison
hCMEC/D3 P:31
n=3
CBZ 50 µM
LEV 100 µM
PB 100 µM
*
p=0,0758
*
+ Hydrocortison
*
PHT 50 µM
TPM 30 µM
VPA 300 µM
TQD 0,5 µM
Kontrolle
*
*
Dex 1 µM
CBZ 50 µM
LEV 100 µM
PB 100 µM
*
- Hydrocortison
p=0,069
PHT 50 µM
TPM 30 µM
VPA 300 µM
TQD 0,5 µM
*
*
Abbildung 5.10: Rhodamin-Kumulation in hCMEC/D3-Zellen. Es sind die Ergebnisse aus zwei
Versuchen dargestellt, wobei im ersten nur der Pgp-Induktor Dexamethason und das
Antiepileptikum Phenobarbital untersucht wurden. Im zweiten Experiment wurden fünf weitere
Antiepileptika (Carbamazepin, Levetiracetam, Phenytoin, Topiramat und Valproat) getestet.
A: Die Zellen ohne Hydrocortison zeigten eine Induktion Pgp-Funktionalität nach
Dexamethason und eine Inhibition nach Phenobarbital.
B: Dexamethason und Phenytoin wirkten induzierend auf den Efflux in Zellen ohne
Hydrocortison. Für Valproat und Topiramat war eine Inhibition bzw. eine Tendenz zur Inhibition
nachweisbar. Die Behandlung mit Topiramat führte zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität.
82

ERGEBNISSE
Die Linie, die in beiden Graphen zu sehen ist, weist auf die Rhodamin-Kumulation nach dem
Standardprotokoll hin, in dem die Zellen mit Hydrocortison kultiviert wurden. Sie soll den
Unterschied zwischen den beiden Gruppen verdeutlichen.
In beiden Versuchen inhibierte Tariquidar den Efflux in allen Zellen (+ und – Hydrocortison).
Die Werte sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Für tendenzielle Unterschiede im Vergleich
zur Kontrolle sind die p-Werte < 0,1 angegeben. Signifikante Unterschiede nach dem Student’s
t-Test sind mit Sternen angegeben (p < 0,05).
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital,
PHT: Phenytoin, TPM: Topiramat, VPA: Valproat, TQD: Tariquidar.
Die in Abbildung 5.10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hydrocortison
einen Einfluss auf die Sensitivität der Zellen hat. Zellen, die ohne Hydrocortison im
Medium kultiviert wurden, reagierten nach der Behandlung mit bekannten Pgp-
Induktoren und Antiepileptika empfindlicher. Effekte waren eher nachzuweisen als
bei der Kultivierung mit Hydrocortison. Diese Empfindlichkeit zeigte sich auch in der
weiteren Kultivierung der Zellen. Die Zellen schienen langsamer zu wachsen und
zeigten sich generell empfindlicher gegenüber Mediumswechsel und anderen
Veränderungen. Im zweiten vergleichenden Versuch bezüglich des Hydrocortisons
(Abbildung 5.10 B) waren zudem Unterschiede in der Grundfunktionalität (Kontrolle)
von Pgp zu erkennen. Die Zellen ohne Hydrocortison wiesen einen höheren
Rhodamin-Gehalt auf (p < 0,001). Dies kann auf eine geringere Pgp-Funktionalität
zurückgeführt werden, die mit einer geringeren Inhibition durch Tariquidar
einhergehen sollte. Die Behandlung mit Tariquidar verursachte aber in den Zellen
ohne Hydrocortison eine im Vergleich mit Hydrocortison signifikant erhöhte Inhibition
(p < 0,0026 bzw. p < 0,003). Diese Versuche zeigten, dass Hydrocortison die Pgp-
Funktionalität induzierte.
Im ersten Versuch wurde zusätzlich der Pgp-Induktor Doxorubicin (0,92 µM)
untersucht (nicht dargestellt). In dieser Konzentration kam es mit und ohne
Hydrocortison zu Zellablösungen, wobei die Zellen ohne Hydrocortison eine höhere
Empfindlichkeit auf Doxorubicin zeigten. Aus diesem Grund wurde Doxorubicin in
dieser Konzentration von der Auswertung ausgeschlossen.
Die Ergebnisse nach der Behandlung mit Antiepileptika blieben von der
Kultivierung mit und ohne Hydrocortison unbeeinflusst. Die modulatorischen Effekte
zeigten auch ohne den Zusatz von Hydrocortison im Medium variable Ergebnisse.
83

ERGEBNISSE
5.1.3.6 Vergleichende Untersuchungen der Pgp-Funktion in
Rattenhirnendothelien
Im Vergleich mit den Rattenzelllinien GPNT und RBE4 wurde die Wirkung des
Hydrocortisons im Medium der hCMEC/D3-Zellen erneut deutlich. Sowohl RBE4- als
auch GPNT-Zellen wurden ohne Hydrocortison kultiviert. Beide Zelllinien zeigten
stärkere induzierende Effekte nach der Behandlung mit den bekannten Pgp-
Induktoren Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin und Rifampicin (Abbildung 5.11)
so wie es für die hCMEC/D3-Zellen nach der Kultivierung ohne Hydrocortison
festzustellen war.
Dexamethason, Doxorubicin, Puromycin und Rifampicin führten in den
gewählten Konzentrationen zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität. In RBE4-Zellen
induzierten Dexamethason und Rifampicin in geringeren Konzentrationen als in
hCMEC/D3-Zellen (Abbildung 5.7). Außer den Induktoren wurden in den
immortalisierten Rattenhirnendothelzellen ebenfalls die Antiepileptika Carbamazepin,
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat in verschiedenen
Konzentrationen bezüglich ihrer modulierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität
untersucht.
84

Rhodamin 123 (% Kontrolle)
Rhodamin 123 (% Kontrolle)
ERGEBNISSE
A
B
1400
1200
1000
120
100
80
60
40
20
250
200
0
150
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle
Kontrolle
Dex 1 µM
GPNT-Zellen
Pgp-Induktoren
*
49 40
* *
47 3 33 3
Dex 0,5 µM
Dex 1 µM
*
Dox 0,92 µM
*
Puro 10,6 µM
*
Rif 10 µM
*
4 10 4 40
RBE4-Zellen
Pgp-Induktoren
* * * *
Dox 0,23 µM
Dox 0,46 µM
Puro 2,65 µM
Puro 5,3 µM
*
TQD 0,5 µM
Rif 2,5 µM
Rif 5 µM
Rif 10 µM
Rif 50 µM
*
3 3 3 3 3 3 3 33
TQD 0,5 µM
Abbildung 5.11: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in GPNT- (A) und RBE4-Zellen (B)
der Passagen 30-59 bzw. 61-71 nach der Behandlung mit Pgp-Induktoren. Die vier getesteten
Induktoren führten zu einer Induktion des Efflux. Dexamethason, Doxorubicin und Puromycin
zeigten die robustesten Effekte. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einer Inhibition des
Efflux. Daten sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen Versuche mit Pgp-
Induktoren wurden zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf diese bezogen.
Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante Unterschiede
wurden mit einer One-way ANOVA und dem Dunnett’s Posthoc-Test festgestellt und sind mit
Sternen (p < 0,05) angezeigt.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Dox: Doxorubicin, Puro: Puromycin, Rif: Rifampicin, TQD:
Tariquidar.
85

Rhodamin 123 (% Kontrolle)
Rhodamin 123 (% Kontrolle)
ERGEBNISSE
A
120
GPNT-Zellen
Antiepileptika
100
80
60
40
B
20
0
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
49 3 6 6 6 6 6 6 6 3 6 6 15 18 6 6
Kontrolle
CBZ 10 µM
Kontrolle
CBZ 10 µM
CBZ 30 µM
CBZ 50 µM
CBZ 100 µM
LEV 100 µM
LEV 300 µM
* *
PB 100 µM
PB 300 µM
PHT 10 µM
PHT 30 µM
PHT 50 µM
RBE4-Zellen
Antiepileptika
CBZ 30 µM
CBZ 50 µM
CBZ 100 µM
LEV 100 µM
LEV 300 µM
PB 100 µM
PB 300 µM
PHT 10 µM
PHT 30 µM
PHT 50 µM
TPM 30 µM
TPM 100 µM
VPA 100 µM
VPA 300 µM
41 6 3 6 6 6 12 11 11 6 6 6 7 7 9 6
*
*
TPM 30 µM
TPM 100 µM
VPA 100 µM
VPA 300 µM
Abbildung 5.12: Zusammenfassung aller Rhodamin-Versuche in GPNT- (A) und RBE4-Zellen (B)
der Passagen 30-59 bzw. 61-71 nach der Behandlung mit Antiepileptika. Zwei der sechs
getesteten Antiepileptika führten zu einer Induktion des Efflux. Carbamazepin (10 und 50 µM) und
Topiramat (100 µM) zeigten in RBE4-Zellen die robustesten induzierenden Effekte, Valproat (300
µM) inhibierte die Pgp-Funktionalität. Der Efflux in GPNT-Zellen wurde durch die getesteten
Antiepileptika nicht beeinflusst. Tariquidar führte in allen Versuchen zu einer Inhibition des
86

ERGEBNISSE
Efflux (nicht gezeigt). Daten sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Kontrollen der einzelnen
Versuche mit Antiepileptika wurden zusammengefasst (= 100 %) und die Versuchsgruppen auf
diese bezogen. Die Gruppengröße n ist für die jeweilige Versuchsgruppe angezeigt. Signifikante
Unterschiede wurden mit einer One-way ANOVA und dem Dunnett’s Posthoc-Test festgestellt
und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.
Abkürzungen: CBZ: Carbamazepin, LEV: Levetiracetam, PB: Phenobarbital, PHT: Phenytoin,
TPM: Topiramat, VPA: Valproat.
Für die sechs untersuchten Antiepileptika waren die Effekte in GPNT- und
RBE4-Zellen ebenfalls moderat. In GPNT-Zellen führte keines der getesteten
Antiepileptika zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität. In RBE4-Zellen wurde der
Efflux nach der Behandlung mit Carbamazepin (10 und 50 µM) und Topiramat (100
µM) induziert.
5.1.3.7 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp
Abschließend kann man sagen, dass die immortalisierte humane Zelllinie
hCMEC/D3 funktionelles Pgp aufweist. Die Funktionalität dieses Transporterproteins
konnte durch bekannte Pgp-Induktoren und –Inhibitoren beeinflusst werden. Trotz
des variablen Bilds bezüglich der getesteten Antiepileptika konnte mit Kumulations-
Assays gezeigt werden, dass diese Substanzen wenn auch im geringen Ausmaß in
der Lage sind, die Funktion des Transporterproteins Pgp zu modifizieren. Für
einzelne Konzentrationen der Antiepileptika, die tendenziell modulatorischen Effekte
auf die Pgp-Funktion zeigten (z.B. Levetiracetam und Phenobarbital), waren die
Gruppengrößen recht klein (Abbildung 5.9). Mit weiteren Versuchen zur Erhöhung
der Gruppengrößen könnten diese Tendenzen geklärt werden.
Verschiedene Faktoren, die sich auf den Efflux in hCMEC/D3-Zellen
auswirken können, wurden untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die
Mediumkomponente Hydrocortison während der Kultivierung und v.a. während der
Behandlung mit Induktoren und Antiepileptika einen entscheidenden Einfluss auf das
Ausmaß der Pgp-Funktionalität und der Modulation dieser hat.
87

ERGEBNISSE
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays
Der Transport-Assay, der mit Hilfe des Transwell-Systems durchgeführt wird,
dient der Erkennung von Substraten von Multidrug-Transportern. Zunächst wurden
die Transportversuche nach dem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll
durchgeführt; d.h. die sensitivere Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)
wurde der bidirektionalen Methode vorgezogen. Um zu klären, ob die
Versuchsbedingungen oder auch die Kultivierung der Zellen einen Einfluss auf den
Nachweis eines Transports haben, wurden verschiedene Aspekte wie zum Beispiel
die Dichtigkeit der Zellmembranen untersucht bzw. verändert. Zu diesem Zweck
wurden TEER-Werte bestimmt und die Mannitol-Permeabilität der Zellmembranen
untersucht.
Ausgehend von der Hypothese, dass in einem dichten Zellmonolayer mit
aktivem Pgp ein asymmetrischer Transport (von basolateral nach apikal) eines Pgp-
Transports nachgewiesen und dieser durch einen Pgp-Inhibitor gehemmt werden
kann, wurden die bekannten Pgp-Substrate Digoxin, Verapamil und Rhodamin 123 in
den humanen Zellen getestet.
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen
Das Ausmaß der Dichtigkeit des Zellmonolayers und der Tight junctions wird
zum einen durch den TEER-Wert, zum anderen durch die parazelluläre Permeabilität
polarer Substanzen wie Mannitol bestimmt. Die Widerstand der BHS in vivo zeigt
Werte bis zu 2000 Ω*cm 2 (LATERRA & GOLDSTEIN 2000). In In-vitro-
Untersuchungen mit humanen Hirnkapillarendothelien wurden in Abhängigkeit der
Präparation Werte zwischen 20 und 1400 Ω*cm 2 beschrieben (GRANT et al. 1998).
Des Weiteren wurden beispielsweise in Monolayern von Nierenepithelzellen (LLC-
Zellen), die regelmäßig für Transportstudien eingesetzt werden (POLLI et al. 2001;
GARBERG et al. 2005; BALTES et al. 2007a & 2007b; LUNA-TORTÓS et al. 2008,
2009 & 2010; KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010; ZHANG et al. 2010), im 6Well-
Format i.d.R. TEER-Werte von durchschnittlich 800 Ω*cm 2 für LLC-Wildtypzellen
gemessen. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen für diese Zellen in einem Bereich von
ca. 4-6 nm/s (LÖSCHER et al. 2011). Um einen Eindruck der Dichtigkeit der
hCMEC/D3-Zellen zu bekommen, wurden in einer Verlaufsuntersuchung über einen
88

TEER (*cm 2 )
ERGEBNISSE
Zeitraum von sieben Tagen die TEER-Werte konfluenter Monolayer von hCMEC/D3-
Zellen auf 6Well-Inserts bestimmt.
Für diese Untersuchung, die am Tag 1 nach Erreichen der Konfluenz begann,
wurden zwei verschiedenen Membraneinlagen der genannten Firmen Corning Costar
Corporation und Greiner Bio-One GmbH sowie zwei Seren unterschiedlicher
Herkunft verwendet. Laut einer Studie von POLLER et al. (2008) beeinflusst
humanes Serum im Medium die Dichtigkeit der Zellschicht der humanen Zellen.
Verlauf des Widerstands in hCMEC/D3-Zellen
70
60
50
40
30
20
10
72 96 120 144 168 192 216
Stunden
Corning humanes Serum Greiner humanes Serum
Corning bovines Serum Greiner bovines Serum
Abbildung 5.13: Bestimmung des Verlaufs der TEER-Werte für Membraneinlagen der Firmen
Corning und Greiner sowie zwei Seren unterschiedlicher Herkunft in hCMEC/D3-Zellen auf
6Well-Inserts. Die Messung begann am 1. Tag der Konfluenz. Die TEER-Werte verhielten sich
über die ersten 5 Tage (120 h) relativ gleich, wobei die Zellen auf den Corning-Inserts generell
höhere TEER-Werte aufwiesen. Ab Tag 5 zeigten die Zellen auf Corning-Membraneinlagen, die
mit bovinem Serum kultiviert wurden, einen leichten Anstieg bis Tag 8 (ca. 192 h).
Unterschiede zwischen humanem und bovinem Serum konnten nicht gezeigt werden. Die
Zellen wurden am Tag 7 nach Erreichen der Konfluenz für einen Transport-Assay mit Digoxin
eingesetzt. Der TEER wurde vor Beginn der Inkubation und nach Entnahme der letzten Proben
bestimmt. Alle untersuchten Gruppen zeigten am Versuchsende einen Anstieg des TEERs (=
letzter Probenzeitpunkt). Ein Transport von Digoxin war nicht nachweisbar. Die Werte sind als
Mittelwerte angezeigt.
Die Messung ergab unabhängig von Material oder Serum gleich niedrige
TEER-Werte, die ihr Maximum am Tag 8 nach der Aussaat auf den Membran-Inserts
89

ERGEBNISSE
erreichten. Es fiel auf, dass die Zellen auf Corning-Inserts in diesen Untersuchungen
stets höhere TEER-Werte zeigten. Im anschließenden Transportversuch war ein
Transport von Digoxin auf diesen Membraneinlagen (Corning) nicht zu erkennen. Für
weitere Transport-Assays wurden die Zellen weiterhin an Tag 7 spätestens an Tag
10 der Konfluenz für den Transportversuch verwendet. Die Messung des
Membranwiderstands als auch die Überprüfung der Mannitol-Permeabilität erfolgte
weiterhin für jeden einzelnen Versuch vor und nach der Inkubation mit dem
jeweiligen Substrat. In den Transport-Assays, in denen mit humanem Serum
kultivierte Zellen untersucht wurden, zeigten im Vergleich zum bovinen Serum keine
höheren TEER-Werte, die auf dichtere Zellschichten hinweisen. Aus diesem Grund
wurden die Zellen für weitere Versuche mit bovinem Serum kultiviert. Die
Permeabilitäten für Mannitol lagen zwischen 60-90 nm/s und waren damit
mindestens 5-mal höher als die festgelegte Grenze von 12 nm/s (nach LUNA-
TORTÓS et al. 2008) in LLC-Zellen.
Weder die Kultivierung der Zellen noch die Transport-Assays schienen durch
den Faktor Serum stark beeinflusst zu werden, denn die Mannitol-Permeabilitäten
waren für die getesteten Seren etwa gleich hoch (61,5-89,7 nm/s). Des Weiteren
zeigten sich nur leichte Unterschiede zwischen den transendothelialen
Widerständen.
90

% Digoxin
% Digoxin
% Digoxin
ERGEBNISSE
A
humanes Serum
hCMEC/D3 P:32
n=3
B
bovines Serum
hCMEC/D3 P:32
n=3
150
125
apikal
basolateral
150
125
100
100
75
TEER: 21,3 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
75
TEER: 21,3 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
C
180
160
140
120
100
80
60
bovines Serum
LLC-Zellen
* * * * *
TEER: 208,6 *cm 2
40
0 120 240 360 480 600
min
Abbildung 5.14: CETA zur Untersuchung des Transports von Digoxin (10 nM) in hCMEC/D3-
Zellen in Abhängigkeit des Serums (A & B) und im Vergleich mit LLC-Zellen (C) (K.
Römermann). Konzentrationsveränderungen in den Kammern wurden über 6 h bzw. 10 h auf
Membranen der Firma Greiner bzw. Corning im 6Well-Format gemessen. Die Zellen wurden am
10. bzw. 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transport-Assay eingesetzt. Die Mannitol-
Permeabilitäten für das humane Serum zeigten Werte von 62 nm/s und für das bovine Serum
87,5 nm/s. Die Widerstände der Zellmonolayer lagen bei 21,3 Ω*cm 2 . Die Widerstände der LLC-
Zellen zeigten Werte von 208,6 Ω*cm 2 , die Mannitol-Permeabilität war < 12 nm/s. Die Daten sind
als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikanzen wurden mit einer Two-way ANOVA und dem
Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.
Die in Abbildung 5.14 dargestellten Versuche wurden mit Zellen durchgeführt,
deren Kultivierung auf Greiner-Membraneinlagen erfolgte. Weitere
Transportversuche mit Digoxin auf Membraneinlagen der Firma Corning ließen
ebenfalls keinen asymmetrischen Transport dieser Substanz erkennen. Mit den
Substanzen Verapamil und Rhodamin 123, bei denen es sich auch um Pgp-
Substrate handelt, wurden das humane und das bovine Serum ebenfalls untersucht.
91

ERGEBNISSE
Für das Substrat Rhodamin 123 wurden in diesem Zusammenhang zusätzlich
Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner miteinander verglichen (Daten
nicht gezeigt). Aber auch in diesen Experimenten war es nicht möglich, einen
Transport durch Pgp nachzuweisen. Die TEER-Werte in diesem nicht dargestellten
Versuchen lagen in einem Bereich von 19,9–47,6 Ω*cm 2 . Dabei zeigten die
Zellmonolayer, die mit dem humanen Serum kultiviert wurden, in den einzelnen
Versuchen geringere Widerstände und höhere Mannitol-Permeabilitäten als die der
Gruppe mit bovinem Serum. Humanes Serum hatte unter den hier beschriebenen
Bedingungen scheinbar keinen Einfluss auf die Dichtigkeit der Monolayer und
demzufolge auf die Detektion des Transports der Substrate Digoxin, Verapamil und
Rhodamin 123 (Abbildung 5.15).
In den LLC-Zellen, deren Kultivierung mit bovinem Serum erfolgte, wurden
etwa 8-mal höhere TEER-Werte gemessen. Die Mehrheit anderer Arbeitsgruppen
verwendet zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen ebenfalls bovines Serum. Aus
diesem Grund entschieden wir uns ebenfalls für das bovine Serum zur weiteren
Kultivierung der humanen Zellen für Transport-Assays.
5.1.4.2 Auswahl eines geeigneten Pgp-Substrats für Transport-Assays
Die FDA empfiehlt für Studien, die den Transport durch Pgp bzw. die
Funktionalität des MDTs untersuchen, die Substanz Digoxin. Diese wurde in der
hiesigen Arbeitsgruppe in einer Konzentration von 10 nM in einem Gemisch mit
radioaktiv markierten Digoxin verwendet. Für die Untersuchungen der Eignung der
humanen Zellen für Transport-Assays wurde deshalb zunächst Digoxin verwendet.
Der Nachweis eines asymmetrischen Digoxin-Transports in monokultivierten
hCMEC/D3-Zellen war unabhängig vom Ursprung des Serums nicht möglich
(Abbildung 5.14). Auch nach Untersuchung weiterer Parameter, wie zum Beispiel
Membranmaterial, Mediumkomponenten oder Format der Membraneinlagen, konnte
ein Transport von Digoxin nicht nachgewiesen werden.
Deshalb wurden anschließend Verapamil, ebenfalls in einem Gemisch mit der
radioaktiv markierten Substanz, und der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 für
Transportversuche als Pgp-Substrat eingesetzt. In Abbildung 5.15 ist zur besseren
Vergleichbarkeit der drei verwendeten Pgp-Substrate ein weiterer Versuch mit
Digoxin dargestellt. In diesem Experiment konnte erneut kein asymmetrischer
Transport festgestellt werden.
92

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Digoxin
% Verapamil
ERGEBNISSE
A
150
125
Digoxin (10 nM)
hCMEC/D3 P:36
apikal
basolateral
n=3
B
150
125
100
Verapamil (10 nM)
hCMEC/D3 P:33
n=3
TEER: 21,3 *cm 2
100
75
TEER: 26,9 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
75
50
0 60 120 180 240 300 360
min
C
Rhodamin 123 (2 µM)
hCMEC/D3 P:34
n=5
D
Rhodamin 123 (2 µM)
hCMEC/D3 P:34
n=5
150
150
125
100
75
* *
125
100
75
* * *
TEER: 22,1 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
TEER: 17,0 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
Abbildung 5.15: Verschiedene Transportuntersuchungen zu Digoxin (10 nM), Verapamil
(10 nM) und Rhodamin 123 (2 µM) in hCMEC/D3-Zellen. Der Transport wurde über 6 h auf
Membranen im 6Well-Format des Herstellers Greiner beobachtet. Die Zellen wurden in Medium
mit bovinem Serum kultiviert und am 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch
verwendet. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen 72–89 nm/s. Die Widerstände waren
für alle vier gezeigten Versuche annähernd gleich. Ein Transport von Digoxin und Verapamil
konnte nicht nachgewiesen werden. Für Rhodamin 123 war ein Transport über die ersten 60
min (C) bzw. 90 min (D) des Versuchs nachweisbar. Im weiteren Verlauf dieser beiden Versuche
mit Rhodamin 123 war ein asymmetrischer Transport nicht mehr festzustellen. Die Werte sind
als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer Two-way ANOVA
und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet. Die
Unterschiede zwischen den Verapamil-Konzentrationen in beiden Kammern (B) wurden nicht
gekennzeichnet. Die basolaterale Konzentration war höher als die in der apikalen Kammer,
weshalb nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen wurde.
93

ERGEBNISSE
Für Digoxin sowie auch für Verapamil konnte kein Transport nachgewiesen
werden. Für Rhodamin 123 hingegen konnte in einem Experiment ein Transport
dieser Substanz über die ersten 60 min festgestellt werden (5.15 C). Dieser war aber
nach den folgenden Probenzeitpunkten nicht mehr nachweisbar. In einem einzelnen
Versuch, der unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, konnte erneut ein
Transport von Rhodamin 123 in den ersten 90 min nachgewiesen werden (5.15 D).
In weiteren Wiederholungen dieses Experiments mit monokultivierten humanen
Zellen war der Nachweis eines Transports nicht mehr möglich (Daten nicht gezeigt).
5.1.4.3 Einfluss des Versuchsmediums und weiterer Mediumszusätze
Des Weiteren wurde der Einfluss der Zusammensetzung des Mediums
untersucht. Das Medium und v.a. der zeitliche Ablauf einzelner Medien zur
Kultivierung und zur Versorgung der Zellen ab Erreichen der Konfluenz wurde den
Protokollen anderer Arbeitsgruppen nachempfunden. Besonders der Zusatz der
Substanz Simvastatin (aus der Gruppe der Statine, lipidsenkend) in der
Konzentration von 1 nM sollte großen Einfluss auf die Dichtigkeit der Zellmembran
haben und wurde nach dem Protokoll von P.-O. Couraud dem Medium einen Tag vor
dem Transportversuch zugefügt Dennoch ließ sich das in den durchgeführten
Transport-Assays nicht zeigen. Es wurden Versuche mit und ohne den Zusatz von 1
nM Simvastatin (1 Tag vor dem Versuch) durchgeführt. Ein entscheidender Einfluss
auf den Transport war nicht zu erkennen.
Zusätzlich zu Simvastatin wurden verschiedene Medien zur Kultivierung der
humanen Zellen getestet. Zum einen wurde ein Basalmedium, welches mit Serum,
Hydrocortison, Antibiotika, Lipidkonzentrat und einem Wachstumsfaktor (bFGF)
versetzt wurde, verwendet. Dies entsprach dem normalen Kulturmedium, welches
auf Seite 42 beschrieben ist. Zum anderen wurde dieses Kulturmedium mit den
bereits genannten Inhaltsstoffen sowie noch weiteren Wachstumsfaktoren (Vascular
Endothelial Growth Factor VEGF, Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1, Epidermal
Growth Factor EGF) versetzt. Eine weitere, reduzierte Variante des Mediums wurde
verwendet, sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben. Dieses Medium enthielt
weniger Serum (2,5 %) und Wachstumsfaktoren (nur bFGF) und sollte die möglichen
Wechselwirkungen des Kulturmediums mit den Versuchssubstanzen verringern.
Dennoch hatten die Komponenten des Mediums und deren Konzentrationen keinen
Einfluss auf das Ergebnis des Transport-Assays (Daten nicht gezeigt). Alle
94

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
Zusammensetzungen der getesteten Medien sind im Anhang (siehe S. 215)
aufgeführt.
A
+ 1 nM Simvastatin
hCMEC/D3 P:37
n=5
B
- Simvastatin
hCMEC/D3 P:30
n=5
150
125
apikal
basolateral
150
125
100
100
75
TEER: 17,9 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
75
TEER: 40,2 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
Abbildung 5.16: Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 (2 µM) in Abhängigkeit der
Substanz Simvastatin. Der Transport wurde über 6 h auf Corning-Membranen im 6Well-Format
beobachtet. Die Zellen wurden am 6. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch
verwendet. Die Monolayer, die Simvastatin vor dem Versuchen erhielten, zeigten eine Mannitol-
Permeabilität von 98 nm/s. Ohne Simvastatin lag die Permeabilität bei 75 nm/s. Die Zellen, die
kein Simvastatin erhielten, zeigten 2-mal höhere Widerstände. Ein Transport von Rhodamin 123
war nicht nachweisbar. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.
Die verschieden hohen Konzentrationen an Rhodamin 123 in beiden Kammern (B) wurden
nicht gekennzeichnet, weil die basolaterale Konzentration höher als die in der apikalen
Kammer war. Aus diesem Grund wurde nicht von einem Transport durch Pgp ausgegangen.
Ein Faktor, der ebenfalls Einfluss auf den Nachweis eines Transports haben
kann, ist das Versuchsmedium. Dazu wurde zunächst das Versuchsmedium Opti-
MEM ® getestet, welches weder Serum noch Wachstumsfaktoren enthielt. Dieses
Medium wird in Transportversuchen mit anderen Zelllinien in der hiesigen
Arbeitsgruppe standardmäßig eingesetzt. Ein Transport von Digoxin und Rhodamin
123 in hCMEC/D3-Zellen konnte aber mit dem Medium Opti-MEM ® nicht
nachgewiesen werden.
Weiterhin wurde der sogenannte HBSS-Puffer für Transport-Assays
verwendet (nach CARL et al. 2010). Diesem Puffer wurde kein Serum, sondern
lediglich 1 mM Natriumpyruvat als Energiequelle und 10 mM HEPES als
Puffersubstanz (u.a. Gewährleistung der Aufrechterhaltung der Enzymstrukturen und
95

ERGEBNISSE
-funktionen, Unabhängigkeit der Zellen vom pH-Wert) zugefügt. In zwei einzelnen
Versuchen konnte auf diese Weise ein Transport von Rhodamin 123 festgestellt
werden (Abbildung 5.15 C & D). Diese Ergebnisse waren aber auf 6Well-
Membraneinlagen nicht reproduzierbar.
5.1.4.4 Einfluss des Membranmaterials
Ein weiterer beeinflussender Faktor ist das Material der Membraneinlagen, auf
denen die Zellen für die Transportversuche kultiviert werden. Bisher wurden in der
Arbeitsgruppe Membraneinlagen der Firma Corning verwendet. Aufgrund von
Lieferproblemen wurde der Herstellungsprozess der Membranen geändert, was
Einfluss auf die Versuchsergebnisse hatte. Es wurde notwendig, Membranen
verschiedener Hersteller zu untersuchen. Für die humanen Zellen wurden
Membraneinlagen der Firma Greiner und des bisherigen Herstellers Corning
miteinander verglichen.
Auffällig war, dass die Membraneinlagen der Firma Greiner (gleiche
Porengröße, aber höhere Porendichte) für die hCMEC/D3-Zellen stets niedrigere
TEER-Werte zeigten als die von Corning (siehe Abschnitt 5.1.4.1), obwohl die
Mannitol-Permeabilität für beide Hersteller ähnlich hoch war. Einmalig wurden auch
Membraneinlagen der Firma Millipore verwendet. Die Membran-Inserts der Firma
Greiner schienen laut diesen Transport-Assays zur Untersuchung des Transports in
hCMEC/D3-Zellen geeigneter zu sein. Dieser Versuch wurden unter den gleichen
und auch leicht modifizierten Bedingungen mehrere Male wiederholt, dennoch
konnte dieses Ergebnis nicht reproduziert werden. Nach diesen Versuchen kann
keinem der Membraneinlagen-Hersteller ein Vorzug für Transportversuche der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode gegeben werden.
96

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
Greiner Inserts
hCMEC/D3 P:34
n=5
B
Corning Inserts
hCMEC/D3 P:34
n=3
150
125
100
apikal
basolateral
150
125
100
75
* * TEER: 22,1 *cm 2
75
50
0 60 120 180 240 300 360
min
TEER: 46,7 *cm 2
50
0 60 120 180 240 300 360
min
C
150
Millipore Inserts
hCMEC/D3 P:35
n=3
125
100
75
TEER: 22,5 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.17: CETA mit 2 µM Rhodamin 123. Es wurde der Einfluss des
Membranmaterials verschiedener Hersteller untersucht. Alle Gruppen erhielten am Tag vor
dem Versuch 1 nM Simvastatin. Der Transport wurde über 6 bzw. 4 h auf Membranen im 6Well-
Format beobachtet. Die Zellen wurden am 7. bzw. 10. Tag nach Erreichen der Konfluenz für die
Versuche verwendet. Die Monolayer auf Greiner-Inserts zeigten trotz niedrigeren Widerstands
einen Transport von basolateral nach apikal innerhalb der ersten Stunde des Assays. Die
Mannitol-Permeabilität in den Transportversuchen mit Rhodamin 123 zeigte einen Wert von 77
nm/s, für die Monolayer auf Millipore-Inserts 112 nm/s. Ein Transport des Substrats Rhodamin
123 war mit Inserts der Hersteller Corning und Millipore nicht festzustellen. Die Werte sind als
Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und
dem Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.
Die ersten Transportexperimente wurden mit dem Material Polyester
durchgeführt. In den Abschnitten 5.1.4.6 (Einfluss des Formats der
Membraneinlagen) und 5.1.4.7 (Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit
Astrozyten) ist neben einem anderen Format auch der Vergleich zwischen zwei
97

ERGEBNISSE
verschiedenen Materialien (Polyester und Polycarbonat) dargestellt, auf den genauer
unter den genannten Punkten eingegangen wird.
5.1.4.5 Bidirektionaler Transport-Assay
Die ersten Versuche wurden mittels der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA), die sich für den Nachweis des
Transports von Antiepileptika als sensitiver erwiesen hat, durchgeführt. Dies führte
aber nur bedingt zum Nachweis eines asymmetrischen Transports, weshalb weitere
Transportversuche mit der bidirektionalen Methode durchgeführt wurden. Andere
Arbeitsgruppen, die Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen
durchführen, verwenden ausschließlich den bidirektionalen Assay (POLLER et al.
2008; CARL et al. 2010). Daher wurde dieser zum Vergleich mit dem CETA
angewandt. Es wurde nur die Substanz Rhodamin 123 als Substrat eingesetzt.
Digoxin wurden unter diesen Bedingungen nicht untersucht. Wenn die Transportratio
einen Wert von mindestens 1,5 aufweist, spricht man von einem Transport.
Mit der bidirektionalen Methode gelang es nicht, einen eindeutigen
asymmetrischen Transport nachzuweisen. In Abbildung 5.18 A war ein geringer
asymmetrischer Transport zu erkennen, der allerdings eine Transportrate von nur 1,2
aufwies. Alle Transportraten für die hCMEC/D3-Zellen zeigten niedrigere Werte als
1,5. Obwohl in diesem Zusammenhang Medien mit einem unterschiedlichem
Ausmaß an Mediumszusätzen (v.a. Wachstumsfaktoren) getestet wurden, ließ dies
keinen Einfluss erkennen. Die Mannitol-Permeabilität war stets höher als der
Grenzwert von 12 nm/s. Es fiel auf, dass die Greiner-Membraneinlagen eine höhere
Transportrate aufwiesen, aber die TEER-Werte niedriger ausfielen. Dies ist mit den
Ergebnissen der Transportversuche nach der CETA-Methode vergleichbar. Deshalb
wurde für weitere Transportversuche die Konzentrationsgleichgewichtsmethode
angewandt.
98

% Rhodamin 123
% Digoxin
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
C
100
80
60
25
20
15
10
5
Greiner Inserts
hCMEC/D3 P:32
n=6
TR: 1,2
TEER: 20,6 *cm 2
* * * *
b-A
a-B
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120
min
100
80
60
25
20
15
10
5
Corning Inserts
hCMEC/D3 P:36
n=2
TR: 1,12
TEER: 49,0 *cm 2
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120
min
*
B
D
100
80
60
25
20
15
10
5
Corning Inserts
hCMEC/D3 P:35
n=1
TR: 1,04
TEER: 53,2 *cm 2
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120
min
100
75
50
25
Corning Inserts; LLC-Wt
Digoxin
n=3
TR: 3,8
TEER: 378,8 *cm 2
*
* * * *
0
0 120 240 360 480 600
min
Abbildung 5.18: Bidirektionale Transport-Assays mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen
(A-C) und Beispiel eines bidirektionalen Transports von Digoxin in LLC-Wildtyp (Wt)-Zellen von
C. Luna-Tortós (D). Der Transport-Assay wurde über einen Zeitraum von 2 h (A-C) bzw. 6 h (D)
auf Membranen im 6Well-Format der Hersteller Greiner (A) und Corning (B-D) durchgeführt. Die
Zellen wurden am 7. bzw. 8. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch eingesetzt. Die
Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 17,4 %/h (A), 11,4 %/h (B), und 9,9 (C) %/h. Die
Widerstände für die hCMEC/D3-Zellen zeigten Werte von 20–53 Ω*cm 2 . Für den unter C
gezeigten Versuch wurde Medium mit mehr Wachstumsfaktoren für die Zellkultivierung
verwendet. Für A und B wurden die Zellen mit dem unter Material und Methoden beschriebenen
Medium kultiviert. Die Transportratio lag für die unter A-C dargestellten Versuche < 1,5. Ein
Transport von Rhodamin 123 konnte nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis eines
asymmetrischen Transports von Digoxin (TR: 3,8) konnte in den LLC-Zellen erbracht werden.
Der TEER lag bei 378,3 Ω*cm 2 .
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den
Digoxin-Konzentrationen in den beiden Kammern wurden mittels Two-way ANOVA und dem
Bonferroni-Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05).
Abkürzung: TR: Transportratio
99

ERGEBNISSE
5.1.4.6 Einfluss des Formats der Membraneinlagen
Das Format der Transwell-Inserts könnte ebenfalls einen Einfluss auf den
Transportnachweis haben. Ein teilweiser Transport von Rhodamin 123 auf größeren
Membranen im 6Well-Format (Fläche in Abhängigkeit vom Hersteller: 4,254 bzw.
4,67 cm 2 ; siehe Tabelle 4.2) wurde nur in zwei einzelnen Versuchen nachgewiesen.
Die hCMEC/D3-Zellen wurden deshalb auf 12Well-Membranen kultiviert, die eine
kleinere Wachstumsfläche aufwiesen (1,12 cm 2 ; siehe Tabelle 4.2). Die Membranen
bestanden aus Polyester (PET) bzw. Polycarbonat (PC) und stammten von Corning.
Unabhängig vom Membranmaterial zeigten die Zellen im 12Well-Format wesentlich
höhere TEER-Werte, die sich in einem Bereich von ca. 120 bis 165 Ω*cm 2 bewegten
(siehe auch Tabelle 5.4, S. 107 ff.).
Mit der Kultivierung der Zellen auf Membraneinlagen mit einer kleineren
Wachstumsfläche konnte ein asymmetrischer Transport des Fluoreszenzfarbstoffs
Rhodamin 123 in den humanen Zellen mit der CETA-Methode nachgewiesen
werden. Der Vergleich der beiden verwendeten Formate der Membran-Inserts ist in
der nachfolgenden Abbildung 5.19 dargestellt.
5.1.4.7 Einfluss der Umgebung der Zellen: Kokultur mit Astrozyten
Ein weiterer Faktor, der Einfluss auf die Eignung der humanen Zellen im
Transwell-Modell nehmen kann, ist die Kokultur mit Astrozyten. Dazu wurden die
Astrozyten auf der Unterseite (der basolateralen Kammer zugewandt) der
Membranen im 12Well-Format kultiviert, die humanen Hirnkapillarzellen wie gewohnt
auf der Membran. Die nachfolgende Abbildung zeigt den Vergleich von
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen auf 6- und 12Well-Membranen sowie den
Vergleich zwischen Mono- und Kokultur dieser Zellen mit Astrozyten.
100

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
150
125
Monokultur, 6Well (PET)
hCMEC/D3 P:31
n=3
apical
basolateral
B
150
125
Monokultur, 12Well (PET)
hCMEC/D3 P:30
n=3
* * *
*
*
100
100
75
TEER: 29,6 *cm 2
50
0 30 60 90 120
min
75
TEER: 119,0 *cm 2
50
0 30 60 90 120 150 180 210 240
min
C
Kokultur, 12Well (PET)
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7
n=6
D
Kokultur, 12Well (PC)
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15
n=3
150
125
100
* * *
150
125
100
*
*
*
* *
75
TEER: 155,2 *cm 2
50
0 30 60 90 120 150 180 210 240
min
75
TEER: 162,6 *cm 2
50
0 30 60 90 120 150 180 210 240
min
Abbildung 5.19: Zwei vergleichende Transport-Assays (CETA) mit monokultivierten (A & B) und
kokultivierten hCMEC/D3-Zellen (C & D) und 2 µM Rhodamin. Die Kultivierung der Zellen
erfolgte auf Membraneinlagen der Firma Corning im 6Well-Format (A) bzw. 12Well-Format (B-
D). Die Membranen bestanden aus Polyester (A-C) bzw. aus Polycarbonat (D). Die Zellen
wurden an Tag 10 und 7 nach Erreichen der Konfluenz für den Transport-Assay verwendet.
Veränderungen der Rhodamin-Konzentration in der apikalen und basolateralen Kammer
wurden über 2 h (A) bzw. 4 h (B-D) beobachtet. Die TEER-Werte waren im Vergleich zu denen
monokultivierter hCMEC/D3-Zellen auf Membraneinlagen im 6Well-Format etwa 4-mal erhöht (A
& B). Die Mannitol-Permeabilitäten lagen für die Monokultur auf 12Well-Membraneinlagen (B)
bei 366,5 nm/s und für die Kokultur auf Polyethylen-Membraneinlagen (C) bei 24 nm/s. Die
kokultivierten Zellen auf Polycarbonat-Membraneinlagen (D) zeigten eine Mannitol-
Permeabilität von 191,5 nm/s. Für den unter A dargestellten Versuch wurde Mannitol nicht
untersucht. Die mit Astrozyten kokultivierten humanen Zellen auf 12Well-Membraneinlagen
wiesen höhere TEER-Werte und i.d.R. niedrigere Mannitol-Permeabilitäten als monokultivierte
Zellen auf.
Ein Transport von Rhodamin 123 (2 µM) in monokultivierten hCMEC/D3-Zellen und deren
Kokultur mit Astrozyten konnte gezeigt werden (B-D). Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM
101

ERGEBNISSE
angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mittels Two-way ANOVA und dem Bonferroni-
Posthoc-Test festgestellt und sind mit Sternen (p < 0,05) gekennzeichnet.
Mit der Kultur der humanen Zellen auf 12Well-Membraneinlagen konnte ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden. Diese
Kultivierung ging mit einer Erhöhung des TEER-Werts einher. Die Kokultur mit
Astrozyten führte zu einer erneuten Steigerung des TEER-Werts sowie einer
niedrigeren Mannitol-Permeabilität. Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin
123 wurde festgestellt. Die Permeabilität für Mannitol wurde für die monokultivierten
Zellen auf 6Well-Membraneinlagen (5.19 A) nicht untersucht. Die Mannitol-
Permeabilitäten der kokultivierten Zellen zeigten starke Schwankungen, wobei keine
Korrelationen mit den TEER-Werten festgestellt wurden. Der Widerstand zeigte 4-7-
fach erhöhte Werte für die kokultivierten Zellen. Die Konzentrationsveränderungen
verliefen außerdem gleichmäßiger über die Versuchsdauer und zeigten keinen
Abfall. Die Unterschiede des Substratgehalts zwischen apikaler und basolateraler
Kammer fielen für die Membranen aus Polycarbonat deutlicher aus. Des Weiteren
zeigten die Monolayer der Zellen auf den Membran-Inserts aus Polycarbonat höhere
TEER-Werte.
Der Transport von Digoxin konnte in monokultivierten hCMEC/D3-Zellen nicht
nachgewiesen werden. Der Nachweis für Rhodamin-Transport in diesen Zellen
wurde mit der Kokultur mit Astrozyten möglich. Deshalb wurde Digoxin ebenfalls in
den kokultivierten humanen Zellen untersucht.
102

% Digoxin
% Digoxin
ERGEBNISSE
A
Digoxin (10 nM), Monokultur
hCMEC/D3 P:30
n=3
B
Digoxin (10 nM), Kokultur
hCMEC/D3 P:4 + Astrozyten P:15
n=3
150
125
apical
basolateral
150
125
100
100
75
TEER: 127,4 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
75
TEER: 159,8 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.20: Transport-Assays (CETA) mit 10 nM Digoxin in mono- und kokultivierten
hCMEC/D3-Zellen. Die Zellen wurden auf Membraneinlagen (Corning) im 12Well-Format
kultiviert und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transportversuch eingesetzt.
Konzentrationsveränderungen wurden über einen Zeitraum von 4 h beobachtet. Die TEER-
Werte waren im Vergleich zu denen monokultivierter hCMEC/D3-Zellen höher. Die Mannitol-
Permeabilität lag bei einem Wert von 366 nm/s für die monokultivierten Zellen, für die Kokultur
lag diese bei 191 nm/s. Ein Transport von Digoxin konnte nicht gezeigt werden. Die Daten sind
als Mittelwerte ± SEM angegeben.
Die Steigerung des TEER durch die Kultivierung der humanen
Hirnkapillarendothelien auf kleineren Membran-Inserts und deren Kokultur mit
Astrozyten konnte mit diesem Transportversuch bestätigt werden. Ein Transport von
Digoxin wurde nicht nachgewiesen.
5.1.4.8 Überprüfung des Transports durch Pgp
Der Transport von Rhodamin 123 konnte in kokultivierten und teilweise in
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen nachgewiesen werden. Ob dieser Transport
spezifisch war und auf die Funktionalität von Pgp zurückzuführen war, wurde mit
spezifischen Pgp-Inhibitoren wie zum Beispiel Valspodar (PSC833) und Tariquidar
überprüft. Die Zellen wurden dazu zeitgleich mit dem Substrat Rhodamin 123 und
dem Inhibitor inkubiert. Wenn die Konzentrationsveränderungen in den Kammern
des Transwell-Systems durch spezifischen Transport von Pgp hervorgerufen wurden,
sollte der Transport durch die Inhibitoren gehemmt werden. Die nachfolgende
Abbildung zeigt beispielhafte Versuche, in denen der Transport von Rhodamin
festgestellt wurde und Inhibitoren zur Überprüfung des Transports mitgeführt wurden.
103

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
150
125
100
75
Rhodamin 123 (2 µM)
hCMEC/D3 P:30
n=3
* * *
apikal
basolateral
*
AUC/h: 785,3
50
0 60 120 180 240
min
*
TEER: 119,0 *cm 2
B
150
125
100
75
*
+ PSC833 (10 µM)
hCMEC/D3 P:30
n=3
*
*
50
0 60 120 180 240
min
*
AUC/h: 760
TEER: 131,3 *cm 2
Veränderung
der AUC/h
- 3,2 %
C
Rhodamin 123 (2 µM)
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15
n=3
D
+ PSC833 (10 µM)
hCMEC/D3 P:30 + Astrozyten P:15
n=3
150
125
100
* * *
* *
150
125
100
*
*
* * *
- 44,1 %
75
AUC/h: 716,3
TEER: 162,6 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
75
AUC/h: 400,3
TEER: 164,9 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
E
Rhodamin 123 (2 µM)
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7
n=6
F
+ TQD (0,5 µM)
hCMEC/D3 P:35 + Astrozyten P:7
n=5
150
125
100
* * *
150
125
100
- 56,9 %
75
AUC/h: 147,4
TEER: 155,2 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
75
AUC/h: 63,5
TEER: 163,1 *cm 2
50
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.21: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in hCMEC/D3-Zellen in
Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–F) auf Transwell-Inserts im
12Well-Format (Corning). Die Experimente wurden über eine Dauer von 4 h durchgeführt. Die
Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat (A–D) und Polyester (E & F) kultiviert
und am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Versuch verwendet. Graph A, C und E
zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen von Rhodamin 123 gemessen
104

ERGEBNISSE
wurden. Unter B, D und F sind Versuche dargestellt, in denen die Inhibition des Substrats
durch Hemmstoffe Valspodar (PSC833) und Tariquidar (TQD) untersucht wurde. Alle
Experimente zeigten einen asymmetrischen Transport von Rhodamin 123. Die Inhibition des
Rhodamin-Transports konnte nicht oder nur teilweise nachgewiesen werden. Die AUC
verringerte sich um maximal 56,9 % im Vergleich zum Transport (B, D und F). Für die
monokultivierten Zellen (A & B) wurden niedrigere TEER-Werte gemessen als für die
kokultivierten Zellen. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten Werte von 366,5 nm/s für die
monokultivierten hCMEC/D3-Zellen (A & B). Für die mit Astrozyten kokultivierten Zellen wurden
Mannitol-Permeabilitäten von 191,5 nm/s (C & D) bzw. 24 nm/s (E & F) festgestellt.
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer
Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05)
angezeigt.
Die Abbildung 5.21 zeigt, dass der asymmetrische Transport von Rhodamin
123 nicht vollständig durch die spezifischen Pgp-Inhibitoren PSC833 und Tariquidar
gehemmt wurde. Die Graphen B, D und F zeigen jeweils die Ergebnisse nach
Inkubation mit den Inhibitoren. Dabei fielen die Konzentrationsunterschiede zwischen
den Kammern zwar niedriger aus als ohne Inhibitor (C & E), aber sie waren
zumindest für Abbildung 5.21 B & D noch signifikant. Der Transport-Assay (unter
Graph E dargestellt) zeigte leichte Konzentrationsunterschiede zwischen der
apikalen und basolateralen Kammer, die auf einen Transport von Rhodamin 123
hinweisen. Dieser Transport wurde durch die Zugabe von 0,5 µM Tariquidar
vollständig aufgehoben. Der jeweilige Netto-Transport pro Stunde, der als Fläche
unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) angegeben ist, sollte nach Zugabe
eines Inhibitors um mindestens 50 % verringert sein. Die AUC zeigte nach der
Inkubation mit den Inhibitoren niedrigere Werte als ohne, der Netto-Transport/h sank
um 44,1-56,9 % (D & F). Einmalig verringerte sich die AUC um 3,2 % (B). Die AUC
fiel für die Transportversuche auf Polyester-Membranen (E & F) geringer aus als für
die Polycarbonat-Inserts (A-D).
Die Mannitol-Permeabilitäten für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen lagen
bei 366,5 nm/s, damit waren diese im Vergleich zu den kokultivierten Zellen etwa 2-
(C & D) bzw. 15-fach erhöht (E & F).
105

ERGEBNISSE
5.1.4.9 Integrität der Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-Permeabilität
Die folgende Tabelle 5.4 gibt eine Übersicht zu allen gemessenen TEER-
Werten und Mannitol-Permeabilitäten der Transportversuche nach der bidirektionalen
und CETA-Methode in hCMEC/D3-Zellen. Es fiel zunächst auf, dass die Zellen auf
Corning-Inserts im 6Well-Format etwa 2-mal höhere TEER-Werte zeigten als auf den
anderen verwendeten Membran-Inserts (Greiner und Millipore). Dies galt für beide
angewandten Methoden der Transport-Assays. Bezüglich der Seren waren keine
großen Unterschiede zu verzeichnen. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten für
dieses Format keine nennenswerten Unterschiede.
Besonders auffällig waren die verschiedenen hohen TEER-Werte und
Mannitol-Permeabilitäten zwischen Membran-Inserts im 6- und 12Well-Format. Die
Widerstände der kleineren Membranen waren ca. 5- bis 7-mal höher, gleichzeitig
erhöhten sich die Mannitol-Permeabilitäten um etwa das Doppelte oder sogar
Dreifache der 6Well-Membraneinlagen, was keinen Rückschluss auf dichtere
Membranen im 12Well-Format zulässt. Allerdings führte die Kokultur der hCMEC/D3-
Zellen mit Astrozyten bei der Verwendung von 12Well-Membranen zu einer
Erhöhung der TEER-Werte und einer Erniedrigung der Mannitol-Permeabilitäten. Die
Werte für Mannitol waren trotz dessen höher als im Vergleich mit den größeren
6Well-Membraneinlagen.
106

ERGEBNISSE
Tabelle 5.4: Übersicht der TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten in Bezug auf
Literaturdaten und die untersuchten Parameter Membranhersteller, -material und –
format, Serum und Kokultur in Transportversuchen mit hCMEC/D3-Zellen dieser
These.
Daten der Literatur
Zelllinie/
Zellen
Serum
Kokultur
TEER
(Ω*cm 2 )
Parazelluläre
Permeabilität
(nm/s)
Referenz
hCMEC/D3
Bovin
Nein
40
Sucrose: 27,5
WEKSLER et al. 2005
hCMEC/D3
Bovin
70
Sucrose: 2,81
CUCULLO et al. 2008
hCMEC/D3
Human
Nein
k. A.
Sucrose: 15,8
POLLER et al. 2008
hCMEC/D3
Human
Nein
50-70
k. A.
VU et al. 2009
hCMEC/D3
Bovin
Nein
k. A.
Mannitol: 24,7
CARL et al. 2010
hCMEC/D3
Human
Nein/Ja
43/63
k. A.
HATHERELL et al. 2011
hCMEC/D3
Bovin
Nein
10
k. A.
LOPEZ-RAMIREZ et al.
2012
hCMEC/D3
Human
Nein
15-30
k. A.
URICH et al. 2012
LCC
Bovin
Nein
800
Mannitol: 4-6
LÖSCHER et al. 2011
Primärkultur
Bovin
Ja
169-500
Fluorescein: 1,87
PERRIÈRE et al. 2005
(Ratte)
Primärkultur
Bovin
Nein
400-700
Mannitol: 18
FRANKE et al. 2000
(Schwein)
107

ERGEBNISSE
-format
Corning,
Polyester,
6Well
Membranmaterial/
Daten der These
Serum Kokultur
Mannitol- Mannitol-
TEER
Asymmetr.
Permeabilität Permeabilität
(Ω*cm 2 )
Transport
(nm/s)
(%/h)
Human Nein 39,7 85,7 24,8 -
Nein
Nein
Nein
Nein
Nein
Nein
Nein
Nein
Nein*
Nein
Nein*
Nein
Nein
Nein*
Bovin Nein
Nein*
Nein
Nein*
Nein
Nein*
Nein
Nein*
Nein
Ja
Ja
Ja
51,4
46,7
39,2
46,7
32,7
46,7
40,2
32,7
32,7
29,6
28,0
38,1
51,4
53,7
53,7
51,4
49,0
51,4
43,2
49,0
37,4
37,4
32,7
62,5
n.d.
78,9
75,3
152,9
69,6
75,0
n.d.
n.d.
10,1
n.d.
11,0
14,0
16,5
10,4
11,8
n.d.
n.d.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
13,7
-
13,7
-
11,4
-
8,2
-
8,2
-
10,4
-
10,4
-
9,9
-
9,9
-
12,3
-
12,3
-
13,0
-
13,0
-
86,9
15,1
-
42,4 ± 8,2 85,9 ± 28,2 11,8 ± 2,1
35,5
88,6
14,0
-
29,9
77,5
13,7
-
44,8
107,9
11,5
-
36,7 ± 6,1 91,3 ± 12,6 13,1 ± 1,1
Gesamt 41,7 ± 8,2 87,5 ± 24,7 11,9 ± 2,1
Alle
41,7 ± 8,1 87,3 ± 23,6 12,5 ± 3,3
Seren
108

ERGEBNISSE
Serum
Kokultur
TEER
(Ω*cm 2 )
Membranmaterial/
-format
Mannitol-
Permeabilität
(nm/s)
Mannitol-
Permeabilität
(%/h)
Asymm.
Transport
Nein
21,3
61,5
34,6
-
Human
Nein
Nein
21,3
19,9
83,4
83,4
22,4
22,4
-
-
20,8 ± 0,7 76,1 ± 10,3 26,5 ± 5,8
Nein
26,9
89,9
10,7
-
Nein
21,3
89,7
17,0
-
Nein
21,3
77,2
-
Nein
17,0
88,1
17,0
-
Nein
21,3
71,5
16,5
-
Nein
17,0
254,8
30,3
-
Nein
22,1
77,2
13,6
(+)
Greiner,
Nein
17,0
92,5
18,5
(+)
Polyester,
Nein
17,1
64,5
19,7
-
6Well
Bovin
Nein*
17,0
n.d.
n.d.
-
Nein
17,4
98,4
21,0
-
Nein
17,0
84,5
19,0
-
Nein
21,3
71,5
16,5
-
Nein
20,6
#
17,4
-
Nein
17,0
n.d
n.d
-
Nein*
17,0
n.d.
n.d
-
Nein
17,0
91,4
18,7
-
Nein
17,0
85,0
20,6
-
19,0 ± 2,8 95,4 ± 45,2 18,3 ± 4,2
Alle
Seren
19,3 ± 2,7 92,0 ± 41,9 19,8 ± 5,5
Millipore,
Nein
22,5
112,0
21,1
-
Polyester,
Bovin
Nein*
22,5
112,0
21,1
-
6Well
22,5 ± 0 112,0 ± 0 21,0 ± 0
Gesamt 6Well Nein 31,5 ± 13,0 90,1 ± 37,7 15,7 ± 5,8
Gesamt 6Well Ja 36,7 ± 6,1 91,3 ± 12,6 13,1 ± 1,1
Gesamt 6Well 31,9 ± 12,8 90,2 ± 35,9 15,5 ± 5,6
109

ERGEBNISSE
Serum
Kokultur
TEER
(Ω*cm 2 )
Membranmaterial/
-format
Mannitol-
Permeabilität
(nm/s)
Mannitol-
Permeabilität
(%/h)
Asymm.
Transport
Nein
127,4
366,5
35,7
-
Nein*
136,5
366,5
35,7
-
Nein
39,2
78,9
5,6
-
Corning,
Polyester,
12Well +
Bovin
Ja
Ja*
Ja
101,0 ± 43,9 270,6 ± 135,6 25,7 ± 14,2
159,8
191,5
27,8
165,8
191,5
27,8
155,2
112,0
21,1
-
-
+
Ja*
163,1
112,0
21,1
-
161,0± 4,0 151,8 ± 39,8 24,5 ± 3,4
Gesamt 135,3 ± 41,4 202,7 ± 110,6 25,0 ± 9,6
Nein
119,0
366,5
35,7
+
Corning,
Polycarbonat,
12Well +
Bovin
Nein*
Ja
Ja*
131,3
366,5
35,7
125,2 ± 6,2 366,5 ± 0 35,7 ± 0
162,6
191,5
27,8
164,9
191,5
27,8
163,8 ± 1,2 191,5 ± 0 27,8 ± 0
+
+
+
Gesamt 144,5 ± 19,8 279,0 ± 87,5 31,8 ± 4,0
Gesamt 12Well Nein 110,7 ± 36,2 309,0 ± 115,0 29,7 ± 12,0
Gesamt 12Well Ja 161,9 ± 3,5 165,0 ± 37,5 25,6 ± 3,2
Gesamt 12Well 138,6 ± 35,4 230,4 ± 109,2 27,4 ± 8,7
k. A. keine Angaben n.d. Messung nicht durchgeführt
+ asymmetrischer Transport - kein asymmetrischer Transport
(+) asymmetrischer Transport nicht über gesamte Versuchsdauer messbar
* Messung nach Zugabe eines Inhibitors (Tariquidar oder Valspodar)
#
nur eine Probe zur Bestimmung der Mannitol-Permeabilität entnommen; eine
Steigung konnte deshalb nicht berechnet werden; Angabe in (%/h); keine
Berücksichtigung in MW und Standardabweichung
Die meisten Daten für die Mannitol-Permeabilität wurden in nm/s angegeben, wobei
die Längeneinheit Bezug zur jeweiligen Wachstumsfläche nimmt. Letztlich befanden sich alle
diese Daten in einem Bereich von 15,5-27,4 %/h (Gesamt 6- und 12Well) Wobei der
Grenzwert bei 1 %/h liegt, der nicht überschritten werden sollte (LUNA-TORTÓS et al. 2008).
110

ERGEBNISSE
5.1.4.10 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen
Für die Untersuchung des Transports in hCMEC/D3-Zellen wurden viele
verschiedene Parameter untersucht und modifiziert. Es wurde deutlich, dass ein
asymmetrischer Transport der radioaktiv markierten Substanzen Digoxin und
Verapamil nicht detektierbar war. Der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 hingegen
wurde aktiv von Pgp von der basolateralen in die apikale Kammer transportiert.
Die Ergebnisse für die monokultivierten hCMEC/D3-Zellen waren aber
inkonsistent. Lediglich in zwei von 35 einzelnen Versuchen nach der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode konnte der Transport von Rhodamin 123 auf
6Well-Membranen der Firma Greiner nachgewiesen werden, obwohl die Zellen auf
Corning-Membranen höhere transendotheliale Widerstände zeigten (Corning: 41,7 ±
8,2 Ω*cm 2 ; Greiner: 19,3 ± 2,7 Ω*cm 2 ). Die Kultivierung der humanen Zellen auf
kleineren Inserts (12Well-Format; Hersteller: Corning) führte zu einem Anstieg des
TEER, der mit einer höheren Mannitol-Permeabilität einherging (6Well: TEER: 31,9 ±
12,8 Ω*cm 2 und P app(Mannitol) : 90,2 ± 35,9 nm/s; 12Well: TEER: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2
und P app(Mannitol) : 230,4 ± 109,2 nm/s).
Mit der Kokultivierung der Endothelzellen mit Astrozyten ließ sich der TEER
nochmals steigern (Monokultur: 110,7 ± 36,2 Ω*cm 2 vs. Kokultur 161,9 ± 3,5 Ω*cm 2 )
und die Mannitol-Permeabilität sank (Monokultur: 309,0 ± 115,0 Ω*cm 2 vs. Kokultur:
165,0 ± 37,5 nm/s). Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte
detektiert werden. Dabei wurden die größten Konzentrationsunterschiede zwischen
der apikalen und basolateralen Kammer für Membraneinlagen aus Polycarbonat
(Corning) festgestellt. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen stets weit über der
festgelegten Grenze von 12 nm/s (nach LUNA-TORTÓS et al. 2008), unabhängig
vom Material der Membran-Inserts und vom Serum waren die Werte durchschnittlich
für das 6Well-Format etwa 8-mal und für das 12Well-Format ca. 18-mal höher als der
Grenzwert (siehe Tabelle 5.4). Deshalb muss man davon ausgehen, dass die
Monolayer der hCMEC/D3-Zellen keine ausreichende Integrität aufwiesen und
demzufolge der Transport von Antiepileptika nicht untersucht wurde.
Der asymmetrische Rhodamin-Transport konnte mit den Pgp-Inhibitoren
Valspodar und Tariquidar nur in einem von insgesamt acht durchgeführten
Versuchen mit Inhibitoren vollständig gehemmt werden (Abbildung 5.21 F). Die AUC
verringerte sich im Vergleich ohne Inhibitor um über 50 %.
111

ERGEBNISSE
In der Tabelle 5.5 sind alle Resultate der Transport-Assays, die mit der CETA-
Methode untersucht wurden, zusammengefasst und sollen eine Übersicht der
getesteten Parametern geben, die zum Einsatz der hCMEC/D3-Zellen für Transport-
Assays modifiziert wurden. Ein asymmetrischer Transport der Substanzen Digoxin
und Verapamil konnte nicht festgestellt werden. Für Rhodamin 123 konnte aktiver
Pgp-vermittelter asymmetrischer Transport in hCMEC/D3-Zellen nachgewiesen
werden.
Diese Übersicht macht deutlich, dass die für die Untersuchung des Transports
von Antiepileptika notwendigen Bedingungen mit den hCMEC/D3-Zellen nicht
gefunden wurden. Einzelne Ergebnisse sind in den Abschnitten 5.1.4.1 bis 5.1.4.8
nachzulesen.
112

Inhibition des Transports
+ asymmetrischer Transport nachgewiesen - asymmetrischer Transport nicht nachweisbar
ERGEBNISSE
Tabelle 5.5: Übersicht der untersuchten Parameter für Transport-Assays mit der humanen Zelllinie hCMEC/D3. In den
Experimenten wurden mehr Parameter variiert als hier angeben sind. Die für die Optimierung der Transportversuche mit
den humanen Zellen relevanten Aspekte sind in der Tabelle angezeigt.
Pgp-Substrat
Membranfilter
Hersteller Material
Format Kokultur
Asymmetrischer
Transport
113
Digoxin
10 nM
Rhodamin 123
2 µM
Verapamil
10 nM
- unvollständig
AUC/h: 760 (- 3,2 %)
unvollständig
AUC/h: 400,3 (- 44,1 %)
- -
Polyester 6Well
Corning
+ - -
Polycarbonat 12Well
- - -
+ - -
Greiner Polyester
6Well - - -
12Well nicht untersucht
Polyester 6Well
- - -
+ - -
+
-
Corning
AUC/h: 785,3
Polycarbonat 12Well
+
+
AUC/h: 716,3
147,4
63,5 (- 56,9 %)
Greiner Polyester
6Well - + nicht untersucht
12Well nicht untersucht
Corning
Polyester
Polycarbonat
6Well/12Well nicht untersucht
6Well - - nicht untersucht
Polyester
Greiner
12Well nicht untersucht
Polycarbonat nicht untersucht

ERGEBNISSE
5.2 Primärkulturen des Hirnendothels der Ratte (rBCEC)
Die immortalisierte Zelllinie hCMEC/D3 wurde im Hinblick auf ihre Eignung als
BHS-Modell untersucht. Aufgrund möglicher Veränderungen dieser Zellen durch die
fehlende natürliche Umgebung zu anderen Zelltypen wie z.B. Astrozyten und
Perizyten, den Immortalisierungsprozess und der unzureichenden Dichtigkeit des
Monolayers, wurden zum Vergleich Zellen des Hirnkapillarendothels zweier
Rattenstämme (CD ® -IGS und Wistar) präpariert und Primärkulturen hergestellt. Die
CD ® -IGS-Ratten werden im Weiteren nur mit der Abkürzung CD bezeichnet. Diese
wurden vorrangig in Transport-Assays eingesetzt. Die Funktionalität des MDT Pgp
wurde aber auch in einzelnen Kumulationsversuchen untersucht.
Es wurden zwei Rattenstämme für die Präparation verwendet, um anhand
möglicher Unterschiede bei der Präparation, Kultivierung und der im Weiteren
beschriebenen Versuche den geeigneteren Stamm für Primärkulturen und die
Fragestellung finden zu können.
5.2.1 Pgp-Expression in rBCEC-Zellen: Western Blot
Die Pgp-Expression in den primären Rattenhirnendothelzellen aus Wistar-
Ratten wurde in zwei unterschiedlichen Passagen untersucht, Passage 1 und 3. Die
Pgp-Signale der Zellen wurden ebenfalls auf den Housekeeper ß-Aktin normiert.
Primärkulturen können nicht beliebig oft passagiert werden, da sie im Laufe
der Kultivierungsdauer ihre typischen Eigenschaften wie z.B. die Expression von
Transportern verlieren können. Deshalb wurden die rBCEC-Zellen nur mit den
Passagen 1 und 2 in Kumulations- und Transportversuchen eingesetzt. Der Western
Blot, der die Pgp-Expression in den Passagen 1 und 3 untersuchte, zeigte, dass die
Expression von Pgp in der höheren Passage der primären Hirnendothelzellen um
etwa die Hälfte reduziert war.
114

Pgp-Epression
(%; normiert auf ß-Aktin)
ERGEBNISSE
A
B
Pgp-Expression in rBCEC-Zellen
60 *
50
40
30
20
10
0
Passage 1 Passage 3
Abbildung 5.22: Ergebnis eines Western Blots mit primären Rattenhirnendothelzellen des
Stamms Wistar. Die Expression wurde in zwei verschiedenen Passagen der Zellen untersucht
und entsprechend graphisch dargestellt. Pro Passage wurde je 1 Probe 3-mal aufgetragen und
die Pgp-Expression auf die des Housekeepers ß-Aktin normiert. In beiden Passagen der
rBCEC-Zellen wurde die Pgp-Expression nachgewiesen. Zellen der Passage 3 exprimierten
signifikant weniger Pgp.
Die quantifizierten Signale der Proteine Pgp und ß-Aktin (siehe A) wurden als Mittelwerte +
SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Student’s t-Test ermittelt und sind
mit Sternen gekennzeichnet (p < 0,05).
5.2.2 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Kumulations-Assays
Mit dem Kumulations-Assay wurde in rBCEC-Zellen die Funktionalität des
MDTs Pgp untersucht. Dies sollte auch für diese Zellen klären, ob Antiepileptika zu
einer Induktion der Pgp-Funktionalität führen. Für diese Experimente wurden Zellen
der Passagen 1 und 2 verwendet. Dazu wurden die Zellen mit den Pgp-Induktoren
Dexamethason und Puromycin sowie mit ausgewählten Antiepileptika behandelt. Die
Behandlung mit den Substanzen erfolgte hier ebenfalls ab dem 3. Tag nach
Erreichen der Konfluenz für 72 h. Das Medium mit der jeweiligen Substanz wurde
täglich erneuert. Tariquidar, welches als Pgp-Inhibitor diente, wurde erst mit
Versuchsbeginnn einer vorher unbehandelten Gruppe an Zellen hinzugefügt und
lediglich über 3 h auf diesen belassen. Für die Kumulationsversuche wurde als
Substrat Rhodamin 123 in der Konzentration von 2 µM eingesetzt.
115

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
200000
150000
rBCEC P:1 (Wistar)
n=6
*
B
200000
150000
rBCEC P:1 (CD)
n=3
*
100000
100000
50000
0
Kontrolle
TQD 0,5 µM
50000
0
Kontrolle
Dex 10 µM
*
Puro 1 µM
TQD 0,5 µM
Abb. 5.23: Kumulations-Assays in primären Hirnendothelzellen der Ratte (Wistar und CD). Die
Aussaat der Zellen erfolgte auf Multiwell-Platten im 12Well-Format.
Der Multidrug-Transporter Pgp war in diesen Primärzellen funktionell. Der Vergleich beider
Stämme zeigte, dass Pgp in Zellen der Wistar-Ratten zu einem stärkeren Efflux des Substrats
Rhodamin 123 führte.
A: Der Pgp-Inhibitor Tariquidar führte zu einer Hemmung des Efflux von Rhodamin 123 aus den
Zellen.
B: Die Zellen wurden über einen Behandlungszeitraum von drei Tagen mit den Pgp-Induktoren
Dexamethason und Puromycin behandelt. Puromycin (1 µM) induzierte die Pgp-Funktionalität,
der Gehalt an Rhodamin 123 verringerte sich im Vergleich zu den nicht behandelten
Kontrollzellen. Dexamethason (10 µM) zeigte keinen Einfluss auf den Efflux durch Pgp.
Tariquidar inhibierte Pgp und führte zu einer signifikant höheren Substratkonzentration in den
Zellen.
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, Puro: Puromycin, TQD: Tariquidar.
Die Kumulationsversuche zeigten, dass in den Primärzellen der Ratte beider
Stämme funktionelles Pgp vorhanden war, welches durch Inhibitoren und Induktoren
beeinflusst werden konnte. In exemplarischen Experimenten wurden deshalb die
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin bezüglich ihrer Wirkung auf Pgp
untersucht. Die Konzentrationen von jeweils 100 µM wurden gewählt, weil diese in
hCMEC/D3-Zellen zur Induktion des Pgp-Efflux führten bzw. Tendenzen zu einer
induzierenden Wirkung nachgewiesen wurden (Abbildung 5.8 B, C & D und 5.9).
116

Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
Rhodamin 123
(Fluoreszenz/mg Protein)
ERGEBNISSE
A
rBCEC P:2 (Wistar)
n=3
100000
80000
60000
40000
20000
*
*
0
Kontrolle
Dex 10 µM
CBZ 100 µM
TQD 0,5 µM
B
150000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Kontrolle
rBCEC P:2 (Wistar)
n=3
200000
*
*
Puro 1 µM
*
PHT 100 µM
TQD 0,5 µM
C
200000
150000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Kontrolle
rBCEC P:2 (CD)
n=3
*
Puro 1 µM
*
PHT 100 µM
*
TQD 0,5 µM
Abb. 5.24: Kumulationsversuche mit den Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin in rBCEC
auf 6Well-Platten. Beide Antiepileptika wurden in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt
und hatten wie der Inhibitor Tariquidar eine signifikant inhibitorische Wirkung auf den Efflux
durch Pgp. Die Ausgangsfunktionalität (Kontrolle) von Pgp der Zellen aus CD-Ratten war im
vergleichenden Experiment höher als die der Zellen des Wistar-Stamms.
A: Kumulations-Assay in Zellen des Rattenstamms Wistar. Der Pgp-Induktor Dexamethason
zeigte im Vergleich zur Kontrolle keine Veränderung des Rhodamin-Efflux. Carbamazepin und
Tariquidar führten zu einer signifikanten Inhibition des Efflux.
B & C: Für den Vergleich des Efflux in Hirnendothelzellen der Rattenstämme Wistar und CD
wurden die Zellen mit dem Pgp-Induktor Puromycin (1 µM) und dem Antiepileptikum Phenytoin
behandelt. Puromycin führte zu einer signifikanten Induktion des Efflux. Phenytoin inhibierte
die Pgp-Funktionalität, der Gehalt an Rhodamin 123 in den Zellen war im Vergleich zur
Kontrolle erhöht. Tariquidar zeigte den gleichen Effekt, aber in einem stärkeren Ausmaß als
Phenytoin.
117

ERGEBNISSE
Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem
Student’s t-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.
Abkürzungen: Dex: Dexamethason, CBZ: Carbamazepin, PHT: Phenytoin, Puro: Puromycin,
TQD: Tariquidar.
Die Experimente unter Abbildung 5.24 dienten der Klärung der Fragestellung,
ob Antiepileptika ebenfalls zu einer Induktion der Pgp-Funktionalität in primären
Endothelzellen führen. Die Funktionalität von Pgp in diesen Zellen konnte mit diesen
Versuchen erneut bestätigt werden. Der bekannte Induktor Puromycin und der Pgp-
Inhibitor Tariquidar beeinflussten den Grundtransport des Transporters. Die
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin führten jeweils in der Konzentration von
100 µM zu einem erhöhten Rhodamin-Gehalt in den Zellen, sie inhibierten den Efflux
von Rhodamin 123 in den primären Zellen.
Erste Kumulationsversuche mit diesen Primärkulturen zeigten einen höheren
Basis-Efflux des Pgp-Substrats Rhodamin 123 in Zellen aus Wistar-Ratten
(Abbildung 5.23). Dieser Effekt kehrte sich in folgenden Versuchen um, sodass
Endothelzellen der CD-Ratten einen höheren Grundtransport des MDTs Pgp
aufwiesen. Diese Effekte waren inkonsistent.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass der Vergleich der Primärkulturen aus
CD- und Wistar-Ratten zu keinem eindeutigen Ergebnis geführt hat. Es bleibt
festzuhalten, dass die Zellen der CD-Ratten sich besser an die Oberflächen der
Zellkulturmaterialien anhefteten und ein schnelleres Wachstum zeigten. In den Zellen
beider Stämme konnte funktionelles Pgp nachgewiesen werden, welches durch Pgp-
Induktoren und –Inhibitoren beeinflusst werden konnte. Das Ausmaß des Rhodamin-
Grundtransports durch Pgp unterschied sich aber in beiden Stämmen und schwankte
stark. Weshalb Zellen aus Hirnendothel der Wistar-Ratten zunächst einen höheren
Efflux des Rhodamins aufwiesen und in weiteren Experimenten dann die Zellen aus
CD-Ratten, ließ sich mit der noch geringen Anzahl an Versuchen nicht klären.
Im Gegensatz zu der immortalisierten Zelllinie hCMEC/D3 inhibierten die
Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin in der Konzentration von 100 µM, die
außerhalb des therapeutischen Bereichs beim Menschen liegt (siehe Tabelle 5.1, S.
74) den Efflux durch Pgp in primären Hirnkapillarendothelzellen beider verwendeter
Rattenstämme. Diese Effekte in den rBCEC bedürfen weiterer Experimente und
118

ERGEBNISSE
zusätzlicher Konzentrationen, um die Wirkung von Antiepileptika in den
Primärkulturen abzuklären.
5.2.3 Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen: Transport-Assays
Das Hauptaugenmerk für die primären Hirnendothelzellen der Ratte lag auf
den Transportversuchen. Es sollte geklärt werden, wie sich Primärkulturen im
Transwell-Modell verhalten und ob diese möglicherweise besser als In-vitro-BHS-
Modell geeignet sind als die immortalisierten humanen hCMEC/D3-Zellen. Des
Weiteren sollte im Hinblick auf mögliche Unterschiede zwischen den Spezies
Mensch und Ratte untersucht werden, ob und welche Antiepileptika Substrate des
MDTs Pgp in diesen Zellen sind. Zu diesem Zweck wurden die Zellen auf
Membraneinlagen kultiviert. In der Regel wurden dazu Membran-Inserts im 12Well-
Format verwendet, weil auf diese Weise mit den Zellen einer Präparation zum einen
eine höhere Anzahl an Wells in den Versuchen erzielt wurde. Zum anderen konnten
mehr Faktoren wie Substrate, Inhibitoren, Dichtigkeit der Zellmonolayer usw.
untersucht werden. In einzelnen Transport-Assays wurden auch 6Well-
Membraneinlagen verwendet, um beide Formate miteinander vergleichen zu können.
Hinweise zur Wachstumsfläche, Porendichte und –größe können der Tabelle 4.2 (S.
54) entnommen werden.
Die Primärkulturen der Hirnendothelzellen der Ratte wurden nur für
Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode eingesetzt. Wie
auch für die hCMEC/D3-Zellen wurden verschiedene Parameter wie Substrat,
Format und Hersteller der Membraneinlagen sowie die Kokultur mit Astrozyten
untersucht.
In der Tabelle 5.7 wurden alle untersuchten Parameter zusammengefasst.
5.2.3.1 Auswahl des Substrats
Bei den Transportversuchen mit den hCMEC/D3-Zellen schien der
Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 als Pgp-Substrat besser geeignet zu sein.
Infolgedessen wurden in ersten Experimenten Rhodamin 123 eingesetzt. Dabei
wurde die gleiche Konzentration (2 µM) wie bei den humanen immortalisierten Zellen
verwendet. Um zu klären, ob weitere Pgp-Substrate wie Digoxin und Verapamil
durch Pgp in rBCEC transportiert werden, wurden diese ebenfalls untersucht.
119

ERGEBNISSE
Obwohl die TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten für alle unter Abbildung
5.25 dargestellten Versuche vergleichbar waren, konnte in rBCEC-Zellen der
Rattenstämme CD und Wistar nur ein Transport von Rhodamin 123 (2 µM) detektiert
werden. Dabei zeigten diese Zellen ähnlich hohe TEER-Werte wie die humanen
Zellen hCMEC/D3 auf Membraneinlagen im 12Well-Format. Zellen, die aus CD-
Ratten gewonnen wurden, zeigten einen gleichmäßigeren Konzentrationsverlauf als
die Zellen des anderen Stamms. Die Mannitol-Permeabilitäten waren alle mindestens
20-mal höher als die Grenze von 12 nm/s. Der Nachweis eines asymmetrischen
Transports von Digoxin und Verapamil war unter den genannten Konzentrationen
und Bedingungen nicht möglich.
120

% Verapamil
% Verapamil
% Digoxin
% Digoxin
% Rhodamin 123
% Rhodamin123
ERGEBNISSE
A
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (CD)
n=4
B
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (Wistar)
n=4
180
160
140
120
100
apikal
basolateral
TEER: 162,5 *cm 2
* * *
180
160
140
120
100
*
TEER: 140,1 *cm 2
* * *
0 60 120 180 240
min
0 60 120 180 240
min
C
Digoxin (10 nM)
rBCEC P:1 (CD)
n=4
D
Digoxin (10 nM)
rBCEC P:1 (Wistar)
n=4
400
400
350
350
300
300
250
250
200
TEER: 134,2 *cm 2
150
0 60 120 180 240
min
200
TEER: 142,2 *cm 2
150
0 60 120 180 240
min
E
Verapamil (10 nM)
rBCEC P:1 (CD)
n=6
F
Verapamil (10 nM)
rBCEC P:1 (Wistar)
n=6
400
400
350
300
TEER: 149,5 *cm 2
350
300
TEER: 127,3 *cm 2
250
250
200
200
150
0 60 120 180 240 300 360
min
150
0 60 120 180 240 300 360
min
Abbildung 5.25: Vergleichende Transport-Assays nach der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA) mit den Substraten Rhodamin 123 (A & B),
Digoxin (C & D) und Verapamil (E & F) in monokultivierten Primärkulturen des
Hirnkapillarendothels aus CD- und Wistar-Ratten auf Membraneinlagen im 12Well-Format
(Corning). Für Rhodamin 123 konnte ein asymmetrischer Transport in den rBCEC
nachgewiesen werden.
121

ERGEBNISSE
Die Mannitol-Permeabilitäten waren für alle getesteten Substrate vergleichbar. Die Zellen aus
CD-Ratten zeigten sehr hohe Werte zwischen 275 und 332 nm/s (A, C & E), für Primärzellen aus
Wistar-Ratten lagen diese bei 248–311 nm/s (B, D & F). Der TEER-Werte waren bei allen
Experimenten ähnlich hoch. Die Wistar-Zellen zeigten tendenziell etwas niedrigere
Widerstände.
Die Zellen wurden auf Membraneinlagen aus Polycarbonat des Herstellers Corning kultiviert
und 4-11 Tage nach Erreichen der Konfluenz für die Versuche verwendet. Die Werte sind als
Mittelwerte ± SEM angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden mit der Two-way ANOVA und
dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.
5.2.3.2 Einfluss des Membranformats und –formats
Das Membranformat
Die rBCEC-Zellen wurden für die Transport-Assays fast ausschließlich auf
1,12 cm 2 großen Membranen (12Well-Format) kultiviert, um die primären Zellen für
möglichst viele Experimente nutzen zu können. Sofern genug Zellmaterial zur
Verfügung stand, erfolgte die Aussaat der Zellen für einzelne Versuche aber auch
auf größeren Membran-Inserts, um sich ein Bild davon zu machen, wie die Zellen
sich auf diesen Membranen verhalten.
Die primären Rattenzellen zeigten auf den größeren Membraneinlagen im
6Well-Format etwa 2-fach niedrigere TEER-Werte als auf den kleineren Membran-
Inserts aber 4-mal so hohe Werte wie die humanen Zellen. Bezüglich dieses
Parameters fiel auf, dass die Zellen aus CD-Ratten oftmals höhere TEER-Werte
aufwiesen. Ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 oder Digoxin konnte
unter den gewählten Bedingungen (Membraneinlagen im 6Well-Format) nicht
nachgewiesen werden.
122

% Digoxin
% Digoxin
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
180
160
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (CD)
n=1
apikal
basolateral
B
180
160
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (Wistar)
n=1
140
120
TEER: 81,7 *cm 2
140
120
TEER: 79,4 *cm 2
100
100
80
80
60
0 60 120 180 240
min
60
0 60 120 180 240
min
C
Digoxin (10 nM)
rBCEC P:1 (CD)
n=1
D
Digoxin (10 nM)
rBCEC P:1 (Wistar)
n=1
180
180
160
140
120
TEER: 88,7 *cm 2
160
140
120
TEER: 140,1 *cm 2
100
100
80
80
60
60
0 60 120 180 240
min
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.26: Transportversuche nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)
mit den Substraten Rhodamin 123 (A & B) und Digoxin (C & D) in primären
Hirnkapillarendothelien aus CD- und Wistar-Ratten auf Membraneinlagen im 6Well-Format. Für
keines der Substrate war ein asymmetrischer Transport nachweisbar. Mit der unter D gezeigten
Ausnahme waren die TEER-Werte ähnlich hoch. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen zwischen
85 und 97 nm/s.
Der Konzentrationsverlauf wurde über 4 h beobachtet. Die Kultivierung der Zellen erfolgte auf
Polycarbonat-Membraneinlagen (Corning). Die Versuche wurden 4 bzw. 6 Tage nach Erreichen
der Konfluenz durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.
Das Membranmaterial
Das Material, aus dem die Membranen für die Transwell-Inserts hergestellt
werden, kann auf die Detektion eines Transports Einfluss nehmen. Für die
Transportversuche mit den Primärkulturen des Hirnkapillarendothels wurden
Polyester-Membraneinlagen der Firmen Corning und Greiner Bio-One verwendet.
Diese bestehen zwar aus dem gleichen Material, zeigen aber eine unterschiedliche
123

% Rhodamin 123
% Digoxin
ERGEBNISSE
Porendichte. Dazu wurden einzelne Experimente, die mit dem Substrat Rhodamin
123 durchgeführt wurden, miteinander verglichen.
A
180
160
140
120
100
*
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (CD)
n=4
apikal
basolateral
*
TEER: 213,5 *cm 2
* *
0 60 120 180 240
min
B
180
160
140
120
100
60
40
20
Digoxin (10 nM)
rBCEC P:1 (CD)
n=4
TEER: 217,9 *cm 2
0
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.27: Transportversuche in rBCEC aus CD-Ratten der Passage 1 mit Rhodamin 123
(A) und Digoxin (B) 12Well-Membraneinlagen des Herstellers Greiner. Rhodamin 123 wurde von
Zellen asymmetrisch von basolateral nach apikal transportiert. Ein Transport von Digoxin
konnte nicht nachgewiesen werden. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen bei 131 bzw. 177 nm/s.
Die TEER-Werte bewegten sich in einem Bereich von 213,5–217,9 Ω*cm 2 .
Proben wurden über den Zeitraum von 4 h entnommen. Die Zellen wurden auf Greiner-
Membraneinlagen (Polyester) kultiviert. Die Transport-Assays wurden am 6. Tag nach
Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.
Unterschiede wurden mit der Two-way ANOVA und dem Bonferroni-Posthoc-Test ermittelt und
Signifikanzen sind mit Sternen (p < 0,05) angegeben.
Unabhängig vom Membranmaterial bzw. dessen Herstellungsprozess erfolgte
der Nachweis eines asymmetrischen Transports von Rhodamin 123. Ein Transport
von Digoxin konnte nicht detektiert werden. Es fiel auf, dass im Gegensatz zu den
Versuchen mit hCMEC/D3-Zellen die Membraneinlagen der Firma Greiner mit der
gleichen Porengröße höhere TEER-Werte gemessen wurden als für die Transwell-
Inserts von Corning. Die Mannitol-Permeabilität schien ebenfalls beeinflusst, es
wurden niedrigere Werte als für die humanen hCMEC/D3-Zellen gemessen.
5.2.3.3 Die Kokultivierung der rBCEC-Zellen mit Astrozyten
Die Primärkulturen des Rattenhirnendothels zeigten von Beginn an höhere
TEER-Werte als die hCMEC/D3-Zellen. Allerdings zeigte sich auch bei diesen Zellen
eine im Vergleich mit z.B. den immortalisierten Nierenepithelzellen LLC und MDCK II
124

ERGEBNISSE
(LLC: 4,3 ± 0,5 nm/s, MDCK II. 3,3 ± 0,49 nm/s; LÖSCHER et al. 2011) und primären
porcinen Hirnkapillarendothelzellen (17-18 nm/s; FRANKE et al. 1999 & 2000) sehr
hohe Mannitol-Permeabilität, die aber im Unterschied zu den immortalisierten
humanen Zellen immer noch um etwa die Hälfte reduziert war.
Um zu überprüfen, ob die Kokultur mit Astrozyten Einfluss auf die Parameter
TEER und Mannitol-Permeabilität für die Primärkulturen des Hirnkapillarendothels
der Ratte hat, wurden die primären Hirnendothelzellen beider Stämme mit Astrozyten
kokultiviert. Für Kokultur-Versuche erfolgte die Aussaat der Astrozyten auf der
Unterseite der Membran. Die Endothelzellen wurden auf der apikalen Seite der
Membraneinlagen kultiviert.
Die Kokultivierung der Rattenhirnendothelien mit Astrozyten, die ebenfalls aus
der Ratte stammten, führte zum Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-
Transports. Dabei blieb der transendotheliale Widerstand unbeeinflusst. Eine
Steigerung durch die Astrozyten war nicht erkennbar. Auffällig war, dass die
Messungen erneut höhere Werte für die Membran-Inserts von Greiner ergaben. Die
Mannitol-Permeabilitäten der Zellen schwankten für beide Stämme. Der Mittelwert
lag bei 174,1 nm/s (siehe Tabelle 5.6, Gesamt 12Well Kokultur). Oft verhielt es sich
so, dass die Mannitol-Permeabilitäten mit den TEER-Werten korrelierten. Je
niedriger die Mannitol-Permeabilität, desto höhere TEER-Werte wurden gemessen
(5.28 B & D, siehe auch Tabelle 5.6).
125

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
Corning Inserts, Stamm CD
rBCEC P:1 + Astrozyten P:7
n=4
B
Greiner Inserts, Stamm CD
rBCEC P:1 + Astrozyten P:7
n=5
180
160
140
apical
basolateral
* * * *
180
160
140
* * *
*
120
120
100
TEER: 177,1 *cm 2
0 60 120 180 240
min
100
TEER: 229,0 *cm 2
0 60 120 180 240
min
C
160
Corning Inserts, Stamm Wistar
rBCEC P:1 + Astrozyten P:4
n=6
*
*
180
*
*
D
180
160
Greiner Inserts, Stamm Wistar
rBCEC P:2 + Astrozyten P:13
n=4
TEER: 219,8 *cm 2
140
120
100
TEER: 126,2 *cm 2
0 60 120 180 240
min
140
120
100
* * * *
*
0 60 120 180 240 300 360
min
Abbildung 5.28: Transportversuche in rBCEC aus CD- und Wistar-Ratten in Kokultur mit
Astrozyten. Als Substrat wurde Rhodamin 123 in der Konzentration von 2 µM eingesetzt.
Signifikante Konzentrationsunterschiede wurden in allen Versuchen festgestellt. Ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte nachgewiesen werden. Der
transendotheliale Widerstand lag zwischen 126,2 und 229,0 Ω*cm 2 . Die Permeabilität für
Mannitol zeigte Werte von 214,3 nm/s (A), 142,1 nm/s (B), 319 nm/s (C), 122,2 nm/s (D). Dabei
zeigten die Zellen mit niedrigeren Mannitol-Permeabilitäten die höheren TEER-Werte (B & D).
Die Zellen wurden auf Polyester-Membraneinlagen im 12Well-Format der Hersteller Corning
und Greiner kultiviert. Der Transport wurde über 4 h (A-C) bzw. 6 h (D) untersucht. Die
Transportversuche erfolgten am 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz. Daten sind als
Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede zwischen den Konzentrationen der
apikalen und basolateralen Kammer wurden mit der Two-way ANOVA und dem Bonferroni-
Posthoc-Test ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.
126

ERGEBNISSE
Die Experimente zur Kokultivierung untersuchten nicht nur Rhodamin 123,
sondern auch Digoxin. Allerdings konnte auch unter diesen Bedingungen kein
Digoxin-Transport nachgewiesen werden, weshalb die dazugehörigen Graphen nicht
dargestellt wurden. In einem einzelnen Versuch wurde der Transport des
Antiepileptikums Phenytoin untersucht. Es war kein signifikanter Transport zu
erkennen (Daten nicht gezeigt).
5.2.3.4 Geeignete Pgp-Inhibitoren zur Überprüfung des Transports
In den rBCEC-Zellen wurde ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123
sowohl in Monokultur als auch in Kokultur mit Astrozyten nachgewiesen. Um zu
klären, ob dieser Transport spezifisch durch Pgp erfolgte, wurden die Zellen
zusätzlich zum Substrat Rhodamin 123 mit den spezifischen Pgp-Inhibitoren
Tariquidar und Valspodar (PSC833) inkubiert. Wenn es sich um einen Pgpspezifischen
Transport handelt, führen diese Substanzen zu einer Inhibition des
Transports und Konzentrationsunterschiede zwischen der apikalen und basolateralen
Kammer werden aufgehoben.
127

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
A
Rhodamin 123 (2 µM)
rBCEC P:1 (CD)
n=4
B
+ TQD (0,5 µM)
rBCEC P:1 (CD)
n=1
Veränderung
der AUC/
180 apical basolateral
180
160
AUC/h: 406,5
TEER: 213,5 *cm 2
160
AUC/h: 543
TEER: 234,8 *cm 2
140
120
* * * *
140
120
+ 33,6 %
100
100
0 60 120 180 240
min
0 60 120 180 240
min
C
160
140
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur
rBCEC P:1 (Wistar) + Astrozyten P:4
n=6
*
*
180
*
*
D
180
160
140
+ TQD (0,5 µM), Kokultur
rBCEC P:1 (Wistar) + Astrozyten P:4
n=5
*
*
*
- 52,2 %
120
120
100
AUC/h: 192,3 TEER: 126,2 *cm 2
0 60 120 180 240
min
100
AUC/h: 91,9 TEER: 133,4 *cm 2
0 60 120 180 240
min
E
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7
n=4
F
+ PSC833 (10 µM), Kokultur
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7
n=1
180
180
160
140
* * * *
160
140
+ 30,6 %
120
120
100
AUC/h: 328 TEER: 177,1 *cm 2
0 60 120 180 240
min
100
AUC/h: 428,3 TEER: 188,5 *cm 2
0 60 120 180 240
min
128

% Rhodamin 123
% Rhodamin 123
ERGEBNISSE
G
Rhodamin 123 (2 µM), Kokultur
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7
n=5
H
+ PSC833 (10 µM)
rBCEC P:1 (CD) + Astrozyten P:7
n=1
Veränderung
der AUC/h
180
160
140
* * *
*
180
160
140
- 6,3 %
120
120
100
AUC/h: 463 TEER: 229,0 *cm 2
0 60 120 180 240
min
100
AUC/h: 434 TEER: 197,9 *cm 2
0 60 120 180 240
min
Abbildung 5.29: Transport-Assays (CETA) mit 2 µM Rhodamin 123 in rBCEC-Zellen der
Rattenstämme CD und Wistar in Monokultur (A & B) und Kokultur mit Astrozyten der Ratte (C–
H). Der Transport wurde über einen Zeitraum von 4 h beobachtet. Die Zellen wurden auf 12Well-
Membraneinlagen der Firmen Greiner (A, B, G & H) und Corning (C-F) kultiviert. Die
Experimente wurden 4-7 Tage nach Erreichen der Konfluenz durchgeführt. Die Graphen A, C, E
und G zeigen Versuche, in denen nur Konzentrationsveränderungen des Substrats Rhodamin
123 gemessen wurden. Unter B, D, F und H sind Transport-Assays dargestellt, die die Inhibition
des Transports durch Tariquidar (TQD) und Valspodar (PSC833) untersuchten.
In allen Versuchen erfolgte der Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-Transports. Die
Inkubation mit den Inhibitoren Tariquidar und Valspodar zeigte keine oder nur wenige
Veränderungen im Konzentrationsverlauf des Substrats. Der Rhodamin-Transport konnte nicht
inhibiert werden. Die Messung der Mannitol-Permeabilität ergab Werte für A und B mit 153,7
nm/s, C und D: 319 m/s, E und F: 214,3 nm/s und für G und H: 142,1 nm/s.
Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit einer
Two-way ANOVA (Posthoc Bonferroni) ermittelt und sind mit Sternen (p < 0,05) angezeigt.
Die hier dargestellten Graphen zu Transportexperimenten (Abbildung 5.29) mit
Primärkulturen des Rattenhirnendothels zeigen, dass der Rhodamin-Transport
mittels der spezifischen Pgp-Inhibitoren Tariquidar und Valspodar nicht gehemmt
werden konnte (Graph B, F & H). Die Inhibition durch Tariquidar in Graph D schien
erst nach etwa 120 min einzutreten. Für den letzten Probenzeitpunkt waren keine
signifikanten Konzentrationsunterschiede mehr feststellbar und die AUC sank um
52,2 %. Allerdings konnte dies nicht reproduziert werden. Bei den Graphen B und H
könnten ähnliche Effekte wie für D vermutet werden, da auch hier die
Konzentrationsunterschiede zum letzten Zeitpunkt abnahmen. Konkrete Angaben
können aber dazu nicht gemacht werden, da für die unter B, F und H dargestellten
129

ERGEBNISSE
Versuche mit einer Gruppengröße von n=1 gearbeitet wurde. Es bleibt festzuhalten,
dass keiner der eingesetzten Inhibitoren in den gewählten Konzentrationen in der
Lage war, den Pgp-vermittelten Transport von Rhodamin 123 vollständig in allen
Versuchen zu hemmen. In zwei von vier Versuchen erhöhten sich die AUC nach
Zugabe eines Pgp-Inhibitors (Abbildung 5.29 B & F). Lediglich in Graph 5.29 D
verringerte sich die AUC um > 50 % nach Zugabe des Inhibitors Tariquidar. Ein
Unterschied zwischen Mono- und Kokultur bzw. Corning- und Greiner-
Membraneinlagen war nicht zu erkennen.
5.2.3.5 Integrität primärer Zellen anhand des TEERs und der Mannitol-
Permeabilität
In Tabelle 5.7 wurden alle gemessenen TEER-Werte und Mannitol-
Permeabilitäten der Transportuntersuchungen mit rBCEC-Zellen beider verwendeter
Rattenstämme (CD und Wistar) zusammengefasst. Es wurde deutlich, dass es auch
für die Primärzellen einen Unterschied machte, ob diese auf kleinen 12Well-
Membranen oder größeren 6Well-Membranen kultiviert wurden. Mit der Kultur der
rBCEC-Zellen auf 12Well-Membranen wurden höhere TEER-Werte gemessen.
Gleichzeitig erhöhte sich aber auch die Permeabilität für Mannitol um das etwa das
Dreifache. Unterschiede wurden des Weiteren zwischen den Membranherstellern
Corning und Greiner (Vergleich 12Well-Format) und den Rattenstämmen CD und
Wistar deutlich. Wurden die primären Zellen auf Greiner-Membranen kultiviert
erhöhte sich der TEER und die Mannitol-Permeabilität sank. Im Vergleich der Zellen
aus CD- und Wistar-Ratten fiel auf, dass für die Monolayer der CD-Ratten höhere
TEER-Werte und niedrigere Mannitol-Permeabilitäten gemessen wurden.
130

ERGEBNISSE
Tabelle 5.6: Übersicht der TEER-Werte und Mannitol-Permeabilitäten in Bezug auf die
untersuchten Parameter in Transportversuchen (CETA) mit rBCEC-Zellen. Zur
besseren Vergleichbarkeit sind hier auch Daten aus der Literatur aufgeführt.
Daten der Literatur
Zelllinie/
Zellen
Serum
Kokultur
TEER
(Ω*cm 2 )
Parazelluläre
Permeabilität
(nm/s)
Referenz
hCMEC/D3
Human
Nein
15-30
k. A.
URICH et al. 2012
LCC-Wt
Bovin
Nein
800
Mannitol: 4-6
LÖSCHER et al. 2011
Primärkultur
Bovin
Ja
169-500
Fluorescein: 1,87
PERRIÈRE et al. 2005
(Ratte)
Primärkultur
Bovin
Auch
bis 600
k. A.
HUTAMEKALIN et al. 2008
(Ratte)
Primärkultur
Bovin
Nein
400-700
Mannitol: 18
FRANKE et al. 2000
(Schwein)
Primärkultur
Bovin
Nein
bis 1800
Sucrose: 0,2
NITZ et al. 2003
(Schwein)
Primärkultur
Bovin
Auch
130
Fluorescein: 1,6-17,6
GAILLARD & DE BOER 2000
(Rind)
Primärkultur
Equin
Nein
60-80
k. A.
LEE 2004
(Rind)
131

ERGEBNISSE
Daten der These
Stamm
Membranmaterial/
-format
Kokultur
TEER
(Ω*cm 2 )
Mannitol
(nm/s)
Mannitol
(%/h)
Asymm.
Transport
Corning,
Nein
88,7
n.d.
n.d.
-
Polyester,
Nein
81,7
85,3
8,7
-
6Well
85,2 ± 3,5 85,3 ± 0 8,7 ± 0
Nein
134,2
331,6
24,5
-
Nein*
147,1
331,6
24,5
-
Nein
173,4
214,3
12,9
-
Nein*
162,8
214,3
12,9
-
Nein
162,5
288,4
21,1
+
Corning,
Polyester,
12Well
Nein
Nein*
Nein
Nein*
136,5
149,0
149,5
141,9
287,2
287,2
274,8
274,8
22,3
22,3
21,0
21,0
+
n.a. (n=1)
-
-
150,8 ± 12,3 278,2 ± 39,7 20,3 ± 4,1
Ja
177,1
214,3
12,9
+
CD
Ja*
188,5
214,3
12,9
n.a. (n=1)
Greiner,
Polyester,
12Well
182,8 ± 5,7 214,3 ± 0 12,9 ± 0
Gesamt 138,8 ± 27,7 259,0 ± 69,0 19,1 ± 5,2
Nein 217,9
153,7
11,2
Nein* 219,5
153,7
11,2
Nein 219,7
142,1
7,2
Nein* 225,5
142,1
7,2
Nein 213,5
146,7
7,5
Nein* 234,8
146,7
7,5
221,8 ± 6,8 147,5 ± 4,8 8,6 ± 1,8
Ja
229,0
142,1
7,2
Ja*
197,9
142,1
7,2
Ja
212,5
146,7
7,5
213,1 ± 12,7 143,6± 2,2 7,3 ± 0,1
Gesamt 218,9 ± 10,1 146,2 ± 4,5 8,2 ± 1,6
-
-
-
-
+
n.a. (n=1)
+
n.a. (n=1)
+
CD Gesamt 12Well Nein 179,2 ± 36,3 225,9 ± 71,1 15,6 ± 6,6
CD Gesamt 12Well Ja 201,0 ± 18,2 171,9 ± 34,7 9,5 ± 2,7
CD Gesamt 12Well 184,6 ± 34,1 212,4 ± 68,1 14,1 ± 6,5
132

ERGEBNISSE
Stamm
Membranmaterial/
Kokultur
TEER Mannitol Mannitol Asymm.
(Ω*cm 2 ) (nm/s) (%/h) Transport
-format
Corning,
Polyester,
Nein
Nein
140,1
79,4
n.d.
96,5
n.d.
10,5
-
-
6Well
109,8 ± 30,4 96,5 ± 0 10,5 ± 0
Nein
Nein*
Nein
Nein
Nein*
Nein
142,2
143,0
140,1
131,4
144,5
127,3
304,9
304,9
311,2
309,9
309,9
248,1
25,4
25,4
22,6
21,8
21,8
25,7
-
-
+
-
n.a. (n=1)
-
Wistar
Corning,
Nein 122,5
248,1
25,7
-
Polyester,
135,9 ± 8,1 291,0 ± 27,2 24,1 ± 1,7
12Well
Ja*
Ja
Ja*
Ja
131,6
126,5
133,4
124,2
303,8
319,3
319,3
303,8
26,2
21,5
21,5
26,2
-
+
(+)
-
128,9 ± 3,7 311,6 ± 7,8 23,9 ± 2,4
Gesamt 133,3 ± 7,6 298,5 ± 24,3 24,0 ± 2,0
Greiner,
Polyester, Ja 219,8 122,2 7,3 +
12Well
Wistar Gesamt 12Well Nein 135,9 ± 8,1 291,0 ± 27,2 24,1 ± 1,7
Wistar Gesamt 12Well Ja 147,1 ± 36,5 273,7 ± 76,1 20,5 ± 6,9
Wistar Gesamt 12Well 140,5 ± 25,0 283,8 ± 54,0 22,6 ± 5,0
Gesamt 6Well Nein 97,5 ± 24,8 90,9 ± 5,6 9,6 ± 0,9
Gesamt 12Well Nein 165,4 ± 36,5 246,6 ± 67,8 18,3 ± 6,8
Gesamt 12Well Ja 174,1 ± 39,5 222,8 ± 78,0 15,0 ± 7,6
Gesamt 12Well 168,1 ± 37,6 239,2 ± 72,0 17,3 ± 7,2
n.d.
Messung nicht durchgeführt
n.a.
nicht ausgewertet (zu kleine Gruppengröße)
+ asymmetrischer Transport
- kein asymmetrischer Transport
(+) asymmetrischer Transport nicht über gesamte Versuchsdauer messbar
* Messung nach Zugabe eines Inhibitors (Tariquidar oder Valspodar)
133

ERGEBNISSE
5.2.2.6 Zusammenfassung des Transports in primären Hirnendothelien der
Ratte
Die Untersuchung des Transports in primären Rattenhirnendothelien zeigte,
dass in diesen Zellen auch ohne starke Modifizierungen des Transwell-Modells
Transport nachgewiesen werden konnte. Der Nachweis des Rhodamin-Transports
gelang sowohl in monokultivierten als auch in mit Astrozyten kokultivierten Zellen und
auf verschiedenen 12Well-Membraneinlagen (Corning und Greiner). Wie auch für die
hCMEC/D3-Zellen konnte ein Transport der spezifischen Pgp-Substrate Digoxin und
Verapamil für die Primärkultur nicht detektiert werden (Abbildung 5.25). Keines der
getesteten Substrate wurde von Zellen, die auf größeren 6Well-Membranen kultiviert
wurden, transportiert (Abbildung 5.26).
Die Parameter für die Integrität der Monolayer, der TEER und die Mannitol-
Permeabilität, wurden auch für diese Zellen untersucht. Die Widerstände zeigten für
die Primärkulturen in den meisten Versuchen höhere Werte als die immortalisierten
hCMEC/D3-Zellen (rBCEC: 6Well: 97,5 ± 24,8 Ω*cm 2 und 12Well: 168,1 ± 37,6
Ω*cm 2 ; hCMEC/D3: 6Well: 31,9 ± 12,8 Ω*cm 2 und 12Well: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 )
(siehe Tabellen 5.4 & 5.6). Für die Primärkulturen fiel zudem auf, dass die Zellen auf
Greiner-Membraneinlagen oft etwas höhere transendotheliale elektrische
Widerstände zeigten als auf Corning-Inserts. Dies schien aber keinen Einfluss auf
den Nachweis eines Transports haben. Die Mannitol-Permeabilitäten zeigten ähnlich
hohe Werte auf den 12Well-Membraneinlagen wie die humanen Zellen (rBCEC:
239,2 ± 72,0 nm/s; hCMEC/D3: 230,4 ± 109,2 nm/s). Permeabilitäten < 12 nm/s
wurden nicht gemessen.
Die Kokultur mit Astrozyten führte zu keiner offensichtlichen Verbesserung der
Parameter für die Dichtigkeit und dem Nachweis des Transports. So konnte der
TEER durch die Kokultur (Monokultur: 165,4 ± 36,5 Ω*cm 2 ; Kokultur: 174,1 ± 39,5
Ω*cm 2 ; siehe Tabelle 5.6) nicht wesentlich gesteigert werden, die Mannitol-
Permeabilität blieb ebenfalls nahezu unverändert (Monokultur: 246,6 ± 67,8 nm/s;
Kokultur: 222,8 ± 78,0 nm/s). Weiterhin wurde die Spezifität des Rhodamin-
Transports überprüft. Dieser konnte durch die Pgp-Inhibitoren Tariquidar und
Valspodar in den genannten Konzentrationen nicht vollständig gehemmt werden
(Abbildung 5.29).
134

ERGEBNISSE
Tabelle 5.7 fasst alle Resultate der Transportversuche zusammen und soll
einen Überblick geben, unter welchen Bedingungen in den primären
Rattenhirnkapillarendothelzellen Transport nachgewiesen werden konnte. Die
entsprechenden Ergebnisse sind in den Abschnitten 5.2.3.1 bis 5.2.3.4 nachzulesen
und in den Abbildungen 5.25-5.29 dargestellt. Darüber hinaus wird deutlich, dass
auch für die rBCEC-Zellen die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden,
und deshalb der Transport von Antiepileptika in diesen primären Zellen nicht
untersucht wurde.
135

Inhibition des
Transports
+ asymmetrischer Transport nachgewiesen - asymmetrischer Transport nicht nachweisbar
ERGEBNISSE
Tabelle 5.7: Übersicht der Transport-Assays mit primären Hirnkapillarendothelien der Ratte. Es konnte nur ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden. Die Versuche wurden mit beiden Rattenstämmen (CD,
Wistar) durchgeführt.
Substrat
Membranfilter
Hersteller Material
Format Kokultur
Asymmetrischer
Transport
136
Digoxin
10 nM
Rhodamin 123
2 µM
Verapamil
10 nM
Phenytoin
50 µM
6Well - - -
Corning Polyester
- - -
12Well
+ - -
Greiner Polyester
Corning Polyester
Greiner Polyester
6Well nicht untersucht
12Well + - -
6Well - - -
+
-
AUC/h: 192,6
12Well
+
+
AUC/h: 192,3
328
6Well nicht untersucht
+
-
AUC/h: 406,5
12Well
+
+
AUC/h: 463
+
AUC/h: 6,6 (- 96,6 %)
Unvollständig
AUC/h: 91,9 (- 52,2 %)
428,3 (+ 30,6 %)
-
AUC/h: 543 (+ 33,6 %)
Unvollständig
AUC/h: 434 (- 6,3 %)
Corning Polyester 12Well - - nicht untersucht
Greiner Polyester 6Well/12Well nicht untersucht
Corning Polyester 12Well - - nicht untersucht
Greiner Polyester 6Well/12Well nicht untersucht

DISKUSSION
6 DISKUSSION
Die MDT-Hypothese sucht die Erklärung für pharmakoresistente Epilepsien in
einer vermehrten Expression bzw. einer gesteigerten Funktionalität der MDTs an der
BHS. Substrate der MDTs werden auf diese Weise schneller wieder zurück ins Blut
transportiert. Die MDT der BHS, zu denen auch das gut untersuchte Pgp gehört,
zeigen ein großes Substratspektrum, das u.a. Arzneimittel wie Zytostatika, HIV-
Medikamente und auch Antiepileptika (LÖSCHER & POTSCHKA 2005a) beinhaltet.
Allerdings ist die Frage, ob und welche Antiepileptika Substrate der einzelnen MDT
darstellen und ob diese auch modulierende Effekte auf deren Funktionalität ausüben,
noch immer nicht geklärt und wird kontrovers diskutiert (OWEN et al. 2001; BALTES
et al. 2007a, b; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012). Einige In-vitro-Studien
mit nicht-endothelialen Zellen erbrachten aber den Nachweis, dass beispielsweise
die Antiepileptika Phenytoin und Topiramat Substrate des MDTs Pgp sind (LUNA-
TORTÓS et al. 2008 & 2009). Sofern dies auch auf Endothelzellen der Hirnkapillaren
zutrifft, würde das geringere Konzentrationen im Gehirn und die damit verbundene
unzureichende Unterdrückung epileptischer Anfälle erklären. Weiterhin besteht die
Annahme, dass Antiepileptika durch die Induktion von MDT selbst zu ihrem
Abtransport aus dem Zielgewebe, dem epileptischen Fokus, beitragen (LOMBARDO
et al. 2008; WEN et al. 2008). Die Medikamente führen zu einer erhöhten Expression
bzw. Funktionalität des Transporters Pgp. Dies bewirkt einen gesteigerten Efflux aus
dem Gewebe ins Blut. In Leber- und Darmzellen sowie in Lymphozyten wurde eine
Induktion von Pgp durch die Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und
Phenytoin bereits nachgewiesen (SCHUETZ et al. 1996; OWEN et al. 2006; MARTIN
et al. 2008). Erste Studien mit der Rattenhirnkapillarendothelzelllinie GPNT zeigten
keine Effekte von Antiepileptika auf die Funktionalität von Pgp (AMBROZIAK et al.
2010). In Experimenten mit der gleichen und einer weiteren
Rattenhirnendothelzelllinie (RBE4) konnte gezeigt werden, dass nach Anpassungen
des Kultivierungs- und Versuchsprotokolls Carbamazepin und Phenytoin eine
induzierende Wirkung auf den Efflux durch Pgp hatten (NEUMANN 2010,
Diplomarbeit).
In der vorliegenden Arbeit wurde die immortalisierte humane
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 verwendet, um herauszufinden ob diese
Effekte speziesabhängig waren oder auch weitere Antiepileptika zu einer Induktion
137

DISKUSSION
der Pgp-Funktionalität beitragen. Diese Zellen stammen aus dem epileptischen
Fokus einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin. Mit Hilfe dieser Zellen sollte
untersucht werden, ob Antiepileptika einen Einfluss auf humanes Pgp haben.
Des Weiteren sollten hCMEC/D3-Zellen in Transportversuchen eingesetzt
werden, um deren Eignung im Transwell-Modell und den möglichen Transport von
Antiepileptika durch Pgp festzustellen. Die Kulturbedingungen waren für diese Zellen
bekannt (WEKSLER et al. 2005).
Immortalisierte Endothelzellen werden aufgrund ihrer unzureichenden
Integrität der Monolayer für Transportversuche als ungeeignet betrachtet (DELI et al.
2005; ROUX & COURAUD 2005). Die hCMEC/D3-Zellen stellen ein In-vitro-Modell
der BHS dar, deren Eignung aber noch nicht hinreichend geklärt ist. Zum Vergleich
wurden Primärkulturen aus dem Endothel des Rattenhirns gewonnen, die ebenfalls
in funktionellen Experimenten (Kumulations- und Transportversuche) eingesetzt
wurden und Aufschluss über deren Eignung als BHS-Modell geben sollten.
138

DISKUSSION
6.1 Die humane immortalisierte Hirnkapillarendothelzelllinie
hCMEC/D3
6.1.1 Pgp-Expression in hCMEC/D3-Zellen
Mit Hilfe des Western Blots konnte in dieser Arbeit ebenfalls nachgewiesen
werden, dass die hCMEC/D3-Zellen Pgp exprimieren. GPNT-Zellen zeigen im
Gegensatz zu RBE4-Zellen eine höhere Pgp-Expression (ROUX & COURAUD
2005). Dies konnte mit dem vergleichenden Western Blot bestätigt werden. Die
humanen Zellen zeigten eine moderate Pgp-Expression, die etwas höher war als die
der RBE4-Zellen, aber signifikant niedriger als in den GPNT-Zellen (Abbildung 5.2).
Diese großen Unterschiede der Pgp-Expression waren auch in der
Funktionalität von Pgp wiederzufinden. Der stärkste Rhodamin-Efflux wurde in
GPNT-Zellen gemessen, der niedrigste in RBE4. Die humanen Zellen lagen wie mit
ihrer Pgp-Expression dazwischen (Abbildung 5.4). Demnach ist die Funktionalität der
GPNT-Zellen durch Induktoren wie Dexamethason nicht weiter zu steigern, was in
dem unter Abbildung 5.4 C dargestellten Versuch bestätigt wurde. In den humanen
und die RBE4-Zellen führte Dexamethason zu einer Induktion des Rhodamin-Efflux,
was auf die niedrigere Pgp-Expression zurückgeführt werden kann. Aufgrund der
Pgp-Expression und der Induktion des Efflux durch Dexamethason erschienen die
hCMEC/D3-Zellen für Untersuchungen der modulatorischen Wirkungen durch
Antiepileptika geeignet.
6.1.2 Die Modulation der Pgp-Funktionalität
Der Kumulations-Assay erlaubt die Untersuchung der Funktionalität von
Transportern. In dieser Arbeit war der MDT Pgp von großer Bedeutung. Die Basis
der vorliegenden Arbeit bildeten die Untersuchungen von AMBROZIAK et al. (2010),
die die Induktion durch Antiepileptika in MDCK II-Zellen (Epithel der Hundeniere) und
in der Rattenhirnendothelzelllinie GPNT untersuchten. Sie verwendeten das von der
FDA empfohlene Pgp-Substrat Digoxin und fanden keine induzierenden Effekte nach
der Behandlung mit den Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und Phenytoin.
Nach Anpassung des Versuchsprotokolls an ein anderes Substrat (Rhodamin 123
statt Digoxin) und der Kultivierung der GPNT-Zellen (Puromycin wurde nur während
der zwei Passagen dem Medium zugefügt) sowie der Verwendung einer weiteren
139

DISKUSSION
Hirnkapillarendothelzelllinie (RBE4), war es möglich zu zeigen, dass die
Antiepileptika Carbamazepin, Phenytoin und Topiramat die Funktionalität Pgps
induzieren und das Substrat im Vergleich zu unbehandelten Zellen vermehrt aus den
Zellen heraustransportiert wurde (NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Für
weiterführende Untersuchungen zu diesem Thema wurde die humane
Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 herangezogen. Darüber hinaus wurden
vergleichende Untersuchungen mit den Rattenhirnendothelien GPNT und RBE4
durchgeführt. Die Auswahl der Substanzen und ihrer Konzentrationen wurde
erweitert.
6.1.2.1 Optimierung der Versuchsbedingungen
Die Zellen wurden dazu zunächst unter Berücksichtigung verschiedener
Parameter wie z.B. Kultivierungsbedingungen und Auswahl des Substrats
untersucht. Bereits frühere Versuche mit den Rattenhirnendothelien GPNT und
RBE4 zeigten sehr variable Ergebnisse der Kumulationsversuche, die mit dem von
der FDA empfohlenen Pgp-Substrat Digoxin durchgeführt wurden (NEUMANN 2010,
Diplomarbeit). Dieses Substrat, das für Transportversuche in Nierenzellen empfohlen
wird, schien für funktionelle Untersuchungen in diesen Zelllinien nicht geeignet. Der
unter Abbildung 5.3 dargestellte Versuch mit den hCMEC/D3-Zellen zeigte, dass der
Inhibitor Tariquidar nicht zu einer Hemmung des Efflux von Digoxin führte. Dies ließ
darauf schließen, dass Digoxin für Experimente, die die Funktionalität in den
humanen Zellen untersuchen, wie auch in den RBE4- und GPNT-Zellen ungeeignet
war. Digoxin ist ein spezifisches Pgp-Substrat (BECKER & DREWE 2006; siehe
Tabelle 2.1), dennoch könnte eine zu geringe Permeationsgeschwindigkeit dieser
Substanz durch die Membranen ursächlich dafür sein, dass eine Inhibition des Efflux
in der Kürze der Versuchsdauer nicht festzustellen ist. ACHARYA et al. (2008) gehen
nach Transportstudien mit MDCK II-Zellen (aus der Niere des Hundes) davon aus,
dass Digoxin nicht allein von Pgp sondern zusätzlich von einem weiteren Transporter
transportiert wird, der basolateral lokalisiert ist. Dieser noch nicht näher beschriebene
Transporter ist nicht in allen Zellen zu finden, sodass man folglich den nicht
messbaren Transport bzw. Efflux von Digoxin mit dem Fehlen des basolateralen
Transporters erklären könnte. Um Modulationen der Funktion des MDTs Pgp durch
Substanzen in hCMEC/D3-Zellen untersuchen zu können, wurde ein anderes
bekanntes Pgp-Substrat verwendet, Rhodamin 123 (EFFERTH et al. 1989; LEE et al.
140

DISKUSSION
1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009). Einige Studien vermuten, dass ein
Efflux von Rhodamin 123 auch in BCRP-exprimierenden Zellen stattfindet, aber
Untersuchungen im hiesigen Labor an BCRP-transfizierten MDCK II-Zellen (K.
Römermann, unveröffentlichte Daten) und ROBEY et al. (2001) konnten keinen
BCRP-vermittelten Rhodamin-Efflux nachweisen.
Die Kumulations-Assays mit Rhodamin 123 führten zum Nachweis
funktionellen Pgps in hCMEC/D3-Zellen, welches durch bekannte Induktoren und
den Pgp-Inhibitor Tariquidar beeinflusst werden konnte. Zudem variierten die
Ergebnisse der Kumulations-Assays nicht so stark und ließen folglich auf robustere
Daten als mit dem Pgp-Substrat Digoxin schließen. Außerdem war es möglich,
modulierende Effekte nach der Behandlung mit Antiepileptika zu detektieren.
Rhodamin 123 war unter den gewählten Versuchsbedingungen ein geeignetes
Substrat, um Modulationen der Pgp-Funktionalität zu untersuchen.
In ersten Versuchen wurde der Einfluss des Serums sowie weiterer
Mediumszusätze auf den Efflux deutlich. Nach dem Protokoll von P.-O. Couraud
werden die hCMEC/D3-Zellen mit standardisiertem bovinem Serum kultiviert.
Aufgrund der hier durchgeführten Versuche und Vergleiche (Abbildung 5.4) wurde für
die Kumulationsexperimente nicht-standardisiertes Serum verwendet.
6.1.2.2 Bekannte Pgp-Induktoren
Um das Ausmaß einer Induktion durch Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen
abschätzen zu können, wurden geeignete Kontrollen benötigt. Diese sollten in den
Kumulationsversuchen sicherstellen, dass die Pgp-Funktionalität auch beeinflusst
werden konnte sowie Informationen über die Empfindlichkeit dieses Assays geben.
Dazu wurden bekannte Pgp-Induktoren eingesetzt, das Glukokortikoid
Dexamethason, die Zytostatika Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin
(FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999; DEMEUSE et al. 2004) und der
Neurotransmitter Glutamat. Die Zellen wurden mit diesen sechs Substanzen und
dem bekannten Pgp-Inhibitor Tariquidar behandelt. Mit Ausnahme des Inhibitors
erfolgte die Behandlung dabei i.d.R. über 3 Tage mit Beginn am 3. Tag nach
Erreichen der Konfluenz. Die gewählten Bedingungen für den Kumulations-Assay
waren für bekannte Pgp-Induktoren sensitiv genug, um Pgp-Induktionen nachweisen
zu können. Allerdings waren die Effekte dieser Induktoren sehr unbeständig. So
führte beispielsweise Dexamethason, welches einen bekannten Induktor für Pgp
141

DISKUSSION
darstellt (SCHINKEL et al. 1996; FARDEL et al. 1997; RÉGINA et al. 1999), in
einigen Versuchen zur Induktion des Efflux. In weiteren Experimenten konnte dieser
Effekt nicht immer wiederholt werden. Es wurden verschiedene Konzentrationen
dieser Substanz getestet, allerdings konnte keine Konzentration gefunden werden,
die in allen Versuchen robuste Effekte lieferte. Die Untersuchung weiterer bekannter
Pgp-Induktoren wie Doxorubicin, Puromycin, Rifampicin und Vincristin zeigte für
einzelne Konzentrationen eine Induktion der Pgp-Funktionalität (Abbildung 5.5).
Für alle getesteten Pgp-Induktoren fiel auf, dass die Effekte in den
hCMEC/D3-Zellen konzentrationsabhängig zu sein schienen. Sofern mehrere
Konzentrationen getestet wurden, führten oftmals die höheren Dosierungen zu einer
Induktion des Rhodamin-Efflux bzw. einer noch stärkeren Induktion. In der
Zusammenfassung aller Versuche in Abbildung 5.7 ist zu sehen, dass
Dexamethason und Puromycin jeweils in der höchsten Konzentration die stärksten
induzierende Effekte zeigten. In Untersuchungen einer anderer Arbeitsgruppe mit
Caco-2-Zellen (aus dem Darm) führte Rifampicin in der Konzentration von 20 µM
ebenfalls zu einer Induktion des Efflux durch Pgp (DIXIT et al. 2002). Diese
Konzentration sowie weitere (5 und 10 µM) führten in der vorliegenden Arbeit zu
einer Inhibition des Efflux in den hCMEC/D3-Zellen. Erst in der Konzentration von 50
µM Rifampicin wurde der Rhodamin-Efflux in den humanen Zellen signifikant
induziert (Abbildung 5.7). Höhere Konzentrationen für Puromycin (2,65 µM) und
Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) zeigten inhibitorische Wirkungen, was anhand
eines erhöhten Rhodamin-Gehalts im Vergleich zur Kontrolle zu erkennen war
(Daten nicht gezeigt).
Vincristin führte als einzige Substanz zu reproduzierbaren Ergebnissen und
induzierte die Pgp-Funktionalität. In der höheren Konzentration von 40 nM wirkte
Vincristin toxisch, was sich als Zellablösungen zeigte (Daten nicht dargestellt). Diese
Effekte traten auch nach höheren Konzentrationen für Doxorubicin (0,92 µM),
Puromycin (2,65 µM) und Rifampicin (200, 500 und 1000 µM) auf. Während der
Behandlung kam es zu zum Teil starken Ablösungen der Zellen. Derartige Effekte
waren zu erwarten, da es sich bei den genannten Substanzen um Zytostatika handelt
(BITTER 1977; FISCHER 1994; HUGHES & CALVIN 1979; YARMOLINSKY & DE
LA HABA 1959). Zudem weisen hCMEC/D3-Zellen im Vergleich zur
Rattenhirnendothelzelllinie GPNT einen geringeren Gehalt an Pgp auf (siehe
Abschnitt 5.1.2), weshalb die Zellen nur in einem geringeren Ausmaß in der Lage
142

DISKUSSION
sind, Substanzen schnellstmöglich aus den Zellen zu transportieren und sich auf
diese Weise vor toxischen Wirkungen zu schützen. Die Behandlungen mit diesen
hohen Konzentrationen führten i.d.R. zu einer Induktion des Efflux, dennoch wurden
diese Daten aus der Gesamtwertung ausgeschlossen. Der Rhodamin-Gehalt wird
zwar auf die Proteinkonzentration bezogen und nimmt demnach auch Bezug auf eine
geringere Zellzahl. Trotzdem wären falsch positive hinsichtlich einer Induktion
denkbar, weshalb die induzierenden Effekte nach Zellablösungen unter Vorbehalt zu
betrachten sind. Mit dem spezifischen Hemmstoff Tariquidar (SZAKÁCS et al. 2006)
konnte stets eine Inhibition des Rhodamin-Efflux nachgewiesen werden, d.h. dass
die Zellen funktionelles Pgp aufwiesen.
Der Vergleich der hCMEC/D3-Zellen mit den Rattenhirnkapillarendothelien
GPNT und RBE4 zeigte funktionelles Pgp in allen drei Zelllinien, wobei der stärkste
Efflux des Substrats bei den GPNT-Zellen auftrat (Abbildung 5.4). Im vergleichenden
Kumulations-Assay konnte der Rhodamin-Efflux in RBE4-Zellen ebenfalls durch
Dexamethason induziert werden. In GPNT-Zellen war dieser Effekt nicht zu sehen.
Außerdem zeigten diese Zellen einen höheren Efflux, der an dem niedrigen
intrazellulären Rhodamin-Gehalt zu erkennen war. Der Efflux der Kontrollgruppen der
hCMEC/D3- und RBE4-Zellen fiel geringer aus. Als Ursache für diesen variablen
Efflux wären unterschiedliche Pgp-Gehalte als Ursache denkbar. Dies konnte
anhand der Western Blots bestätigt werden (Abbildung 5.2). Die GPNT-Zellen
zeigten demnach die höchste Pgp-Expression. Solch hohe Expressionen können
durch Induktoren kaum gesteigert werden, was in dem Kumulationsversuch zu sehen
war. In allen drei Zelllinien bestand eine Korrelationen zwischen der Funktion und der
Expression des Transporters Pgp.
Weitere Ursachen für dieses unterschiedliche Ausmaß des Rhodamin-Efflux
könnten die Herkunft (Spezies und Organ) oder die verschiedenen Mechanismen für
die Pgp-Induktion sein. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Pgp-Funktion über
die ONRs PXR und CAR vermittelt wird. Diese Rezeptoren werden u.a. auch an der
BHS exprimiert (BAUER et al. 2006) und sorgen dort durch Induktionen von MDT für
den Abtransport von Xenobiotika. Die Expression dieser Rezeptoren ist allerdings
sehr variabel und wird als gewebe- und zellspezifisch erachtet (XU et al. 2005;
CHEN 2010). Bestimmte Substanzen stimulieren die Rezeptoren, die wiederum Pgp
induzieren (BAUER et al. 2005; OTT et al. 2009). Für Rifampicin wiesen CHEN &
RAYMOND (2006) und ZHOU et al. (2008) nach, dass dessen Wirkung PXR-
143

DISKUSSION
vermittelt ist. MILLER et al. (2008) zeigten außerdem, dass Rifampicin besonders
stark an humanes PXR gebunden wird. So kann die Induktion von Rifampicin auf die
Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen (Abbildung 5.5) erklärt werden.
Dexamethason, für das ebenfalls eine induzierende Wirkung über PXR
nachgewiesen wurde (PASCUSSI et al. 2000; NARANG et al. 2008), zeigte in den
humanen und RBE4-Zellen ebenfalls eine Induktion der Pgp-Funktionalität, aber
nicht in GPNT-Zellen (Abbildung 5.4). AMBROZIAK et al. (2010) konnten in GPNT-
Zellen PXR nur in einem geringen Maß, CAR gar nicht nachweisen, was den
ausbleibenden Effekt von Dexamethason in GPNT-Zellen erklären würde.
Über die ONRs hinaus wären aber auch noch weitere Mechanismen denkbar.
DAUCHY et al. (2009) konnten beispielsweise zeigen, dass sowohl PXR als auch
CAR in hCMEC/D3-Zellen herunterreguliert sind. Dies würde erklären, warum
Dexamethason in den getesteten Konzentrationen nicht immer zur Induktion in
diesen Zellen führte. Außerdem wurden in vorhergehenden Versuchen mit GPNT-
Zellen induzierende Effekte durch Dexamethason auf die Pgp-Funktionalität
nachgewiesen (ALMS et al. 2012).
6.1.2.3 Antiepileptika
Ein Ziel dieser Arbeit war es, Antiepileptika bezüglich ihrer modulatorischen
Wirkung auf den Efflux-Transporter Pgp zu untersuchen. Der Nachweis der Induktion
durch Antiepileptika (Carbamazepin, Phenobarbital, Phenytoin) wurde bereits in
Darm- und Leberzellen und Lymphozyten erbracht (SCHUETZ et al. 1996; OWEN et
al. 2006; MARTIN et al. 2008). Nachdem diese Effekte auch in den
Rattenhirnkapillarendothelien GPNT und RBE4 gezeigt werden konnten
(LOMBARDO et al. 2008; ALMS et al. 2012), sollte dies nun auch in einer Zelllinie
humanen Ursprungs untersucht werden. Erste Versuche der vorliegenden Arbeit
konzentrierten sich darauf, geeignete Versuchsbedingungen (Einflüsse auf die
Kultivierung, Induktoren) zu finden. Dazu wurden Untersuchungen zur Modifikation
von Pgp durch Antiepileptika mit Gruppengrößen n=3 durchgeführt, die aber später in
einer Gesamtauswertung zusammengefasst wurden. In den einzelnen Versuchen
wurden möglichst viele Antiepileptika in verschiedenen Konzentrationen hinsichtlich
ihrer möglichen induzierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität untersucht.
Einige Antiepileptika stellen Substrate für Pgp dar (CROWE & TEOH 2006;
LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). Für Lamotrigin, Levetiracetam, Oxcarbazepin,
144

DISKUSSION
Phenobarbital, Phenytoin und Topiramat wurde nachgewiesen, dass sie Substrate
für Pgp in Nagern und im Menschen sind. Für Valproat und Carbamazepin ist dies
noch nicht abschließend geklärt (LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012).
Allerdings muss ein Pgp-Substrat nicht gleichzeitig ein Induktor dieses Efflux-
Transporters sein (BECKER & DREWE 2006; siehe Tabelle 2.1). Die meisten Pgp-
Induktoren sind i.d.R. auch Induktoren der Cytochrom-P 450 -Enzyme (GUTMANN &
DREWE 2002). Bei den älteren Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und
Phenytoin handelt es sich um Substanzen, die das Cytochrom-P 450 -System
induzieren (LÖSCHER & SCHMIDT 2011), was einen beschleunigten Abbau dieser
Antiepileptika durch diese Enzyme zur Folge hat. Neuere Antiepileptika zeigen diese
Induktion der Cytochrom-P 450 -Enzyme oftmals nicht, weil während der Synthese ein
möglicher oxidativer Metabolismus vermieden wurde (BECKER & DREWE 2006).
In der vorliegenden Arbeit ließen drei der sechs untersuchten Antiepileptika
keinen Einfluss auf die Pgp-Funktionalität erkennen (Abbildung 5.9 & 5.12). Dabei
wird davon ausgegangen, dass eine verringerte Rhodamin-Kumulation in den Zellen
auf eine gesteigerte Funktionalität oder Expression von Pgp zurückzuführen ist (LEE
et al. 1994). Carbamazepin und Valproat verursachten in den humanen Zellen einen
erniedrigten Rhodamin-Gehalt. Allerdings waren diese Effekte moderat, und
Induktionen konnten für die Substanzen v.a. in den höheren Konzentrationen
nachgewiesen werden (Abbildung 5.9). Ähnlich verhielt es sich in RBE4-Zellen.
Induktionen der Pgp-Funktionalität wurden nach der Behandlung mit Carbamazepin
(10 und 50 µM) und Topiramat (100 µM) nachgewiesen (Abbildung 5.12 B). In
hCMEC/D3-Zellen führten einzelne Konzentrationen für Phenobarbital (300 µM),
Phenytoin (10 und 30 µM), Topiramat (300 µM) und Valproat (100 µM) zu Tendenzen
einer Inhibition bzw. zu einem signifikanten Anstieg der Rhodamin-Kumulation
(Abbildung 5.8 B, C & E und 5.9). Eine Inhibition des Efflux durch Valproat (300 µM)
wurde ebenfalls in RBE4-Zellen nachgewiesen (Abbildung 5.12 B). Dies lässt
vermuten, dass die Substanzen in diesen Konzentrationen eine Inhibition der
Transporter-Funktionalität verursachen, wenn das Ausmaß dieser Hemmung auch
geringer ausfiel als für den Inhibitor Tariquidar. Möglicherweise wurde aber durch die
Konzentrationssteigerung ein toxischer Bereich erreicht, in dem die Zellen das
Antiepileptikum nicht mehr in ausreichendem Maß bewältigen können, und es zu
negativen Effekten für die Zellen kommt. Es bleibt festzuhalten, dass Valproat als
einzige Substanz in therapeutischen Konzentrationen (250-500 µM) zu einer
145

DISKUSSION
Inhibition der Pgp-Funktion führte (Abbildungen 5.8 E und 5.12 B). Die Ursache bleibt
zu klären, aber WEISS et al. (2003) zeigten in Untersuchungen mit LLC-Zellen
ebenfalls inhibitorische Effekte nach der Behandlung mit Valproat (> 100 µM) und
Phenytoin (> 100 µM). In der Zusammenfassung der einzelnen Effekte nach der
Behandlung mit Antiepileptika in hCMEC/D3-Zellen zeigten lediglich Carbamazepin
und Valproat eine Induktion der Pgp-Funktionalität. Die inhibitorischen Effekte der
anderen Antiepileptika wurden in der zusammenfassenden Darstellung der
Einzelversuche aufgehoben (Abbildung 5.9). In GPNT-Zellen führte keines der
untersuchten Antiepileptika zu einer Modulation der Pgp-Funktionalität, was mit der
fehlenden bzw. geringen Expression von PXR und CAR begründet werden kann
(AMBROZIAK et al. 2010).
Die modulatorischen Wirkungen der untersuchten Antiepileptika waren nicht
mit den Effekten bekannter Induktoren vergleichbar. Dies könnte mehrere Ursachen
haben. Zum einen wäre es möglich, dass Antiepileptika in therapeutischen
Konzentrationen Pgp an der BHS nicht induzieren. Zum anderen könnten Beginn und
Dauer der Behandlung eine Rolle spielen. So könnten die Zellen zu Beginn der
Behandlung (i.d.R. am 3. Tag nach Erreichen der Konfluenz) beispielsweise noch
nicht ausdifferenziert und dementsprechend noch wenig Pgp vorhanden sein. Dies
würde durch Antiepileptika nur wenig oder gar nicht beeinflusst werden. Andererseits
stammen die hCMEC/D3-Zellen aus dem epileptischen Fokus einer
pharmakoresistenten Patientin, weshalb man von einer erhöhten Pgp-Expression
ausgehen kann. Damit wären schwache Induktoren, wie z.B. Antiepileptika, bei
einem bereits sehr hohen Pgp-Gehalt nicht in der Lage, die Funktionalität weiter zu
induzieren. Dennoch zeigten die Zellen im Vergleich mit GPNT-Zellen eine signifikant
geringere Expression dieses Transporters, weshalb eine Steigerung der Expression
möglich wäre. Mit einer längeren Behandlungsdauer könnten möglicherweise mehr
induzierende Effekte auf die Pgp-Funktionalität nachgewiesen werden. Für Valproat
wurde in einem einzelnen Versuch die Behandlung auf 6 Tage ausgedehnt.
Unterschiede im Vergleich zur 3-tägigen Behandlung waren nicht zu erkennen.
Allerdings zeigten WEN et al. (2008), dass eine 21-tägige Behandlung mit den
Antiepileptika Phenobarbital, Carbamazepin und Phenytoin zu einer signifikant
erhöhten Pgp-Expression im Gehirn der Ratte führten. LOMBARDO et al. (2008)
konnten Induktionen der Pgp-Expression in GPNT- und RBE4-Zellen durch die
Behandlung mit Phenobarbital, Carbamazepin und Phenytoin bereits nach 3 Tagen
146

DISKUSSION
nachweisen. In wie weit sich die Expression dann auch auf die Funktionalität
auswirkt, ist unklar. Allerdings zeigten YANG et al. (2008) in In-vitro-Experimenten
mit Rattenhirnendothelien, dass die Funktionalität und Expression von Pgp nach
einer 60-tägigen Behandlung mit Antiepileptika (Carbamazepin, Phenobarbital,
Phenytoin und Valproat) und Rifampicin parallel induziert wurden. Dennoch müssen
Funktionalität und Expression von Pgp nicht zwangsläufig miteinander korrelieren.
Wenn Substanzen nur über einen relativ kurzen Zeitraum auf die Funktionalität
einwirken, müssen mögliche Effekte nicht unbedingt auch für die Expression gelten.
Ebenso müssen Abweichungen in der Expression nicht mit einer veränderten
Funktionalität einhergehen. Ungeachtet dessen könnte die Dauer der Behandlung in
den hier dargestellten Versuchen (drei Tage) den Nachweis stärkerer Induktionen
durch Antiepileptika unmöglich gemacht haben. Im Gegensatz dazu zeigten
fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Pgp-Trafficking an mit grünfluoreszierenden
Pgp (GFP-Pgp) transfizierten hCMEC/D3-Zellen in der hiesigen
Arbeitsgruppe, dass bereits zwei Stunden nach der Behandlung mit der Pgpinduzierenden
Substanz Mitomycin C die Translokation von Pgp aus dem Zytosol zu
den Membranen erfolgt. Eine Auswirkung auf die Funktionalität bzw. Expression war
erst 24 h später nachweisbar (A. Noack, Publikation in Revision), wobei es sich um
eine kürzere Zeitspanne handelt als für die in dieser Arbeit durchgeführten
Behandlungen. Zu beachten ist aber, dass intrazelluläres Pgp-Trafficking von der
Polarisation der Zellen und auch der Wahl der Zelllinie abhängig ist (FU & ARIAS
2012) und demzufolge Studien mit verschiedenen Zellkulturmodellen zu
unterschiedlichen Ergebnissen kommen können.
Bezüglich der Kultivierungsdauer (Anzahl der Passagen) könnte ein variabler
Pgp-Gehalt in den Zellen dafür verantwortlich sein, dass die Grundfunktion verändert
wird und robuste Effekte nur schwer nachweisbar sind. Das Ausmaß der Expression
von Pgp im Laufe der Kultivierung von Zellen kann durchaus einen Einfluss auf den
Nachweis bestimmter Effekte haben. Ein unterschiedliches Ausmaß des Efflux war
aber in Abhängigkeit der Kultivierungsdauer und der Passagenzahl der hCMEC/D3-
Zellen nicht erkennbar. Dennoch ist eine genauere Kenntnis zum Einfluss der Dauer
der Zellkultur und Behandlung auf die Expressions- und Funktionalitätslevel
unbedingt notwendig.
Die Induktion von Pgp wird u.a. über die Rezeptoren CAR und PXR vermittelt
(EKINS & ERICKSON 2002; WANG & LECLUYSE 2003). Außerdem zeigten
147

DISKUSSION
NALLANI et al. (2003) und CHEN et al. (2004) in Leberzellen Interaktionen zwischen
dem Pregnane-X-Rezeptor (PXR) und den Antiepileptika Phenobarbital und
Topiramat. AMBROZIAK et al. (2010) untersuchten bereits die Induktion einer
Überexpression von Pgp durch die Antiepileptika Carbamazepin, Phenobarbital und
Phenytoin und den bekannten Pgp-Induktor Dexamethason in MDCK II-Zellen
(Hundeniere) und GPNT-Zellen (Rattenhirn). Dabei konnte keine induzierende
Wirkung auf Pgp nachgewiesen werden. Die Expression von PXR und CAR ist
allerdings gewebe- und zellspezifisch und sehr variabel (XU et al. 2005; CHEN
2010). Laut DAUCHY et al. (2009) sind beide Rezeptoren in hCMEC/D3-Zellen
herunterreguliert. Dies könnte für das geringe Ausmaß an Modulationen der Pgp-
Funktionalität in den humanen Zellen verantwortlich sein. AMBROZIAK et al. (2010)
konnten in GPNT-Zellen PXR nicht und CAR nur in einem geringen Ausmaß
nachweisen. Dies könnte der Grund für die ausleibenden Induktionen durch
Antiepileptika in diesen Rattenzellen sein.
Um mögliche falsch positive oder negative Effekte ausschließen zu können,
müssten weitere Kumulationsversuche zu den einzelnen Antiepileptika durchgeführt
werden. Insgesamt ist zu sagen, dass Carbamazepin, Topiramat und Valproat die
stärksten induzierenden Effekte auf die Funktionalität von Pgp aufwiesen. Doch auch
diese Effekte waren moderat. Die hCMEC/D3-Zellen waren eher unempfindlich
gegenüber den untersuchten Pgp-Induktoren und Antiepileptika, obgleich sie eine
relativ geringe Pgp-Expression aufwiesen (Abbildung 5.2). In RBE4-Zellen wurden
aufgrund einer geringen Expression induzierende Effekte nachgewiesen. Die
weiteren Antiepileptika zeigten Tendenzen zur Induktion der Pgp-Funktionalität. Die
GPNT-Zellen zeigten eine vergleichsweise sehr hohe Pgp-Expression, weshalb nach
der Behandlung mit Antiepileptika keine Effekte beobachtet wurden.
6.1.2.4 Hydrocortison
Die hCMEC/D3-Zellen werden im Allgemeinen nach dem Protokoll von P.-O.
Couraud mit 1,4 µM Hydrocortison kultiviert. Diese Substanz fördert die Ausbildung
von Tight junctions (FÖRSTER et al. 2008). In porcinen Hirnkapillarendothelzellen
bewirkte Hydrocortison einen Anstieg des TEER um den Faktor 2,5 innerhalb von 3
Tagen (HOHEISEL et al. 1998), womit die Barriereeigenschaften der Zellen gefördert
werden. Dieser Effekt ist für Transportuntersuchungen wünschenswert, aber für
Kumulationsstudien nicht notwendig. Gleichzeitig kann Hydrocortison induzierend auf
148

DISKUSSION
die Pgp-Funktionalität wirken (MAINES et al. 2005) und damit Induktionen durch
andere Substanzen überdecken. Die humanen Zellen wurden für die Kultivierung und
Behandlungszeiträume bis zu den beschriebenen Kumulationsversuchen dem
Hydrocortison im Medium ausgesetzt. Zur Überprüfung des Einflusses auf die Pgp-
Funktionalität wurden zwei vergleichende Kumulations-Assays durchgeführt, in
denen die Zellen ab der Aussaat mit und ohne Hydrocortison kultiviert und mit
verschiedenen Substanzen behandelt wurden. Die Zellen ohne Hydrocortison wiesen
einen höheren Rhodamin-Gehalt auf (Abbildung 5.10 A), was möglicherweise auf
eine geringere Pgp-Funktionalität oder –Expression zurückgeführt werden kann.
Allerdings würde man dann eine geringe Inhibition durch Tariquidar erwarten. Die
signifikant höhere Inhibition durch Tariquidar bei den Zellen ohne Hydrocortison kann
damit nicht erklärt werden.
Sowohl die Gruppe mit Hydrocortison als auch ohne reagierten auf eine relativ
hohe Konzentration an Doxorubicin (0,92 µM) in Form von Zellablösungen, wobei die
Zellen ohne Hydrocortison stärkere Zellablösungen zeigten und empfindlicher
reagierten (nicht dargestellt). Dies lässt darauf schließen, die Zellen ohne
Hydrocortison eine geringere Pgp-Funktion aufweisen und somit toxische Wirkungen
durch das Zytostatikum ermöglicht werden. Weiterhin zeigten die Zellen ohne
Hydrocortison eine höhere Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit
Antiepileptika (Abbildung 5.10 B), die sich auch in inhibitorischen Effekten äußerte.
Hydrocortison induzierte also die Pgp-Funktionalität, wodurch induzierende Effekte
anderer Substanzen überdeckt werden können. Um die Modulationen durch
Antiepileptika weiter zu untersuchen, sollten die humanen Zellen für weitere
Kumulationsversuche ohne Hydrocortison kultiviert werden.
6.1.2.5 Zusammenfassung der modulatorischen Effekte auf Pgp
Zusammenfassend ist zu sagen, dass in den hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-
Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden konnte. Die Funktion dieses
Transporters wurde durch bekannte Pgp-Induktoren und -Inhibitoren sowie
Antiepileptika moduliert. Generell reagierten die humanen Zellen und GPNT-Zellen
im Vergleich zu den RBE4-Zellen aber relativ unempfindlich gegenüber Modulationen
durch Antiepileptika und bekannte Pgp-Induktoren. In weiterführenden
Untersuchungen sollten die Ursachen dieser modulatorischen Effekte, die
beispielsweise über die ONRs vermittelt werden, genauer betrachtet werden.
149

DISKUSSION
6.1.3 hCMEC/D3-Zellen als In-vitro-Bluthirnschranken-Modell
Mehrere Studien in Epithelzellen der Niere, die sich mit ihrer hohen Integrität
der Monolayer für Transportuntersuchungen eignen (LUNA-TORTÓS et al. 2008 &
2009), belegten bereits den Transport von Antiepileptika durch Pgp (LÖSCHER et al.
2011; ZHANG et al. 2012). Bislang gibt es kein ideales Modell der BHS und Daten
aus Untersuchungen mit humanem Gewebe bzw. Zellen sind kaum bekannt. Es
wurden Untersuchungen an hCMEC/D3-Zellen durchgeführt, die zur Entwicklung
neuer und besserer Modelle für die BHS beitragen sollen (WEKSLER et al. 2005;
CUCULLO et al. 2008; POLLER et al. 2008; TAI et al. 2009). Aufgrund der
Expression von Efflux-Transportern wie Pgp, MRP1 und BCRP (WEKSLER et al.
2005; DAUCHY et al. 2009), die die Zellen zum aktiven Substanz-Transport
befähigen, gelten hCMEC/D3-Zellen als geeignetes Werkzeug für Studien zur
Entzündungs- und Infektionsantworten und der BHS-Funktion (CUCULLO et al.
2008; FASLER-KAN et al. 2010; POLLER et al. 2010; DANIELS et al. 2012).
POLLER et al. (2008) und weitere Arbeitsgruppen berichteten vom Einsatz der
hCMEC/D3-Zellen als BHS-Modell für Transportuntersuchungen (CARL et al. 2010;
HSUCHOU et al. 2010). Sie untersuchten die parazellulären Permeabilitäten von
Markersubstanzen wie Sucrose, Inulin und Mannitol, die durch die Verwendung von
humanem Serum im Kulturmedium der Zellen reduziert wurden, und zeigten
außerdem den direkten Pgp-vermittelten Transport von Rhodamin 123 (POLLER et
al. 2008). Des Weiteren untersuchten HATHERELL et al. (2011) eine verbesserte
Anwendung der hCMEC/D3-Zellen durch die Kokultur mit Astrozyten, die zu einer
Erhöhung der TEER-Werte führte und damit die Integrität der Zellmonolayer förderte.
Dennoch wird der Einsatz der hCMEC/D3-Zellen als BHS-Modell kontrovers
diskutiert (URICH et al. 2012), v.a. weil immortalisierte Hirnendothelzelllinien nur eine
unzureichende Dichtigkeit der Monolayer aufweisen und damit für
Transportuntersuchungen als ungeeignet gelten (DELI et al. 2005; ROUX &
COURAUD 2005). Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit der Einsatz
der humanen immortalisierten Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-BHS-Modell weiter
untersucht werden.
In vielen In-vivo- und In-vitro-Studien wurde untersucht, ob MDT wie zum
Beispiel das Pgp Antiepileptika transportieren (SCHINKEL et al. 1996; MAHAR
DOAN et al. 2002; BALTES et al. 2007a, b; LUNA-TORTÓS et al. 2008; ROBEY et
150

DISKUSSION
al. 2008a). Dies ist laut der MDT-Hypothese eine Erklärung für die
Pharmakoresistenz bei Epilepsien (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b; SCHMIDT &
LÖSCHER 2009). Für etliche Antiepileptika wie z.B. Levetiracetam, Phenobarbital,
Phenytoin, Topiramat und Valproat wurde bereits nachgewiesen, dass sie von Pgp
transportiert werden (LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al. 2012), womit geringe
Konzentrationen der Antiepileptika im Gehirn zu erklären wären. Welche weiteren
Antiepileptika Substrate von MDT darstellen und dementsprechend modulierende
Effekte möglich sind, wird nach wie vor diskutiert (OWEN et al. 2001; BALTES et al.
2007a, b; LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009; LÖSCHER et al. 2011; ZHANG et al.
2012). Der Transport von u.a. Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin und
Topiramat durch Pgp wurde in den Zelllinien LLC und MDCK II nachgewiesen
(LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009), die aus dem Nierenepithel des Schweins bzw.
des Hundes stammen. Um den Transport von Antiepileptika durch Pgp an der BHS
untersuchen zu können, wurde deshalb die Hirnendothelkapillarzellen hCMEC/D3
eingesetzt. Sofern sich diese immortalisierte Zelllinie für die Anwendung als BHS-
Modell eignet, sollte in weiterführenden Studien der Transport von Antiepileptika in
Hirnendothelzellen humanen Ursprungs untersucht werden.
6.1.3.1 Einflüsse auf den Nachweis von Pgp-spezifischen Transport
Es wurden verschiedene bekannte Pgp-Substrate und Einflüsse durch das
Membranmaterial, Mediumszusätze (Simvastatin, weitere Wachstumsfaktoren), den
Ursprung und die Qualität des Serums und das Format der Membraneinlagen
untersucht.
Auswahl des Substrats
In Untersuchungen des Transports in Zellen aus Nierenepithel (LLC-PK1 und
MDCK II) wurde der Transport von Digoxin durch Pgp nachgewiesen
(TAIPALENSUU et al. 2004; ACHARYA et al. 2008; LUNA-TORTÓS et al. 2008 und
2009). Dieses von der FDA empfohlene Substrat für Transportstudien in Nierenzellen
(FDA, 2006) zeigte trotz Variation und Optimierung der Versuchsbedingungen in
keinem der Versuche mit hCMEC/D3-Zellen einen Transport, obgleich mehrere
Parameter angepasst wurden (Abbildung 5.14, 5.15 & 5.20). Ähnlich verhielt es sich
mit Verapamil, welches ebenfalls ein Pgp-Substrat darstellt (HENDRIKSE et al. 1998;
LEE et al. 2006; Abbildung 5.15) und für das in Studien von SHIRASAKA et al.
151

DISKUSSION
(2008) ein konzentrationsabhängiger Transport in Caco-2- und MDCK II-Zellen
nachgewiesen wurde. Möglicherweise wurde ein Transport von Verapamil und
Digoxin durch die hohe parazelluläre Permeabilität der humanen Zellen überdeckt,
was die Problematik dieser immortalisierten Endothelzellen als Transwell-Modell
bestätigen würde. Allerdings wird von ACHARYA et al. (2008) angenommen, dass
Digoxin neben Pgp von einem anderen noch nicht weiter beschriebenen Transporter
in MDCK II-Zellen transportiert wird. Sofern dieser Transporter nicht in allen Zellen zu
finden ist, könnte auf diese Weise erklärt werden, warum der Transport von Digoxin
in hCMEC/D3-Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Allerdings weisen die recht
niedrigen TEER-Werte und v.a. die hohen Mannitol-Permeabilitäten darauf hin, dass
aufgrund der unzureichenden Integrität der parazelluläre Transport von Digoxin und
Verapamil wesentlich höher war als ein Pgp-vermittelter Transport dieser
Substanzen.
In allen Versuchen, in denen ein asymmetrischer Transport in den in dieser
Arbeit beschriebenen Versuchen festzustellen war, handelte es sich um die Substanz
Rhodamin 123, die ebenfalls ein Pgp-Substrat darstellt (EFFERTH et al. 1989; LEE
et al. 1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009) und für Transportexperimente mit
diesen Zellen geeignet erschien. Die Vermutung, dass Rhodamin 123 auch von
BCRP transportiert wird, konnte von ROBEY et al. (2001) und in Studien im hiesigen
Labor (K. Römermann, unveröffentlichte Daten) nicht bestätigt werden.
Einflüsse auf den Widerstand und die Permeabilität
Dichte Zellmonolayer sind für Transport-Assays unerlässlich. Die Dichtigkeit
der Monolayer wurde zum einen durch den transendothelialen elektrischen
Widerstand, zum anderen durch die parazelluläre Permeabilität der Substanz
Mannitol bestimmt. Wenn ein Zellmonolayer nicht ausreichend dicht ist, kann
Mannitol zwischen den Zellen parazellulär diffundieren. Dies würde auch für andere
Substanzen, dessen Transport untersucht werden soll, gelten. Das heißt, dass ein
hoher transendothelialer elektrischer Widerstand der Zellmonolayer sowie eine
niedrige Permeabilität des parazellulären Markers Mannitol Voraussetzungen für
Transportuntersuchungen sind (LUNA-TORTÓS et al. 2008; HELMS et al. 2010).
CLAUDE et al. (1978) zeigten z.B., dass die Anzahl der Tight junctions mit dem
transendothelialen Widerstand korreliert. Deshalb wurden für alle Transport-Assays
Messungen beider Parameter durchgeführt. Dabei sollten Werte von 12 nm/s bzw.
152

DISKUSSION
1 %/h für die Permeabilität von Mannitol nicht überschritten werden und der TEER
Werte von mindestens 100 Ω*cm 2 aufweisen (nach LUNA-TORTÓS et al. 2008). In
Transportstudien von Antiepileptika durch Pgp wurden derartige Werte in LLC- und
MDCK II-Zellen gemessen (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). In hCMEC/D3-
Zellen wurden in Monokultur bzw. Kokultur mit Astrozyten bislang nur relativ geringe
TEER-Werte gemessen (< 40 bzw. 63 Ω*cm 2 ) (WEKSLER et al. 2005; HATHERELL
et al. 2011). Die Mannitol-Permeabilität wurde nur von CARL et al. (2010) untersucht
und zeigte Werte von 24,7 ± 0,2 nm/s.
Die Untersuchungen der Einflüsse durch das im Medium enthaltende Serum,
durch verschiedene Membraneinlagen und –formate im Transwell-System und die
Kokultur mit Astrozyten zeigten, dass alle genannten Faktoren sich in einem
bestimmten Ausmaß auf den Nachweis des Transports auswirken. Dies wird in den
folgenden Abschnitten beschrieben.
Material und Format der Membraneinlagen
Aufgrund von Lieferproblemen wurde der Herstellungsprozess der bisher
verwendeten Polyester-Membranen der Firma Corning geändert. Der Transport
gängiger Pgp-Substrate war nach dieser Umstellung aufgrund der Absorption der
Substanzen durch die Membranen in Nierenepithelzellen (LLC und MDCK II) nicht
mehr bzw. nur noch teilweise nachweisbar (K. Römermann, unveröffentlichte Daten).
Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit auch Membraneinlagen anderer Firmen
(Greiner Bio-One und Millipore) getestet, aber die Dichtigkeit der Zellmembran war
aufgrund einer anderen Porendichte der Membran-Inserts mit der des bisherigen
Herstellers Corning nicht vergleichbar (siehe Tabelle 4.2 S. 54). Auffällig war, dass
die Membran-Inserts des Herstellers Corning stets höhere TEER-Werte aufwiesen.
Diese scheinbar höhere Integrität der Monolayer hatte aber keinen Einfluss auf den
Nachweis eines asymmetrischen Transports. In Transportstudien mit hCMEC/D3-
Zellen werden auch Corning-Membraneinlagen verwendet (CUCULLO et al. 2008;
POLLER et al. 2008; JOICE et al. 2009; CARL et al. 2010), wobei die TEER-Werte
zwischen 30 und 80 Ω*cm 2 lagen. Ähnlich niedrige Widerstände wurden auch in den
hier beschriebenen Versuchen gemessen (17,9-65 Ω*cm 2 , Abbildung 5.13, 5.16, 5.17
B, 5.18 B & C und 5.19 A).
Die Polyester-Membranen, die üblicherweise in der hiesigen Arbeitsgruppe für
Transportversuche verwendet werden, führten in einzelnen Versuchen zu einem
153

DISKUSSION
Nachweis eines asymmetrischen Rhodamin-Transports. Die Unterschiede des
Substratgehalts zwischen apikaler und basolateraler Kammer fielen für die
Membranen aus Polycarbonat aber deutlicher aus. Außerdem zeigten die
Zellmonolayer höhere TEER-Werte. Polycarbonat-Membranen schienen unter den
gewählten Bedingungen besser geeignet zu sein. Genauere Angaben dazu sind in
der Literatur nicht zu finden.
Untersuchungen des Formats der Membran-Inserts machten deutlich, dass
die Wachstumsfläche einen entscheidenden Einfluss auf die Integrität der
Zellmonolayer haben kann. Mit der Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf kleineren
Membranen im 12Well-Format (Wachstumsfläche: 1,12 cm 2 ) zeigten die Monolayer
eine höhere Dichtigkeit, die durch etwa 4-fach höhere TEER-Werte und niedrigere
Mannitol-Permeabilitäten gekennzeichnet war. In den Untersuchungen von
CUCULLO et al. (2008) und POLLER et al. (2008) wurden ebenfalls die kleineren
Transwell-Inserts verwendet und die Dichtigkeit zumindest in CUCULLO et al. (2008)
durch Messungen des Widerstands überprüft. Die TEER-Werte fielen aber mit 60-80
Ω*cm 2 niedriger aus als in der vorliegenden Arbeit (138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 ). Mannitol-
Permeabilitäten wurden nicht bestimmt. Allerdings untersuchten POLLER et al.
(2008) die Permeabilitäten von Sucrose, die Werte von 15,8 nm/s zeigten. CARL et
al. (2010) zeigten Mannitol-Permeabilitäten von 24,7 nm/s in hCMEC/D3-Zellen.
Damit sind diese Permeabilitäten im Durchschnitt etwa 10- bis 100-mal niedriger als
die hier beschriebenen Daten (siehe Tabelle 5.4, S. 107). Ein asymmetrischer
Transport von Rhodamin 123 konnte in diesen Zellen trotz der hohen Permeabilitäten
und den vergleichsweise niedrigen TEER-Werten in einzelnen Versuchen der
vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden.
Die Widerstände der Monolayer auf größeren Membran-Inserts (6Well), die für
einen direkten Vergleich mit monokultivierten hCMEC/D3-Zellen untersucht wurden,
fielen niedriger aus (29,6 vs. 119 Ω*cm 2 , Abbildung 5.19 A & B). Dies korrelierte mit
den Ergebnissen der Transport-Assays. Ein asymmetrischer Transport von Digoxin
und Verapamil konnte nicht, der Transport von Rhodamin 123 lediglich in zwei
Versuchen nachgewiesen werden. Ähnlich niedrige TEER-Werte wurden auch den
Untersuchungen von WEKSLER et al. (2005) gemessen. Allerdings muss hier
hinzugefügt werden, dass die Messung der Widerstände für die 12Well-
Membraneinlagen in der vorliegenden Arbeit aufgrund des Formats mit der
Messpinzette vorgenommen wurde (siehe Abschnitt 4.3.2) und diese Werte
154

DISKUSSION
möglicherweise nicht ohne Weiteres mit den Daten der Messkammer verglichen
werden können.
Serum
Eine Verlaufsuntersuchung der TEER-Werte, die über 7 Tage von hCMEC/D3-
Monolayern vorgenommen wurde, zeigte u.a. Unterschiede zwischen den
verwendeten Seren im Kulturmedium. Humanes Serum soll die Integrität der
Zellmonolayer erhöhen. POLLER et al. (2008) zeigten eine Reduktion der
parazellulären Sucrose-Permeabilität um bis zu 39 % (auf ca. 15,8 nm/s), nachdem
hCMEC/D3-Zellen mit ansteigenden Konzentrationen bis zu 10 % humanem Serum
kultiviert wurden. CARL et al. (2010) wiesen nach der Kultivierung dieser Zellen mit
bovinem Serum etwa 1,5-mal höhere Werte für die Mannitol-Permeabilität (24,7
nm/s) nach. Der Transportnachweis für Digoxin wurde aber in den Versuchen, für die
die Zellen mit humanem Serum kultiviert wurden, nicht beeinflusst (Daten nicht
gezeigt). Des Weiteren zeigte die Verlaufsuntersuchung der TEER-Werte keine
Unterschiede zwischen humanem und bovinem Serum (Abbildung 5.13). Im
Vergleich mit dem apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (P app ) für
Mannitol, der für dichte Zellmonolayer 12 nm/s nicht überschreiten sollte (LUNA-
TORTÓS et al. 2008), lag die Sucrose-Permeabilität von POLLER et al. (2008) über
dem genannten Wert. Deshalb sollte die Erhöhung der Dichtigkeit durch
beispielsweise noch höhere Konzentrationen des humanen Serums oder andere
Parameter in den hCMEC/D3-Zellen untersucht werden.
Die Überprüfung der parazellulären Permeabilität wurde in den hier
dargestellten Versuchen mit Mannitol durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit
gemessenen Permeabilitäten für Mannitol und die TEER-Werte für Zellmonolayer auf
6Well-Membraneinlagen wurden von den verschiedenen Seren offensichtlich nicht
beeinflusst. Das bovine Serum zeigte ähnlich hohe Widerstände wie das humane
Serum und wurde deshalb und auch aus Kostengründen für die Kultivierung der
Zellen für Transport-Assays verwendet. Der Transport von Rhodamin 123 konnte in
hCMEC/D3-Zellen v.a. auf Membran-Inserts im 12Well-Format nachgewiesen
werden. Ob für dieses Format ein Einfluss durch humanes Serum nachgewiesen
werden kann, muss geklärt werden.
155

DISKUSSION
Zusammensetzung des Mediums
Für die humanen Zellen wurden ab der Aussaat auf Transwell-Inserts drei
Kulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung (siehe Abschnitt 5.1.4.3 S. 94 f.
und Anhang S. 215) getestet (Wachstumsfaktoren wie VEGF, IGF-1, EGF, ein
reduzierter Serum- und/oder Hydrocortisongehalt) und es konnte kein Einfluss auf
die Integrität der Monolayer und den Transportnachweis in hCMEC/D3-Zellen
nachgewiesen werden. Für den eigentlichen Transportversuch wurde letztlich ein
Puffer verwendet, der sich aus HBSS-Puffer mit 1mM Natriumpyruvat und 10 mM
HEPES zusammensetzte. Dieser wurde u.a. von POLLER et al. (2008) und CARL et
al. (2010) in Transportuntersuchungen mit hCMEC/D3-Zellen verwendet. Mit diesem
Puffer konnte im Gegensatz zum Medium Opti-MEM ® , welches üblicherweise für
Transport-Assays in der hiesigen Arbeitsgruppe verwendet wurde, ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen werden, weshalb der
HBSS-Puffer für weitere Transport-Assays eingesetzt wurde.
Die Zellen wurden 1 Tag vor dem Transportversuch mit 1 nM Simvastatin
inkubiert (Kultivierungsprotokoll für hCMEC/D3-Zellen für Transport-Assays nach P.-
O. Couraud, Stand 2009). Diese Substanz, welche zu den Statinen gehört, soll u.a.
zur Erhöhung des Wachstumsfaktors VEGF und damit zur Integrität der
Zellmonolayer beitragen (PARK et al. 2008). Vergleichende Transportversuche mit
und ohne Simvastatin ließen aber keine Einflüsse durch diese Substanz auf TEER-
Werte und Mannitol-Permeabilitäten in den Transportversuchen mit den Substraten
Digoxin und Rhodamin 123 erkennen.
Methodik
Die hier beschriebenen Transportversuche wurden größtenteils nach der
Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA) durchgeführt. Diese Methode gilt als
sensitiver, um v.a. auch schwache Substrate der MDT wie z.B. Antiepileptika
detektieren zu können (LUNA-TORTÓS et al. 2008). Es konnte ein asymmetrischer
Transport der Substanz Rhodamin 123 festgestellt werden (Abbildung 5.15), der aber
nicht konsistent in allen Versuchen nachweisbar war. Andere Arbeitsgruppen, die
Transportuntersuchungen mit den hCMEC/D3-Zellen durchführten, verwendeten
ausschließlich den bidirektionalen Assay mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 und
bekannten Substraten der Protonen-gekoppelten Oligopeptid-Transporter
(Glycylsarcosin, Carnosin, Histidin und Valacyclovir) (POLLER et al. 2008; CARL et
156

DISKUSSION
al. 2010). Aus diesem Grund wurden mit diesen Zellen ebenfalls bidirektionale
Transportversuche durchgeführt, die aber keinen asymmetrischen Rhodamin-
Transport erkennen ließen und deshalb für weitere Transportuntersuchungen in
hCMEC/D3-Zellen nicht mehr durchgeführt wurden.
6.1.3.2 Die Kokultur mit Astrozyten
Die Kultivierungs- und Versuchsbedingungen wurden in Anlehnung an Quellen
in der Literatur (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010)
gewählt. In zwei von 35 einzelnen Versuchen mit monokultivierten humanen Zellen
konnte ein asymmetrischer Transport des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123
nachgewiesen werden (Abbildung 5.15). Es existieren viele Studien, in denen der
Einfluss der natürlichen Umgebung von Hirnkapillarendothelien untersucht wurde
(DEHOUCK et al. 1990; WOLBURG et al. 1994; CECCHELLI et al. 1999; GAILLARD
et al. 2000; ABBOTT 2002; DEMEUSE et al. 2002; HAWKINS et al. 2002; SCHIERA
et al. 2003; GARCIA et al. 2004; HAYASHI et al. 2004; NAKAGAWA et al. 2007;
WILLIS et al. 2007; HATHERELL et al. 2011). Dabei fiel auf, dass v.a. Astrozyten
einen entscheidenden Einfluss auf die Dichtigkeit und Undurchlässigkeit der
Endothelzellschicht und folglich auch der BHS haben. Die Astrozyten sezernieren
z.B. bestimmte Faktoren, die die Ausbildung der Tight junctions (CECCHELLI et al.
1999) und die Expression von MDT fördern (WILLIS et al. 2007). Mit der Kokultur der
Hirnkapillarendothelzellen und Astrozyten auf kleineren Membranen konnten das
Transwell-Modell und damit die Transportuntersuchungen für die Zelllinie hCMEC/D3
optimiert werden. Die Kokultivierung führte zu einer erneuten Steigerung des TEER-
Werts (Monokultur: 110,7 ± 36,2 Ω*cm 2 , Kokultur: 161,9 ± 3,5 Ω*cm 2 ; siehe Tabelle
5.4) sowie einer niedrigeren Mannitol-Permeabilität (Monokultur: 309,0 ± 115,0 nm/s,
Kokultur: 165,0 ± 37,5 nm/s; siehe Tabelle 5.4). Dies deutete auf dichtere Monolayer
hin. Ähnliche Effekte zeigten CUCULLO et al. (2008), die zumindest eine leichte
Steigerung des TEER durch die Kokultur mit Astrozyten nachwiesen. Die
Transportversuche zur Kokultur der hCMEC/D3-Zellen mit Astrozyten zeigten ein
einheitlicheres Bild, der Transport von Rhodamin 123 konnte festgestellt werden
(Abbildung 5.19 B & C).
157

DISKUSSION
6.1.3.3 Überprüfung eines asymmetrischen Transports
Ein asymmetrischer Transport von 2 µM Rhodamin 123 konnte in hCMEC/D3-
Zellen nachgewiesen werden. Zur Überprüfung, ob es sich um Pgp-spezifischen
Transport handelte, wurden die bekannten Inhibitoren Valspodar (PSC833) und
Tariquidar eingesetzt. Der Rhodamin-Transport konnte aber nur bedingt durch diese
Pgp-Inhibitoren gehemmt werden. In einem einzelnen von insgesamt 8 Versuchen
wurde der Transport vollständig durch Tariquidar inhibiert (Abbildung 5.21 F).
Allerdings waren die Konzentrationsunterschiede zwischen Substrat mit und ohne
Inhibitor sehr gering, weshalb der gemessene asymmetrische Transport von
Rhodamin in diesem Einzelversuch fraglich ist (Abbildung 5.21 E & F).
Untersuchungen von TANG et al. (2004) und FORSTER et al. (2012) zeigten
beispielsweise eine Hemmung des Rhodamin-Transports durch die Pgp-Inhibitoren
GF-120918 bzw. Quinidin in MDCK II-Zellen. YUMOTO et al. (1999) sowie
TROUTMAN & THAKKER (2003) konnten eine Inhibition des Transport von
Rhodamin 123 durch u.a. Quinidin und einen weiteren Pgp-Inhibitor (GW918) in der
Darmzelllinie Caco-2 nachweisen. Ausgehend von diesen Studien sollten weitere
Versuche durchgeführt werden, die auch andere Pgp-Inhibitoren und eventuell
höhere Konzentrationen der bereits untersuchten Inhibitoren berücksichtigen und das
Vermögen, Pgp-spezifischen Transport in hCMEC/D3-Zellen zu inhibieren,
untersuchen.
Die hCMEC/D3-Zellen wurden aus reseziertem epileptischem Hirngewebe
einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin gewonnen. Es wäre denkbar, dass
diese Pharmakoresistenz nicht nur auf die erhöhte Funktionalität bzw. Expression
eines MDT in der BHS zurückzuführen ist. Es könnten mehrere Transporter daran
beteiligt sein, sodass Rhodamin 123 durch einen anderen MDT als Pgp transportiert
wurde und die Resultate der vorliegenden Arbeit eventuell nicht auf einen
spezifischen Transport durch Pgp zurückzuführen sind. Demnach würde eine
Inhibition von Pgp keinen Einfluss auf den Transport nehmen. Andererseits wird
Rhodamin 123 oft als Pgp-Substrat für Kumulationsstudien eingesetzt (EFFERTH et
al. 1989; LEE et al. 1994; WEKSLER et al. 2005; TAI et al. 2009). Zudem berichteten
ROBEY et al. (2001), dass Rhodamin 123 zwar von Mutanten des Transporterproteins
BCRP aber nicht vom ursprünglichen MDT (Wildtyp) transportiert wird.
Die Integrität der Zellmonolayer, die im Rahmen der Transportstudien mit
hCMEC/D3-Zellen genauer betrachtet wurde, wurde durch die Parameter Mannitol-
158

DISKUSSION
Permeabilität und TEER beschrieben. In der Literatur wird beschrieben, dass diese
Parameter korrelieren (LÖSCHER et al. 2011). Werden hohe TEER-Werte
gemessen, zeigen die Permeabilitäten für Mannitol oder andere parazelluläre Marker
niedrige Werte. Insgesamt ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit der
Widerstand nicht immer mit dem Nachweis eines Transports korrelierte. Wenn ein
asymmetrischer Rhodamin-Transport nachgewiesen werden konnte und dazu hohe
TEER-Werte für die Monolayer der hCMEC/D3-Zellen gemessen wurden, waren die
Permeabilitäten für Mannitol oft noch sehr hoch. Dies lässt auf eine unzureichende
Integrität der Monolayer schließen und stellt den gemessenen Transport in Frage.
6.1.3.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in hCMEC/D3-Zellen
Eine Erhöhung des TEER konnte nach Modifikationen bezüglich des Serums,
des Materials und Formats der Membranen sowie der Kokultur mit Astrozyten
erreicht werden, aber die Werte waren immer noch weitaus geringer als
beispielsweise für LLC- und MDCK II-Zellen, die als In-vitro-Modelle der BHS
eingesetzt werden (MAHAR DOAN et al. 2002; GARBERG et al. 2005; BACHMEIER
et al. 2006). Diese Daten waren mit Untersuchungen zu immortalisierten humanen
Hirnkapillarendothelzellen anderer Arbeitsgruppen vergleichbar, die Widerstände im
Bereich von 20 bis 200 Ω*cm 2 zeigten (GRANT et al. 1998; WEKSLER et al. 2005;
HATHERELL et al. 2011). Dennoch könnten die generell niedrig-ohmigen
Widerstände der humanen Zelllinie hCMEC/D3 (WEKSLER et al. 2005; CARL et al.
2010; HATHERELL et al. 2011) ein Problem für die Untersuchung eines Pgpvermittelten
Transports in diesen Zellen darstellen.
Die Mannitol-Permeabilität blieb von den untersuchten Faktoren nahezu
unbeeinflusst, eine Verbesserung trat für monokultivierte hCMEC/D3-Zellen nicht ein.
Die Permeabilitäten für Mannitol lagen je nach Versuch durchschnittlich bei 90,2 ±
35,9 nm/s für 6Well-Membranen und 309,0 ± 115,0 nm/s für 12Well-Membranen,
vereinzelt wurden Werte von 24 nm/s gemessen (siehe Tabelle 5.4). Damit befanden
sich die hier ermittelten niedrigsten Werte im gleichen Bereich wie auch in der
Literatur angegebene Daten zur Überprüfung der parazellulären Permeabilität, z.B.
mit Sucrose 27,5 bzw. 15,8 nm/s oder mit Mannitol 24,7 nm/s (WEKSLER et al.
2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In den meisten Fällen waren diese
Werte aber im Vergleich mit anderen Gruppen höher. Der apparente parazelluläre
Permeabilitäts-Koeffizient (P app ) für Mannitol zeigte von der basolateralen in die
159

DISKUSSION
apikale Kammer (b-A) ausschließlich höhere Werte als 12 nm/s, der in
Transportstudien mit LLC- und MDCK II-Zellen als Grenzwert festgesetzt wurde
(LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009). Deshalb muss man davon ausgehen, dass die
Monolayer während der Versuche nur in unzureichendem Maß dicht waren.
Die Kokultur der humanen Endothelzellen mit Astrozyten trug zu einer
Verbesserung des Transwell-Modells mit hCMEC/D3-Zellen bei. Mit der
Kokultivierung konnte sowohl ein Anstieg des Widerstands der Monolayer als auch
ein leichter Abfall der Mannitol-Permeabilität beobachtet werden. Dies lässt zwar
darauf schließen, dass die Monolayer im Vergleich zu monokultivierten Zellen eine
größere Dichtigkeit aufwiesen. Aber diese Mannitol-Werte für 12Well-
Membraneinlagen waren immer noch höher als für 6Well-Membranen. Der optimale
Bereich wurde nicht gefunden. Dennoch konnte der positive Einfluss der Kokultur mit
Astrozyten in diesen Versuchen bestätigt werden (DEHOUCK et al. 1990;
WOLBURG et al. 1994; ABBOTT 2002; DEMEUSE et al. 2002; HAYASHI et al.
2004; NAKAGAWA et al. 2007; HATHERELL et al. 2011).
Abschließend ist zu sagen, dass sämtliche beschriebenen Transport-Assays
darauf hindeuten, dass die geeigneten Bedingungen für die humanen Zellen in
Transportuntersuchungen nicht gefunden wurden. Anpassungen verschiedener
Parameter wie z.B. Serum, Membranmaterial und –format und Kokultur mit
Astrozyten zeigten kaum Verbesserungen der Parameter für die Integrität der
Zellmonolayer, weshalb hCMEC/D3-Zellen für Transportuntersuchungen im
Transwell-Modell ungeeignet erscheinen. Die hier beschriebenen Versuche
bestätigen also die Aussage, dass immortalisierte Hirnkapillarendothelien für
Transportversuche nicht geeignet sind (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005).
CUCULLO et al. (2008) kamen in vergleichenden Untersuchungen mit hCMEC/D3-
Zellen im humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modell (STANNESS et al. 1996) und
im statischen Transwell-Modells zu einer ähnlichen Konklusion, da transendotheliale
Widerstände für die humanen Zellen im Transwell-Modell von 70 Ω*cm 2 gemessen
wurden. Im dynamischen BHS-Modell, welches die Scherkräfte des Blutstroms an
der BHS nachahmt, zeigten die Zellen TEER-Werte von bis zu 1000 Ω*cm 2 .
Aufgrund der unzureichenden Dichtigkeit der hCMEC/D3-Monolayer wurden
keine Untersuchungen des Transports von Antiepileptika in diesen Zellen
durchgeführt. Möglicherweise wären derartige Studien nach der Etablierung des
humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells möglich.
160

DISKUSSION
6.2 Primäre Hirnkapillarendothelien der Ratte (rBCEC)
Primärkulturen aus Hirnendothelzellen stellen ein vereinfachtes weniger
komplexes Modell der In-vivo-Situation dar, benötigen aber bestimmte technische
Voraussetzungen, und die Präparation und die Kultivierung sind zeitintensiv.
Dennoch stellen sie eine Alternative zu Tierversuchen dar, um Studien der BHS
durchzuführen (CARDOSO et al. 2010). Im Vergleich zum Ursprungsgewebe können
immortalisierte Zellen Veränderungen wie zum Beispiel in der Expression bestimmter
Transporter aufweisen (NICOLAZZO et al. 2006; URICH et al. 2012; C. Luna-Tortós,
unveröffentlichte Daten). Um näher an die in vivo vorliegenden Bedingungen zu
kommen, wurden für die Bearbeitung des Dissertationsthemas Endothelzellen direkt
aus dem Gehirn von Ratten gewonnen und in Kultur gebracht. Primärkulturen
wurden bereits im Transwell-System für Untersuchungen des Transports eingesetzt
(GARBERG et al. 2005; PERRIÈRE et al. 2005; ZHANG et al. 2006). Durch den
Einsatz von Primärkulturen sollte zusätzlich zu der Zelllinie hCMEC/D3 unter
Berücksichtigung von Speziesunterschieden untersucht werden, welche
Antiepileptika in der Lage sind, die Funktion von MDT an der BHS beeinflussen und
ob sie in diesen Zellen Substrate der MDT darstellen.
Die Protokolle zur Präparation und Kultivierung der Primärkulturen sind sehr
verschieden. Daraus ergeben sich beachtliche Variationen z.B. bezüglich der
Reinheit der Endothelzellkultur sowie der Parameter für die Integrität der
Zellmonolayer (parazelluläre Permeabilität, transendothelialer Widerstand) in
Transportstudien (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Die Mikroumgebung
der Zellen verändert sich in der Kultur (CALABRIA et al. 2006), außerdem verlieren
sie ihre typischen Eigenschaften (NAKAGAWA et al. 2009) wie z.B. Phänotyp und
Barriereeigenschaften (BERNAS et al. 2010). Zusätzlich durchlaufen die Zellen
Prozesse der Alterung und Dedifferenzierung (CARDOSO et al. 2010). Aus diesen
Gründen werden Primärzellen nur über wenige Passagen für Versuche eingesetzt
und müssen permanent neu präpariert und in Kultur gebracht werden, was zu
Schwankungen in den Untersuchungsergebnissen führt.
Laut Literatur kann mit den derzeit verwendeten Protokollen zur Gewinnung
primärer Hirnkapillarendothelien und Astrozyten (PERRIÈRE et al. 2005; ZHANG et
al. 2006; VANTELON et al. 2007) eine hohe Reinheit der Kulturen erreicht werden.
Für die Endothelzellen konnte eine solche reine Kultur relativ gut erzielt werden, da
161

DISKUSSION
es nur wenige Verunreinigungen durch andere Zellen oder Infektionen gab. Es
wurden zwei verschiedene Auszucht-Rattenstämme (Wistar und CD ® -IGS, Charles
River, Sulzfeld) verwendet, um einen geeigneten Stamm für die Bearbeitung der
Fragestellung finden zu können. Tatsächlich zeigten die so gewonnenen Zellen eine
unterschiedlich gute Anheftung an Oberflächen der Zellkulturmaterialien sowie
unterschiedlich schnelles Wachstum. Weitere Unterschiede, die z.B. die Effekte
durch Erkrankungen oder Substanzen betreffen, wurden in Tieren bzw. Zellen dieser
beiden Rattenstämme beobachtet (KACEW & FESTING 1996). Es wurde außerdem
beschrieben, dass die Expression des mdr1b-Gens, welches zusammen mit mdr1a
das Pgp in Nagern codiert (SCHINKEL et al. 1995), in Wistar- und Sprague-Dawley-
Ratten (entsprechen den hier verwendeten CD ® -IGS-Ratten von Charles River,
Sulzfeld) unterschiedlich ausgeprägt ist (HILL et al. 1996), was sich auf
Untersuchungen des Pgp-vermittelten Transports auswirken kann.
Ausgehend von einer besseren Anheftung und einem schnelleren Wachstum
schienen die Zellen der CD-Ratten im Vergleich mit Zellen aus Wistar-Ratten besser
geeignet zu sein, um Untersuchungen mit einem geringeren Zeitaufwand und
bezüglich der Ausbeute der Präparationen in einem größeren Umfang durchführen
zu können.
Mit diesen Primärkulturen wurden sowohl Kumulations- als auch
Transportuntersuchungen durchgeführt.
6.2.1 Die Modulation der Pgp-Funktionalität in rBCEC-Zellen
Mit dem Kumulations-Assay, der Aufschluss über einen Transporterinduzierten
Efflux einer Substanz gibt, konnte in den primären Hirnendothelzellen
funktionelles Pgp in Zellen beider Rattenstämme nachgewiesen werden. Die
Expression dieses MDTs wurde im Western Blot bestätigt (Abbildung 5.22). Die
Funktion Pgps wurde durch den Pgp-Induktor Puromycin induziert. Tariquidar (0,5
µM) sowie auch die Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin inhibierten in den
Konzentrationen von 100 µM den Efflux (Abbildung 5.24). Eine Induktion durch
Dexamethason konnte nicht nachgewiesen werden, sehr wohl aber für Puromycin.
Diese Daten stehen in Kontrast zu denen der immortalisierten hCMEC/D3-Zellen,
denn in diesen Zellen führte die Behandlung mit Antiepileptika vorrangig zu einer
Induktion des Efflux von Rhodamin 123 (Abbildung 5.8 & 5.9). Allerdings zeigte
Phenytoin in hCMEC/D3-Zellen in den niedrigeren Konzentrationen (10, 30 und 50
162

DISKUSSION
µM) zumindest Tendenzen zur Inhibition der Funktionalität (Abbildung 5.8 C). In einer
Studie mit den immortalisierten Rattenhirnendothelien RBE4- und GPNT-Zellen
wurde eine Induktion der Pgp-Expression durch die Antiepileptika Carbamazepin,
Phenobarbital und Phenytoin nachgewiesen (LOMBARDO et al. 2008). Diese
induzierende Wirkung wurde über die Rezeptoren PXR und CAR vermittelt. Eine
Erhöhung der Pgp-Expression muss sich nicht zwangsläufig auf die Funktionalität
auswirken, dennoch ist diese Korrelation sehr wahrscheinlich. Nach der Behandlung
mit den Antiepileptika Carbamazepin (10 und 50 µM) und Topiramat (100 µM)
wurden induzierende Effekte auf die Funktionalität in RBE4-Zellen nachgewiesen
(NEUMANN 2010, Diplomarbeit), obwohl AMBROZIAK et al. (2010) in RBE4-Zellen
keine oder nur eine sehr niedrige Expression von PXR und CAR nachgewiesen
haben. Wenn in den rBCEC-Zellen diese ONRs nicht oder nur geringfügig exprimiert
wurden, würde dies zumindest erklären, warum die Antiepileptika Carbamazepin und
Phenytoin die Funktionalität Pgps nicht induzierten. Andererseits wurden in
Untersuchungen an Kapillaren des Rattenhirnendothels PXR und CAR
nachgewiesen (MILLER et al. 2010), sodass in den in dieser Arbeit eingesetzten
Primärkulturen diese Rezeptoren auch nachweisbar und die Vermittlung von
Induktionen auf diese Weise möglich sein sollte.
Neben Antiepileptika wurde u.a. auch für bekannte Pgp-Induktoren wie z.B.
Dexamethason und Rifampicin eine Pgp-Induktion über PXR beschrieben (NARANG
et al. 2008; ZHOU et al. 2008). Für Puromycin ist diese rezeptor-vermittelte Induktion
nicht bekannt. Ausgehend von der induzierenden Wirkung auf die Pgp-Funktionalität
in rBCEC-Zellen (Abbildung 5.23 & 5.24) wäre zu vermuten, dass dieser Effekt auch
über ONRs gesteuert wurde. Warum die Antiepileptika Carbamazepin und Phenytoin
den Rhodamin-Efflux inhibierten, ist unklar. Laut XU et al. (2005) und CHEN (2010)
ist die Expression der ONRs in einzelnen Geweben und Zellen sehr verschieden.
Denkbar wäre, dass in den präparierten rBCEC-Zellen Rezeptoren wie PXR und
CAR nur im geringen Ausmaß exprimiert sind und Induktionen über diese Prozesse
nicht vermittelt wurden, was wiederum die ausbleibende Induktion durch
Dexamethason (10 µM) erklären würde. Das Kulturmedium der rBCEC-Zellen
enthielt 0,5 µM Hydrocortison. Diese Substanz wirkt induzierend auf die Pgp-
Funktionalität (MAINES et al. 2005). Deshalb wäre es ebenso möglich, dass eine
Induktion durch Dexamethason aufgrund einer bereits erhöhten Funktion des Efflux-
Transporters nicht nachgewiesen werden konnte.
163

DISKUSSION
Die für Carbamazepin und Phenytoin verwendete Konzentration von 100 µM
liegt außerhalb der beim Menschen therapeutischen Plasmakonzentrationen von 17-
51 µM für Carbamazepin und 40-79 µM für Phenytoin (PATSALOS et al. 2008; siehe
Tabelle 5.1). Die primären Zellen zeigten während der Behandlung mit den
Antiepileptika zwar keine offensichtlichen toxischen Effekte wie beispielsweise
Zellablösungen. Dennoch könnte es möglich sein, dass die Zellen nicht mehr in der
Lage waren, mit dieser erhöhten Konzentration umzugehen, und es sich bei den
durch Carbamazepin und Phenytoin hervorgerufenen Inhibitionen um
zellschädigende Auswirkungen handelte. Allerdings berichteten WEISS et al. (2003)
nach der Behandlung mit Valproat (> 100 µM) und Phenytoin (> 100 µM) in LLC-
Zellen ebenfalls von inhibitorischen Effekten. Aufgrund der Effekte auf den Efflux von
Rhodamin durch Induktoren und Inhibitoren kann man aber davon ausgehen, dass in
den Primärendothelzellen der Ratte funktionelles Pgp vorhanden ist. Mögliche
toxische Effekte für die Primärzellen durch die Behandlung mit Antiepileptika sollten
dennoch in Zytotoxizitäts-Assays untersucht werden.
Die Zellen beider Rattenstämme zeigten bezüglich des Grundtransports von
Rhodamin 123 ein unterschiedliches Ausmaß (Abbildung 5.23 & 5.24), das aber nicht
reproduzierbar war. Für Primärkulturen ist bekannt, dass Schwankungen vieler
Parameter in Abhängigkeit von den Zellchargen durch Präparation und Reinheit der
Kultur auftreten können (ZHANG et al. 2006). Beide zeigten aber die gleichen
modulatorischen Effekte nach der Behandlung mit den genannten Substanzen.
Carbamazepin bildete eine Ausnahme, da es nur in Hirnendothelzellen der Wistar-
Ratten getestet wurde. Die inhibitorischen Effekte durch die Antiepileptika
Carbamazepin und Phenytoin bedürfen weiterer Experimente und zusätzlicher
niedrigerer Konzentrationen, um die Wirkung von Antiepileptika in den Primärkulturen
abzuklären.
Abgesehen von der schnelleren Anheftung an Zellkulturmaterialien und dem
Wachstum der Endothelzellen der CD-Ratten zeigten die Zellen in
Kumulationsversuchen keine Vorteile gegenüber Zellen aus Wistar-Ratten. Die
Primärkulturen beider Rattenstämme können aufgrund vergleichbarer Uptake-
Ergebnisse für die Untersuchungen der Funktionalität eingesetzt werden. Für weitere
Versuche zur Modulation der Pgp-Funktionalität durch Antiepileptika sollten die
primären Rattenhirnendothelzellen ohne Hydrocortison kultiviert werden.
164

DISKUSSION
6.2.2 Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen
6.2.2.1 Versuchsbedingungen
Für die Untersuchung des Transports wurden zwei verschiedene
Rattenstämme, unterschiedliche Pgp-Substrate und Membraneinlagen (Firmen
Corning und Greiner) verwendet. Die gewonnenen Hirnzellen wurden nicht
immortalisiert, sodass sie nur über einen kurzen Zeitraum für Experimente
verwendbar waren und regelmäßig frische Zellen präpariert werden mussten. Dieser
Fakt kann konstante Kultivierungsbedingungen erschweren, da die Anheftung, das
Wachstum der Zellen sowie weitere Einflussfaktoren chargenabhängig sein können
(CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). So könnten die variablen Ergebnisse
der Transport-Assays erklärt werden.
Einer der größten Nachteile des Transwell-Modells ist, dass die bislang
eingesetzten immortalisierten Zelllinien aus Endothelien der BHS aufgrund der
suboptimalen Expression und Ausbildung der Tight junctions eine relativ hohe
parazelluläre Permeabilität zeigen (LIU et al. 2008). Für Transportversuche ist aber
die Ausbildung der Tight junctions, die zusammen mit anderen Faktoren zu hohen
transendothelialen Widerständen führen, unerlässlich. Es wird beschrieben, dass der
TEER-Wert nach Zugabe von cAMP und Ro 20-1724 ansteigt (RUBIN et al. 1991).
Beide Substanzen haben Einfluss auf die Struktur und Funktion bestimmter Tightjunction-Proteine
und damit auf die Dichtigkeit eines Zellverbands. Die primären
Rattenhirnzellen wurden 24 h vor jedem Transportversuch mit diesen beiden
Substanzen inkubiert, um die Ausbildung der Tight junctions zwischen den Zellen zu
verbessern. Im Vergleich mit den humanen Zellen wurden höhere TEER-Werte
gemessen, dennoch war die Mannitol-Permeabilität immer noch sehr hoch (siehe
Tabelle 5.6). FRANKE et al. (1999 & 2000) wiesen in primären Hirnendothelzellen
des Schweines Mannitol-Permeabilitäten von 17-18 nm/s nach. Deshalb muss man
davon ausgehen, dass die Monolayer der primären Rattenhirnendothelzellen nicht
ausreichend dicht waren. Es wurden keine Transportversuche durchgeführt, ohne
dass die Primärkulturen vorher cAMP und Ro 20-1724 erhielten. Es können also
keine Aussagen darüber getroffen werden, ob diese Substanzen in den hier
beschriebenen Experimenten einen großen Einfluss hatten oder ob die
Primärkulturen auch ohne den Einsatz von cAMP und Ro 20-1724 dichtere
Zellmonolayer ausbilden. Des Weiteren wird dem Kulturmedium der rBCEC-Zellen
165

DISKUSSION
stets Hydrocortison zugefügt (siehe Mediumszusammensetzung S. 45), welches zur
Ausbildung von Tight junctions beiträgt (FÖRSTER et al. 2008) und damit ebenfalls
die Integrität der Monolayer fördert.
In der Literatur werden beispielsweise für primäre Hirnkapillarendothelzellen
der Ratte TEER-Werte bis zu 500 Ω*cm 2 beschrieben (PERRIÈRE et al. 2005). Die
hier gemessenen Werte der Hirnkapillarendothelzellen aus Ratten lagen mit einem
durchschnittlichen Widerstand von 168,1 Ω*cm 2 (auch in Kokultur mit Astrozyten)
weit unter diesem Wert. Die optimalen Bedingungen für die Erhöhung des TEER-
Werts und folglich der Integrität müssen also noch gefunden werden.
Wie die hCMEC/D3-Zellen zeigten die Primärkulturen ebenfalls sehr
unterschiedliche Ergebnisse nach Transport-Assays mit den Pgp-Substraten
Rhodamin 123, Digoxin und Verapamil (Abbildung 5.25). Ein asymmetrischer
Transport des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 war in primären Zellen beider
Rattenstämme nachweisbar (Abbildung 5.25, 5.27 & 5.28). Der Transport von
Digoxin und Verapamil konnte nicht detektiert werden. Es fiel aber auf, dass die
Rattenhirnendothelien im Gegensatz zu hCMEC/D3 auf Transwell-Inserts von
Greiner einen höheren Widerstand und auch niedrigere Mannitol-Permeabilitäten
zeigten, was auf eine bessere Integrität der Zellmonolayer schließen ließ. Dies hatte
aber keinen Einfluss auf den Nachweis eines Transports (Abbildung 5.28). Generell
zeigten die primären Rattenzellen höhere TEER-Werte als die humanen
immortalisierten Zellen. Bezüglich der Mannitol-Permeabilität ist zu sagen, dass für
die Primärkulturen aus der Ratte höhere Werte als für die humanen Zellen gemessen
wurden. Damit besteht möglicherweise das gleiche Problem wie für die hCMEC/D3-
Zellen. Eine zu hohe parazelluläre Permeabilität könnte einen Pgp-vermittelten
Transport überdeckt haben.
6.2.2.2 Die Kokultur mit Astrozyten
Es wurde bereits für die immortalisierten humanen Hirnendothelien
hCMEC/D3 beschrieben, dass die Kokultur von Endothelien mit Astrozyten die
Membraneigenschaften wesentlich beeinflussen und verbesserte Bedingungen für
Transportversuche schaffen kann (HATHERELL et al. 2011; siehe Abschnitt 5.1.4.7
S. 100 ff.). Für primäre Zellen des Hirnkapillarendothels konnte dies ebenfalls
nachgewiesen werden (CECCHELLI et al. 2007; NAKAGAWA et al. 2007). In
einzelnen Versuchen mit den rBCEC-Zellen konnten höhere TEER-Werte und
166

DISKUSSION
niedrigere Mannitol-Permeabilitäten gemessen werden, die auf eine Erhöhung der
Dichtigkeit schließen lassen. Diese Ergebnisse waren aber nicht für alle Kokultur-
Versuche in gleichem Ausmaß reproduzierbar. Die Rhodamin-Konzentrationen der
apikalen und der basolateralen Kammer waren signifikant verschieden, zeigten
oftmals kaum einen apikalen Anstieg oder Schwankungen der Substrat-
Konzentration, wobei keine Unterschiede zwischen Rattenstamm oder
Membranmaterial zu erkennen waren (Abbildung 5.28 & 5.29).
Positive Effekte der Kokultur von Endothelzellen der Ratte oder der Maus mit
Astrozyten auf TEER-Werte und parazelluläre Permeabilitäten wurden in
Untersuchungen von DELI et al. (2003) und HUTAMEKALIN et al. (2008) berichtet.
In diesen Studien wurden u.a. TEER-Werte von 307 ± 3,2 Ω*cm 2 bzw. maximal 600
Ω*cm 2 und niedrige Permeabilitäten von beispielsweise Albumin von 1,88 ± 0,1 nm/s
gemessen. Trotz der Kokultur der primären Rattenhirnendothelien mit Astrozyten
konnte kein asymmetrischer Transport von Digoxin beobachtet werden. Ein
asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 konnte aber sehr wohl nachgewiesen
werden. Allerdings war keiner der eingesetzten Inhibitoren (Valspodar und
Tariquidar) in den gewählten Konzentrationen in der Lage, den Transport von
Rhodamin 123 vollständig und wiederholbar zu hemmen (Abbildung 5.29). Folglich
ist davon auszugehen, dass entweder höhere Konzentrationen nötig sind oder aber
der Rhodamin-Transport nicht durch den MDT Pgp verursacht wurde. Vermutungen
zufolge, könnte der Transporter BCRP am Transport beteiligt sein. ROBEY et al.
(2001) und Studien der hiesigen Arbeitsgruppe (K. Römermann, unveröffentlichte
Daten) widerlegten aber diese Annahme.
In der Kokultur der Endothelzellen (rBCEC oder hCMEC/D3) mit Astrozyten
wurden beide Zelltypen mit dem jeweiligen Medium oder aber auch nur mit dem
Medium für die Endothelien kultiviert. Unterschiede im Wachstumsverhalten und der
Morphologie waren nicht zu erkennen. Im Medium der Endothelzellen war immer der
Wachstumsfaktor bFGF und Hydrocortison enthalten (siehe
Mediumszusammensetzung für hCMEC/D3 und rBCEC S. 41 und 45). In früheren
Arbeiten dieser Arbeitsgruppe wurde untersucht, ob diese Faktoren einen Einfluss
auf das Wachstum der Astrozyten haben können. Die Expression von Vimentin, ein
Marker für mesenchymale Zellen und auch unausgereifte Astrozyten (LIN &
GOLDMAN 2009), erhöhte sich nach der Zugabe von bFGF (C. Luna-Tortós,
unveröffentlichte Daten). Für Hydrocortison konnte kein Effekt auf Vimentin oder auf
167

DISKUSSION
das Intermediärfilament Saures Gliafaserprotein (englisch glial fibrillary acidic protein,
GFAP), ein spezifischer Marker für die Differenzierung von Astrozyten (REUSS et al.
2003), festgestellt werden. Die Expression von Vimentin oder GFAP wurde in dieser
Arbeit nicht untersucht, und bFGF war im Medium zur Kokultivierung der
Endothelzellen und Astrozyten enthalten. Für weitere Untersuchungen des
Transwell-Modells sollten diese Faktoren berücksichtigt werden.
THANABALASUNDARAM et al. (2010) untersuchten die Kokultur von
primären porcinen Hirnendothelzellen mit Perizyten im Transwell-Modell und wiesen
sogar einen Abfall des Widerstands und einen Anstieg der Sucrose-Permeabilität
nach, was auf undichte Monolayer schließen lässt. Dies konnte aber durch das
Entfernen des Wachstumsfaktors VEGF wieder aufgehoben und eine Steigerung des
TEER erzielt werden. Ähnliche Effekte für VEGF wurden bereits von NITZ et al.
(2003) beschrieben. VEGF wird von den Perizyten sezerniert
(THANABALASUNDARAM et al. 2010) und stellt einen wichtigen Einflussfaktor der
Integrität der BHS dar (ARGAW et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit war für die
Primärkulturen kein VEGF im Medium enthalten. Untersuchungen zu
inflammatorischen Erkrankungen des ZNS wiesen aber nach, dass humane
Astrozyten VEGF sezernieren können (ARGAW et al. 2012). Möglicherweise wurde
dieser Wachstumsfaktor auch von Astrozyten in den hier beschriebenen Kokultur-
Versuchen abgegeben, was erklären würde, warum der Widerstand der Monolayer
durch die Kokultur in dieser Arbeit nicht weiter gesteigert werden konnte.
6.2.2.3 Primärkulturen des Hirnkapillarendothels anderer Spezies
Mit den derzeit verfügbaren In-vitro-Modellen der BHS kann die
Mikroumgebung dieser Barriere relativ gut nachgeahmt werden und eine Reihe an
Eigenschaften und Funktionen untersucht werden (ASCHNER et al. 2006).
Versuche, menschliches Hirngewebe für BHS-Modelle einzusetzen (BERNAS et al.
2010), werden durch eher geringe Verfügbarkeit dieses Gewebes erschwert. Im
Gegensatz dazu kann Hirngewebe des Schweines und des Rindes relativ einfach
gewonnen werden (CECCHELLI et al. 2007; CARDOSO et al. 2010), und viele
Untersuchungen werden an diesen (ZHANG et al. 2006; ZHANG et al. 2009a) und
weiteren Spezies wie Maus und Ratte (COISNE et al. 2005; PERRIÈRE et al. 2007)
durchgeführt. Möglicherweise wären Primärkulturen des Hirnendothels anderer
Spezies als der Ratte eher für das Transwell-Modell geeignet. GARBERG et al.
168

DISKUSSION
(2005) berichteten beispielsweise, dass die Unterschiede des Transports durch Pgp
in primären und immortalisierten Hirnkapillarendothelzellen verschiedener Spezies
sehr groß sind. Des Weiteren ist es schwierig, ausreichend reine Kulturen an
primären Hirnkapillarendothelien der Ratte mit hohen TEER-Werten zu gewinnen
(LECHARDEUR & SCHERMAN 1995; HURST & FRITZ 1996; ABBOTT et al. 1997;
REINHARDT & GLOOR 1997). Zudem wiesen NITZ et al. (2003) in
Hirnkapillarendothelzellen des Schweines Widerstände von bis zu 1800 Ω*cm 2 nach.
FRANKE et al. (2000) konnten nach Messungen des transendothelialen Widerstands
in den gleichen Zellen immerhin Werte von bis zu 700 Ω*cm 2 feststellen. Für
Primärkulturen des Hirnkapillarendothels des Rindes wurden allerdings
vergleichsweise niedrige TEER-Werte von etwa 70 Ω*cm 2 (LEE et al. 2004) bzw. 130
Ω*cm 2 gemessen (GAILLARD & DE BOER 2000), sodass BHS-Modelle mit bovinen
Zellen möglicherweise eher ungeeignet sind. WOLBURG et al. (1994) wiesen aber
für primäre Zellen bovinen Ursprungs teils höhere Widerstände nach, die Werte bis
800 Ω*cm 2 erreichten. Unabhängig von der Wahl der Spezies dürfen für die
Interpretation der Ergebnisse und die Translation von In-vitro-Daten auf die In-vivo-
Situation mögliche Speziesunterschiede nicht außer Acht gelassen werden
(CECCHELLI et al. 2007; CARDOSO et al. 2010).
6.2.2.4 Zusammenfassung der Transportuntersuchungen in rBCEC-Zellen
In einem einzelnen Versuch wurde der Transport des Antiepileptikums
Phenytoin untersucht (Daten nicht gezeigt). Es war kein signifikanter Transport zu
erkennen, obgleich Phenytoin als Pgp-Substrat gilt (LUNA-TORTÓS et al. 2008).
Dies macht deutlich, dass zur Untersuchung des Transports von Antiepileptika in
Primärkulturen des Rattenhirnendothels im Transwell-Modell die Bedingungen weiter
optimiert werden müssen. Dennoch mussten für diese Zellen im Vergleich zu den
immortalisierten humanen Hirnkapillarendothelzellen weniger Parameter verändert
werden, um einen Transport detektieren zu können. Die Primärkulturen des
Rattenhirnendothels zeigten von Beginn an höhere TEER-Werte (6Well: 97,5 ± 24,8
Ω*cm 2 ; 12Well: 168,1 ± 37,6 Ω*cm 2 ) als die hCMEC/D3-Zellen (6Well: 31,9 ± 12,8
Ω*cm 2 ; 12Well: 138,6 ± 35,4 Ω*cm 2 ) (siehe Tabelle 5.4 & 5.6). Die höheren TEER-
Werte der rBCEC-Zellen könnten auf eine generell bessere Eignung der primären
Zellen für das Transwell-Modell hinweisen, wie es auch von anderen Arbeitsgruppen
beschrieben wurde (FRANKE et al. 2000; GARBERG et al. 2005; PERRIÈRE et al.
169

DISKUSSION
2005; ZHANG et al. 2006). Allerdings wiesen PERRIÈRE et al. (2005) für primäre
Rattenhirnendothelien TEER-Werte von bis zu 500 Ω*cm 2 nach, sodass die in dieser
Arbeit gemessenen Widerstände auf eine geringere Dichtigkeit der Monolayer
hindeuten. Die vergleichsweise hohe Mannitol-Permeabilität bei den Primärzellen der
Ratte (6Well: 90,9 ± 5,6 nm/s; 12Well: 239,2 ± 72,0 nm/s), die für porcine
Primärendothelien des Gehirns bei 17-18 nm/s lagen (FRANKE et al. 1999 & 2000),
bestätigten die Vermutung der unzureichenden Integrität der Monolayer. Die in den
beschriebenen Versuchen gemessenen hohen Mannitol-Permeabilitäten zeigten
ähnlich hohe Werte wie für die immortalisierten humanen hCMEC/D3-Zellen
(unabhängig vom Membran-Hersteller; 6Well: 90,2 ± 35,9 nm/s; 12Well: 230,4 ±
109,2 nm/s). Wie auch für die humanen Zellen hCMEC/D3 konnte in den
Rattenzellen nur ein asymmetrischer Transport von Rhodamin 123 nachgewiesen
werden, der aber nicht vollständig bzw. wiederholbar durch die Pgp-Inhibitoren
Tariquidar und Valspodar gehemmt wurde. Der Transport scheint fragwürdig, sodass
der Transport von Antiepileptika unter diesen Bedingungen nicht weiter untersucht
wurde.
Eine Korrelation von TEER und Mannitol-Permeabilität wurde nicht
festgestellt. Dies könnte mit der Kultivierungsdauer der Zellen zusammenhängen.
Die rBCEC-Zellen befanden sich zu Zeitpunkt des Transportversuchs i.d.R. 8-11
Tage auf den Membranen, was etwa dem 6.-9. Tag nach Erreichen der Konfluenz
entsprach. Möglicherweise würde eine längere Kultivierung der primären Zellen die
Parameter für die Integrität verbessern, sodass eventuell auch Transportstudien mit
Antiepileptika durchgeführt werden können.
Abschließend ist zu sagen, dass die Primärkulturen aus dem
Hirnkapillarendothel der Ratte nach den hier vorliegenden Daten als In-vitro-Modell
der BHS eher ungeeignet sind. Unter den vorliegenden Bedingungen konnte kein
Pgp-vermittelter Transport nachgewiesen werden, der reproduzierbar inhibiert wurde.
Für diese Zellen muss die Kultivierung auf Membran-Inserts und das Protokoll für die
Transport-Assays optimiert werden, um eine Verbesserung des Transwell-Systems
zu erzielen und weitere Substanzen auf ihren Transport durch Pgp untersuchen zu
können.
170

DISKUSSION
6.3 Schlussbetrachtung
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass bekannte Pgp-Induktoren und Antiepileptika
in primären und immortalisierten Zelllinien unterschiedliche Effekte auf Pgp haben.
Eine Erklärung dafür könnten verschiedene Mechanismen sein, die zu einer
Induktion des MDT führen. Eine Möglichkeit ist die Induktion über nukleare
Rezeptoren wie PXR und CAR (BAUER et al. 2004; AMBROZIAK et al. 2010). Es ist
noch nicht für alle Antiepileptika belegt, ob ihre Wirkung über diese Rezeptoren
vermittelt wird. Für Carbamazepin wurde allerdings in In-vitro- und In-vivo-Versuchen
bewiesen, dass es über die Stimulation von PXR zur Induktion von Pgp führt
(GIESSMANN et al. 2004; OWEN et al. 2006). Phenobarbital und Phenytoin führen
ebenfalls zu einer Aktivierung der Rezeptoren PXR bzw. CAR (LUO et al. 2002,
KODAMA et al. 2006; KÖHLE & BOCK 2009). Laut MILLER et al. (2010) weisen
Hirnkapillarendothelzelllinien der Spezies Maus, Ratte, Schwein und Mensch PXR
und CAR auf. Aber in Abhängigkeit der Spezies und eventuell auch der
Immortalisierung werden sie nicht immer im gleichen Ausmaß exprimiert (XU et al.
2005; CHEN 2010). Zum Beispiel konnte in GPNT-und RBE4-Zellen keiner dieser
Rezeptoren nachgewiesen werden (AMBROZIAK et al. 2010). In GPNT-Zellen führte
keines der untersuchten Antiepileptika zu einer Induktion. Dies passt zu der
Aussage, dass in diesen Zellen die ONRs PXR und CAR nicht exprimiert werden. In
RBE4-Zellen hingegen führten die Antiepileptika Carbamazepin (10 und 50 µM) und
Topiramat (100 µM) aber zu einer Induktion der Funktionalität (Abbildung 5.12 B;
NEUMANN 2010, Diplomarbeit). Folglich sind andere Mechanismen denkbar, die
hier eine Induktion hervorgerufen haben. In hCMEC/D3-Zellen wurde die Expression
der genannten Rezeptoren nachgewiesen, allerdings waren diese herunterreguliert
(DAUCHY et al. 2009). Letztlich ist aber festzuhalten, dass Carbamazepin und
Valproat die Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen induzierten.
In den rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin in relativ hohen
Konzentrationen zu einer Inhibition der Pgp-Funktion. Dies sind aber nur vorläufige
Ergebnisse. Weitere Versuche sind deshalb notwendig, um mögliche Induktionen der
Pgp-Funktionalität in primären Hirnendothelzellen der Ratte durch Antiepileptika zu
untersuchen. Weitere Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse in den
immortalisierten und primären Zelllinien können in den verschiedenen Spezies, aus
denen die Zellen stammen, begründet sein. BALTES et al. (2007a) zeigten
171

DISKUSSION
beispielsweise, dass sich humanes Pgp und Maus-Pgp im Transport von
Antiepileptika unterscheiden. Der Immortalisierungsprozess könnte sich ebenfalls auf
die Funktion der Transporterproteine auswirken. Aufgrund dessen ist es sinnvoll,
diese Unterschiede genauer zu untersuchen.
In den Transportuntersuchungen mit hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen konnte
weder ein Pgp-vermittelter Transport von Digoxin noch von Verapamil nachgewiesen
werden. Es war aber möglich, einen asymmetrischen Rhodamin-Transport auf
12Well-Membraneinlagen sowohl in monokultivierten und kokultivierten Zellen beider
Spezies zu zeigen. Dieser Transport wurde aber nicht vollständig durch die
spezifischen Pgp-Inhibitoren Tariquidar und Valspodar gehemmt werden. Die
Zelllinie und die Primärkulturen sind also nicht ohne Weiteres als In-vitro-Modell der
BHS einsetzbar.
In dem humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modell (STANNESS et al. 1996)
wurden die in dieser Arbeit verwendete Zelllinie für Transportuntersuchungen bereits
erfolgreich eingesetzt (JANIGRO et al. 1999; CUCULLO et al. 2002, 2007 & 2008),
denn die Nachstellung der Scherkräfte des Blutstroms fördert die Ausbildung der
charakteristischen Eigenschaften der BHS. Damit wird eine höhere Integrität der
Zellen erreicht. Wenn das humane dynamischen In-vitro-BHS-Modell mit den hier
beschriebenen Zellen gezielte Untersuchungen des Transports von Antiepileptika
durch MDT ermöglicht, könnten die daraus gewonnenen Kenntnisse, ob
Antiepileptika in therapeutischen Konzentrationen von MDT transportiert werden,
eine gezieltere und effektivere Epilepsiebehandlung ermöglichen.
172

ZUSAMMENFASSUNG
ZUSAMMENFASSUNG
Dana Alms
Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug-
Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und deren
Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke verschiedener
Spezies
Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge etwa 50 Millionen Menschen
(DUNCAN et al. 2006), weshalb eine wirksame Behandlung von großem Interesse
ist. Die Patienten werden vorrangig mit Antiepileptika therapiert. Diese Medikamente
zeigen aber bei etwa einem Drittel der Patienten nur eine unzureichende oder gar
keine Wirkung (KWAN & BRODIE 2000). Es ist bis heute unklar, wodurch das
Phänomen der Pharmakoresistenz ausgelöst wird. Ein viel diskutierter Ansatz ist die
Multidrug-Transporter-Hypothese. Dieser zufolge führt eine Überexpression
sogenannter Multidrug-Transporter (MDT) an der Bluthirnschranke (BHS) zu einem
vermehrten Efflux der Antiepileptika zurück ins Blut, weshalb nur unzureichende
Konzentrationen im epileptischen Fokus erreicht werden. Erste Zusammenhänge
zwischen einer Hochregulierung solcher Transporter und der Pharmakoresistenz
zeigten die Studien von TISHLER et al. (1995), die den gut untersuchten Transporter
P-Glykoprotein (Pgp) in epileptischem Hirngewebe nachwiesen. Des Weiteren
erbrachten Studien den Nachweis, dass Pgp eine Reihe der therapeutisch
eingesetzten Antiepileptika transportiert (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009),
wodurch niedrige Konzentrationen im Gehirn ebenfalls zu erklären sind. Dieser
Transport wurde bisher nur für Phenytoin in Kapillarendothelzellen humanen
Ursprungs untersucht (CUCULLO et al. 2007), weshalb in der vorliegenden Arbeit die
immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-Modell eingesetzt wurde. Mit
dieser Zelllinie sollte geklärt werden, ob der Transport von Antiepileptika durch Pgp
nachgewiesen werden kann. Immortalisierte Endothelzellen gelten allerdings
aufgrund einer unzureichenden Integrität der Zellmonolayer als ungeeignet für
Transportstudien (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005). Aus diesem Grund
wurden zusätzlich Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte präpariert.
173

ZUSAMMENFASSUNG
Diese wurden im Transwell-Modell eingesetzt, um deren Eignung und Pgpspezifischen
Transport untersuchen zu können.
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der MDT-Hypothese, der damit
verbundenen Überexpression der MDT sowie der Etablierung einer humanen
Zelllinie als Transwell-Modell. Von besonderem Interesse war dabei das Pgp. Es ist
nicht hinreichend geklärt, wodurch eine verstärkte Funktion dieser Transporter bei
epileptischen Patienten ausgelöst wird. Ziel der Untersuchungen war es
herauszufinden, ob Antiepileptika die Funktionalität von Pgp induzieren. Dazu wurde
die humane Zelllinie hCMEC/D3 ausgewählt. Bei hCMEC/D3-Zellen handelt es sich
um immortalisierte Endothelzellen aus dem Temporallappen einer
pharmakoresistenten Epilepsiepatientin (WEKSLER et al. 2005). Die hCMEC/D3-
Zellen exprimieren für Endothelien typische Marker-proteine und werden für In-vitro-
Untersuchungen eingesetzt (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al.
2010). In vorläufigen Studien wurden auch primäre Hirnkapillarendothelzellen der
Ratte eingesetzt.
Der Western Blot ermöglichte den Nachweis von Pgp sowohl in den
immortalisierten hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen als auch in den primären
Hirnendothelien der Ratte. Die funktionelle Untersuchung wurde mit Hilfe von
Kumulations-Assays mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 durchgeführt. Dazu
wurden hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen mit den Antiepileptika Carbamazepin,
Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat behandelt. In den
Primärkulturen wurden Carbamazepin und Phenytoin untersucht. Die Behandlung
erstreckte sich i.d.R. über drei Tage. Im Kumulations-Assay konnte für alle Zelllinien
und den primären rBCEC-Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden, dessen
Funktion durch bekannte Induktoren und den spezifischen Inhibitor Tariquidar
moduliert werden konnte. Dabei zeigten die hCMEC/D3-Zellen funktionelles Pgp,
welches sich trotz vergleichsweise geringer Expression nur schwer induzieren ließ.
Die Ergebnisse der Kumulations-Assays variierten in den Zellen der verschiedenen
Spezies. Die Funktionalität von Pgp wurde nicht von allen Antiepileptika in den
gewählten Konzentrationen beeinflusst. Das heißt, dass die getesteten Antiepileptika
nicht in allen Zellen induzierende Wirkungen hatten. Die robustesten Effekte in
hCMEC/D3-Zellen ließen sich mit Carbamazepin (100 µM) und Valproat (300 µM)
zeigen. In RBE4-Zellen induzierte Carbamazepin (50 µM) die Funktionalität Pgps. In
den Versuchen mit rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin zu einer
174

ZUSAMMENFASSUNG
Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch
bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit
Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere
Konzentrationen der Antiepileptika untersucht werden, um mögliche
konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser
Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp
vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen,
konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden.
Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse
sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und
Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben
(CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer
Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des
Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen
werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell-
Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol-
Permeabilitäten zeigte. Demzufolge führte die Kokultur dieser Gliazellen mit den
Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der
Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur
teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die
relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass
die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der
immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der
Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des
humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et
al. 2002) könnten dazu beitragen, gezielte In-vitro-Untersuchung des Transports von
Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen.
175

SUMMARY
SUMMARY
Dana Alms
Induction of multidrug transporters by antiepileptic drugs and known inducers
and their transport in brain capillary endothelial cells of the blood-brain barrier
of different species
Approximately 50 million peoples are affected by epilepsies (DUNCAN et al.
2006) and efficient therapies are of great interest. In most cases patients are treated
with antiepileptic drugs (AEDs). But one third of the epileptic patients is not seizurefree
under the AED treatment (KWAN & BRODIE 2000). Reasons for the
phenomenon of pharmacoresistance are until now not fully understood. According to
the multidrug transporter hypothesis, one explanation for pharmacoresistance, an
overexpression of multidrug-resistance transporters (MDTs) at the blood-brain barrier
(BBB) leads to an increased efflux of AEDs back to the blood and consequently
inadequate concentrations in the epileptic focus. TISHLER et al. (1995) first
described correlations between overexpression of multidrug-resistance transporter
proteins and pharmacoresistance by detection of the well investigated MDT P-
glycoprotein (Pgp) in epileptic tissue. Furthermore, studies provided evidence that
several AEDs are transported by Pgp in therapeutic concentrations (LUNA-TORTÓS
et al. 2008 und 2009). This would explain low brain concentration of these
substances. So far, only the antiepileptic drug phenytoin was investigated regarding
the transport by Pgp in human brain capillary endothelial cells (CUCULLO et al.
2007).
One object of the thesis was the investigation of the immortalized human brain
endothelial cell line hCMEC/D3 as an in vitro model of the BBB and the transport of
AEDs by Pgp in cells of human origin. But because of an insufficient tightness of the
cell monolayers, immortalized brain endothelial cells are considered to be not
suitable for transport studies (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005).
Therefore, primary rat brain endothelial cells were dissected and utilized for transport
assays to detect Pgp-specific transport.
The thesis dealt with the MDT hypothesis, the associated overexpression of
MDTs and the establishment of a human cell line in a transwell model. The initial
176

SUMMARY
cause of increased functionality of MDTs especially Pgp in epileptic patients is not
adequately defined. One aim was to investigate, if AEDs induce Pgp functionality.
For this purpose the immortalized human cell line hCMEC/D3, which was derived
from the temporal lobe of a pharmacoresistant epilepsy patient (WEKSLER et al.
2005), was chosen. These cells express characteristic endothelial marker proteins
and are used for in vitro studies (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL
et al. 2010). In preliminary studies, primary rat brain endothelial cells (rBCEC) were
also used in a transwell model.
Expression of Pgp was detected by Western blot in all immortalized cell lines
(hCMEC/D3, GPNT, RBE4) and in the primary rBCEC cells. Functional analysis was
performed by accumulation assays (or uptake assays) with the Pgp substrate
rhodamine 123. Therefore, hCMEC/D3, GPNT, and RBE4 cells were exposed to the
widely used AEDs carbamazepine, levetiracetam, phenobarbital, phenytoin,
topiramate, and valproate at different therapeutic concentrations. For rBCEC cells,
carbamazepine and phenytoin were investigated. Typically, the cells were treated for
three days. In the uptake experiments functional Pgp in the cell lines hCMEC/D3,
GPNT, and RBE4 as well as in rBCEC cells was detected, which could be modulated
by known Pgp inducers and the known Pgp inhibitor tariquidar. The hCMEC/D3 cells
showed only little inducing effects for Pgp-mediated efflux although the expression of
this protein was relatively low compared to other cell lines. Data of the accumulation
assays varied widely in cells of the different species. Pgp functionality was not
affected by all tested AEDs in the chosen concentrations. In hCMEC/D3 cells, robust
effects were detected after the treatment with carbamazepine (100 µM) and valproate
(300 µM). In RBE4 cells, carbamazepine and topiramate induced Pgp functionality. In
experiments with rBCEC cells carbamazepine and phenytoin led to an decreased
efflux of the Pgp substrate rhodamine 123 and therefore the used concentrations of
these AEDs seemed to have inhibiting effects on the Pgp functionality. Although
known Pgp inducers in GPNT cells induced the rhodamine efflux, no effects were
detected after treatment with AEDs. Because of varying results the analysis of
additional concentrations of the AEDs is important to detect possible concentrationdependent
effects. Data of the rhodamine uptake assays lead to the conclusion that
several AEDs affect the functionality of Pgp.
The transport studies revealed variable data. For primary brain cultures similar
variable results were already described due to many different preparation and
177

SUMMARY
cultivation protocols (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). After modification
of different parameters, especially for hCMEC/D3 cells, asymmetric transport of
rhodamine 123 in these cells and rBCEC cells was detectable. Co-cultivation with
astrocytes improved the transwell model by higher TEER values and slightly reduced
mannitol permeabilities. Accordingly the co-culture of the immortalized human and
primary rat brain endothelial cells with these glial cells led to an increased integrity of
the monolayers. But the asymmetric transport of rhodamine 123 could only partially
be inhibited by tariquidar and valspodar. Moreover, in comparison with literature the
relatively low TEER values and the high permeabilities of mannitol revealed that the
ideal conditions are not yet found. However, the improvement of the immortalized
human hCMEC/D3 cells and the primary brain endothelial cells of rats as well as of
other species as transwell model and the establishment of the humanized dynamic in
vitro BBB model (STANNESS et al. 1996; CUCULO et al. 2002) respectively may
contribute to specific investigations of AEDs transport by MDTs at the BBB.
178

LITERATURVERZEICHNIS
7 LITERATURVERZEICHNIS
ABBOTT, N.J., 2002. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J Anat.
200: 629-638.
ABBOTT, N.J., PATABENDIGE, A.A., DOLMAN, D.E., YUSOF, S.R., BEGLEY, D.J., 2010. Structure
and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37: 13-25.
ABBOTT, N.J., REVEST, P.A., GREENWOOD, J., ROMERO, I.A., NOBLES, M., RIST, R.J., REEVE-
CHEN, Z.D., CHAN, M.W.K., 1997. Preparation of primary rat brain endothelial cell culture.
Modified method of CCW Hughes. A.G. de Boer, W. Sutanto (Eds.), Drug Transport Across
the Blood Brain Barrier: In Vitro and In Vivo Techniques, Harwood Academic Publishers,
Amsterdam; 5–16.
ABBOTT, N.J., RÖNNBÄCK, L., HANSSON, E., 2006. Astrocyte–endothelial interactions at the blood–
brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7: 41–53.
ACHARYA, P., O‘CONNOR, M.P., POLLI, J.W., AYRTON, A., ELLENS, H., BENTZ, J., 2008. Kinetic
identification of membrane transporters that assist P-glycoprotein-mediated transport of
digoxin and loperamide through a confluent monolayer of MDCKII-hMDR1 cells. Drug Metab
Dispos. 36: 452-460.
ALAM, M.I., BEG, S., SAMAD, A., BABOOTA, S., KOHLI, K., ALI, J., AHUJA, A., AKBAR, M., 2010.
Strategy for effective brain drug delivery. Eur J Pharm Sci. 40: 385-403.
ALLIKMETS, R., SCHRIML, L.M., HUTCHINSON, A., ROMANO-SPICA, V., DEAN, M., 1998: A
human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is
involved in multidrug resistance. Cancer Res. 58: 5337-5339.
ALMS, D., FEDROWITZ, M., LÖSCHER, W., 2012. Induction of the MDT P-glycoprotein by several
antiepileptic drugs in rat and human brain endothelial cell lines. 8th FENS Forum of
Neuroscience, Barcelona, 34.01/C80.
AMBROZIAK, K., 2009. Methods of investigating drug-induced increase in the expression of the drug
efflux transporter P-glycoprotein in different cell types. PhD-Thesis, Tierärztliche Hochschule
Hannover.
AMBROZIAK, K., KUTEYKIN-TEPLYAKOV, K., LUNA-TORTÓS, C., AL-FALAH, M., FEDROWITZ,
M., LÖSCHERN, W., 2010. Exposure to antiepileptic drugs does not alter the functionality of
P-glycoprotein in brain capillary endothelial and kidney cell lines. Eur J Pharmacol. 628: 57-66.
AMBUDKAR, S.V., GOTTESMAN, M.M., 1998. ABC Transporters: Biochemical, cellular, and
molecular aspects. Meth. Enzymol. 292: 1–853.
ARAM, J.A., LODGE, D., 1987. Epileptiform activity induced by alkalosis in rat neocortical slices: block
by antagonists of N-methyl-D-aspartate. Neurosci. Lett. 83: 345-350.
ARGAW, A.T., ASP, L., ZHANG, J., NAVRAZHINA, K., PHAM, T., MARIANI, J.N., MAHASE, S.,
DUTTA, D.J., SETO, J., KRAMER, E.G., FERRARA, N., SOFRONIEW, M.V., JOHN, G.R.,
2012. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory
disease. J Clin Invest. 122: 2454-2468.
ARONICA, E., GORTER, J.A., JANSEN, G.H., VAN VEEN, C.W.M., VAN RIJEN, P.C., LEENSTRA,
S., RAMKEMA, M.,SCHEFFER, G.L., SCHEPER, R.J., TROOST, D., 2003. Expression and
179

LITERATURVERZEICHNIS
cellular distribution of multidrugtransporter proteins in two major causes of medically
intractable epilepsy: focal cortical dysplasia and glioneuronal tumors. Neuroscience 118: 417-
429.
ARONICA, E., GORTER, J.A., RAMKEMA, M., REDEKER, S., OZBAS-GERCERER, F., VAN VLIET,
E.A., SCHEFFER, G.L., SCHEPER, R.J., VAN, D.V., BAAYEN, J.C., TROOST, D., 2004.
Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the
hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia 45: 441–451.
ARTURSSON, P., 1990. Epithelial transport of drugs in culture. I: a model for studying the passive
diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79: 476-482.
ASCHNER, M., FITSANAKIS, V.A., DOS SANTOS, A.P., OLIVI, L., BRESSLER, J.P., 2006. Bloodbrain
barrier and cell-cell interactions: methods for establishing in vitro models of the bloodbrain
barrier and transport measurements. Methods Mol Biol. 341: 1-15.
BACHMEIER, C.J., TRICKLER, W.J., MILLER, D.W., 2006. Comparison of drug efflux transport
kinetics in various blood–brain barrier models. Drug Metab. Dispos. 34: 998-1003.
BAKOS, É., HOMOLYA, L., 2007. Portrait of multifaceted transporter, the multidrug resistanceassociated
protein 1 (MRP1/ABCC1). Pflugers Arch 453: 621-641.
BALLABH, P., BRAUN, A., NEDERGAARD, M., 2004. The blood-brain barrier: an overview: structure,
regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16: 1-13.
BALTES, S., GASTENS, A.M., FEDROWITZ, M., POTSCHKA, H., KAEVER, V., LÖSCHER, W.,
2007a. Differences in the transport of the antiepileptic drugs phenytoin, levetiracetam and
carbamazepine by human and mouse P-glycoprotein. Neuropharmacology 52: 333-346.
BALTES, S., FEDROWITZ, M., LUNA-TORTÓS, C., POTSCHKA, H., LÖSCHER, W., 2007b. Valproic
acid is not a substrate for P-glycoprotein or multidrug resistance proteins 1 and 2 in a number
of in vitro and in vivo transport assays. J. Pharmacol. Exp. Ther. 320: 331-343.
BANKSTAHL, J.P., HOFFMANN, K., BETHMANN, K., LÖSCHER, W., 2008a. Glutamate is critically
involved in seizure-induced overexpression of P-glycoprotein in the brain. Neuropharmacology
54: 1006-1016.
BANKSTAHL, J.P., LÖSCHER, W., 2008. Resistance to antiepileptic drugs and expression of P-
glycoprotein in two rat models of status epilepticus. Epilepsy Res. 82: 70-85.
BATES, S. F.,CHEN, C., ROBEY, R., KANG, M., FIGG, W.D., FOJO, T., 2002. Reversal of multidrug
resistance: lessons from clinical oncology. Novartis Found Symp. 243: 83-96; discussion 96-
102, 180-05.
BAUER, B., HARTZ, A.M., FRICKER, G., MILLER, D.S., 2004. Pregnane X receptor up-regulation of
P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol. Pharmacol.
66: 413-419.
BAUER, B., HARTZ, A.M., FRICKER, G., MILLER, D.S., 2005. Modulation of p-glycoprotein transport
function at the blood-brain barrier. Exp. Biol. Med. 230: 118-127.
BAUER, B., HARTZ, A.M., MILLER, D.S., 2007. Tumor Necrosis Factor {alpha} and Endothelin-1
Increase P-Glycoprotein Expression and Transport Activity at the Blood-Brain Barrier. Mol.
Pharmacol. 71: 667-675.
180

LITERATURVERZEICHNIS
BAUER, B., HARTZ, A.M., PEKCEC, A., TOELLNER, K., MILLER, D.S., POTSCHKA, H., 2008.
Seizure-induced up-regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier through glutamate
and cyclooxygenase-2 signaling. Mol Pharmacol. 73: 1444-1453.
BAUER, B., YANG, X., HARTZ, A.M., OLSON, E.R., ZHAO, R., KALVASS, J.C., POLLACK, G.M.,
MILLER D.S., 2006. In vivo activation of human PXR tightens the blood-brain barrier to
methadone through P-glycoprotein upregulation. Mol. Pharmacol. 70: 1212-1219.
BECKER, C., DREWE, J., 2006. Interaktionen zwischen Antiepileptika und Arzneimitteln zur Therapie
und Prophylaxe der Migräne. Epileptologie 23: 14-23.
BEGLEY, D.J., 2004. ABC transporters and the blood-brain barrier. Curr Pharm Des 10: 1295–1312.
BEGLEY, D.J., LECHARDEUR, D., CHEN, Z.D., ROLLINSON, C., BARDOUL, M., ROUX, F.,
SCHERMAN, D., ABBOTT, N.J., 1996. Functional expression of p-glycoprotein in an
immortalised cell line of rat brain endothelial cells. RBE4. J. Neurochem. 67: 988-995.
BEREZOWSKI, V., LANDRY, C., DEHOUCK, M.P., CECCHELLI, R., FENART, L., 2004. Contribution
of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistanceassociated
proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018: 1-9.
BERG, A.T., BERKOVIC, S.F., BRODIE, M.J., BUCHHALTER, J., CROSS, J.H., BOAS, W.V.,
ENGEL, J., FRENCH, J., GLAUSER, T.A., MATHERN,, G.W., MOSHE, S.L., NORDLI, D.,
PLOUIN, P., SCHEFFER, I.E., 2010. Revised terminology and concepts for organization of
seizures and epilepsies: Report of the ILAE Commission on Classification and Terminology,
2005-2009. Epilepsia 51: 676-685.
BERNAS, M.J., CARDOSO, F.L., DALEY, S.K., WEINAND, M.E., CAMPOS, A.R., FERREIRA, A.J.G.,
HOYING, J.B., WITTE, M.H., BRITES, D., PERSIDSKY, Y., RAMIREZ, S.H., BRITO, M.A.,
2010. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to
provide an in vitro cellular model of the blood–brain barrier. Nat. Protoc. 5: 1247–1254.
BERTRAM, E.H., 2009. Temporal lobe epilepsy: where do the seizures really begin? Epilepsy Behav.
14 (Suppl 1): 32-37.
BETHMANN, K., FRITSCHY, J.M., BRANDT, C., LÖSCHER, W., 2008. Antiepileptic drug resistant
rats differ from drug responsive rats in GABA A receptor subunit expression in a model of
temporal lobe epilepsy. Neurobiol. Dis. 31: 169-187.
BITTER K., 1977. Superadditive cytostatic effects after combined administration of vincristine,
bleomycin and methotrexate to Yoshida sarcoma. J Maxillofac Surg. 5: 115-117.
BONATE, P.L., 1995. Animal models for studying transport across the blood-brain barrier. J. Neurosci.
Methods. 56: 1-15.
BOON, P., DE HERDT, V., VONCK, K., VAN ROOST, D., 2007b. Clinical experience with vagus nerve
stimulation and deep brain stimulation in epilepsy. Acta Neurochir Suppl. 2007; 97(Pt 2): 273-
280.
BOON, P., RAEDT, R., STEFAN, H., 2012. Innovative treatments for epilepsy: radiosurgery and local
delivery. Handb Clin Neurol. 108: 971-981.
BOON, P., VONCK, K, DE HERDT, V., VAN DYCKE, A., GOETHALS, M., GOOSSENS, L., VAN
ZANDIJCKE, M., DE SMEDT, T., DEWAELE, I., ACHTEN, R., WADMAN, W., DEWAELE, F.,
181

LITERATURVERZEICHNIS
CAEMAERT, J., VAN ROOST, D., 2007a. Deep brain stimulation in patients with refractory
temporal lobe epilepsy. Epilepsia 48: 1551-1560.
BOURNISSEN, F.G., MORETTI, M.E., JUURLINK, D.N., KOREN, G., WALKER, M., FINKELSTEIN,
Y., 2009. Polymorphism of the MDR1/ABCB1 C3435T drug-transporter and resistance to
anticonvulsant drugs: a meta-analysis. Epilepsia 50: 898–903.
BRANDT, C., BETHMANN, K., GASTENS, A.M., LÖSCHER, W., 2006. The multidrug transporter
hypothesis of drug resistance in epilepsy: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe
epilepsy. Neurobiol Dis. 24: 202-211.
BRIGGER, I., MORIZET, J., AUBERT, G., CHACUN, H., TERRIER-LACOMBE, M.J., COUVREUR,
P., VASSAL, G., 2002. Poly(ethylene glycol)-coated hexadecylcyanoacrylate nanospheres
display a combined effect for brain tumor targeting. J Pharmacol Exp Ther. 303: 928-936.
BRINKMANN, U., EICHELBAUM, M., 2001. Polymorphisms in the ABC drug transporter gene MDR1.
Pharmacogenomics J. 1: 59-64.
CALABRIA, A.R., WEIDENFELLER, C., JONES, A.R., DEVRIES ,H.E., SHUSTA, E.V., 2006.
Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier
properties in response to glucocorticoid induction. J. Neurochem. 97: 922–933.
CARDOSO, F.L., BRITES, D., BRITO, M.A., 2010. Looking at the blood-brain barrier: molecular
anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64: 328-363.
CARL, S.M., LINDLEY, D.J., COURAUD, P.O., WEKSLER, B.B., ROMERO, I., MOWERY, S.A.,
KNIPP, G.T., 2010. ABC and SLC transporter expression and pot substrate characterization
across the human CMEC/D3 blood-brain barrier cell line. Mol Pharm. 7: 1057-1068.
CECCHELLI, R., BEREZOWSKI, V., LUNDQUIST, S., CULOT, M., RENFTEL, M., DEHOUCK, M.P.,
FENART, L., 2007. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development.
Nat. Rev. Drug Discov. 6: 650–661.
CECCHELLI, R., DEHOUCK, B., DESCAMPS, L., FENART, L., BUÉE-SCHERRER, V., DUHEM, C.,
LUNDQUIST, S., RENTFEL, M., TORPIER, G., DEHOUCK, M.P., 1999. In vitro model for
evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev 36: 165-178.
CERVENY, L., PAVEK, P., MALAKOVA, J., STAUD, F., FENDRICH, Z., Lack of interactions between
breast cancer resistance protein (bcrp/abcg2) and selected antiepileptic agents. Epilepsia 47:
461-468.
CHEN, C.J., CHIN, J.E., UEDA, K., CLARK, D.P., PASTAN, I., GOTTESMAN, M.M., RONINSON, I.B.,
1986. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (Pglycoprotein)
gene from multidrug-resistant human cells. Cell 47: 381–389.
CHEN, J., RAYMOND, K., 2006. Roles of rifampicin in drug-drug interactions: underlying molecular
mechanisms involving the nuclear pregnane X receptor. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 5: 3.
CHEN, T., 2010. Overcoming drug resistance by regulating nuclear receptors. Adv. Drug Deliv. Rev.
62: 1257-1264.
CHEN, Y., FERGUSON, S.S., NEGISHI, M., GOLDSTEIN, J.A., 2004. Induction of human CYP2C9 by
rifampicin, hyperforin, and phenobarbital is mediated by the pregnane X receptor. J Pharmacol
Exp Ther. 308: 495-501.
182

LITERATURVERZEICHNIS
CISTERNINO, S., MERCIER, C., BOURASSET, F., ROUX, F., SCHERRMANN, J.M., 2004.
Expression, up-regulation, and transport activity of the multidrugresistance protein Abcg2 at
the mouse blood-brain barrier. Cancer Res. 64: 3296-3301.
CLAUDE, P., 1978. Morphologic factors influencing transepithelial permeability. A model for the
resistance of the zonula occludens. J Membr Biol 39: 219-232.
COISNE, C., DEHOUCK, L., FAVEEUW, C., DELPLACE, Y., MILLER, F., LANDRY, C.,
MORISSETTE, C., FENART, L., CECCHELLI, R., TREMBLAY, P., DEHOUCK, B., 2005.
Mouse syngenic in vitro blood–brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events
in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85: 734–746.
COLABUFO, N.A.; BERARDI, F.; CANTORE, M.; CONTINO, M.; INGLESE, C.; NISO, M.; PERRONE,
R., 2010. Perspectives of P-glycoprotein modulating agents in oncology and
neurodegenerative diseases: pharmaceutical, biological, and diagnostic potentials. J. Med.
Chem. 53: 1883-1897.
COLE, S.P., BHARDWAJ, G., GERLACH, J.H., MACKIE, J.E., GRANT, C.E., ALMQUIST, K.C.,
STEWART, A.J., KURZ, E.U., DUNCAN, A.M., DEELEY, R.G., 1992. Overexpression of a
transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science 2: 1650-1654.
CORDON-CARDO, C., O'BRIEN, J.P., CASALS, D., RITTMAN-GRAUER, L., BIEDLER, J.L.,
MELAMED, M.R.,, BERTINO, J.R., 1989. Multidrug-resistance gene (P-glycoprotein) is
expressed by endothelial cells at blood–brain barrier sites. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:
695–698.
CROWE, A., TEOH, Y.K., 2006. Limited P-glycoprotein mediated efflux for anti-epileptic drugs. J.
Drug. Target. 14: 291-300.
CUCULLO, L., COURAUD, P.O., WEKSLER, B., ROMERO, I.A., HOSSAIN, M., RAPP, E., JANIGRO,
D., 2008. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a
marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28:
312–328.
CUCULLO, L., HOSSAIN, M., RAPP, E., MANDERS, T., MARCHI, N., JANIGRO, D., 2007.
Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration
of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48: 505-516.
CUCULLO, L., MCALLISTER, M.S., KIGHT, K., KRIZANAC-BENGEZ, L., MARRONI, M., MAYBERG,
M.R., STANNESS, K.A., JANIGRO, D., 2002. A new dynamic in vitro model for the
multidimensional study of astrocyte-endothelial cell interactions at the blood–brain barrier.
Brain Res. 951: 243–254.
DANIELS, B.P., CRUZ-ORENGO, L., PASIEKA, T.J., COURAUD, P.O., ROMERO, I.A., WEKSLER,
B., COOPER, J.A., DOERING, T.L., KLEIN, R.S., 2013. Immortalized human cerebral
microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of
immune migration across the blood brain barrier. J Neurosci Methods. 212: 173-179.
DALTON, W. S., GROGAN, T.M., MELTZER, P.S., SCHEPER, R.J., DURIE, B.G., TAYLOR, C.W.,
MILLER, T.P., SALMON, S.E., 1989. Drug-resistance in multiple myeloma and non-Hodgkin's
183

LITERATURVERZEICHNIS
lymphoma: detection of P-glycoprotein and potential circumvention by addition of verapamil to
chemotherapy. J Clin Oncol. 7: 415-424.
DAUCHY, S., MILLER, F., COURAUD, P.O., WEAVER, R.J., WEKSLER, B., ROMERO, I.A.,
SCHERRMANN, J.M., DE W, I., DECLEVES, X., 2009. Expression and transcriptional
regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral
microvascular endothelial cells. Biochem. Pharmacol. 77: 897-909.
DEAN, M., RZHETSKY, A., ALLIKMETS, R., 2001. The human ATP-binding cassette (ABC)
transporter superfamily. Genome Res. 11: 1156-1166.
DE BRUIN, M., MIYAKE, K., LITMAN, T., ROBEY, R., BATES, S.E., 1999. Reversal of resistance by
GF120918 in cell lines expressing the ABC half-transporter, MXR. Cancer Lett. 146: 117-126.
DEEKEN, J.F., LÖSCHER, W., 2007. The blood-brain barrier and cancer: transporters, treatment, and
Trojan horses. Clin. Cancer Res. 13: 1663-1674.
DEHOUCK, M.P., MÉRESSE, S., DELORME, P., FRUCHART, J.C., CECCHELLI, R., 1990. An
easier, reproducible and mass production method to study the blood-brain barrier in vitro. J
Neurochem. 54: 1790- 1797.
DELI, M.A., ABRAHÁM, C.S., NIWA, M., FALUS, A., 2003. N,N-diethyl-2-[4-
(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral
endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52 Suppl 1: 39-40.
DELI, M.A., ABRAHÁM, C.S., KATAOKA, Y., NIWA, M., 2005. Permeability studies on in vitro bloodbrain
barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25: 59-
127.
DEMEUSE, P., FRAGNER, P., LEROY-NOURY, C., MERCIER, C., PAYEN, L., FARDEL, O.,
COURAUD, P.O., ROUX, F., 2004. Puromycin selectively increases mdr1a expression in
immortalized rat brain endothelial cell lines. J. Neurochem. 88: 23-31.
DEMEUSE, P., KERKHOFS, A., STRUYS-PONSAR, C., KNOOPS, B., REMACLE, C., VAN DEN
BOSCH DE AGUILAR, P., 2002. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells
and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J Neurosci Methods. 121:
21-31.
DEVINSKY, O., 2003. Psychiatric comorbidity in patients with epilepsy: implications for diagnosis and
treatment. Epilepsy Behav. 4, Suppl 4: 2-10.
DIDZIAPETRIS, R., JAPERTAS, P., AVDEEF, A., PETRAUSKAS, A., 2003. Classification analysis of
P-glycoprotein substrate specificity. J Drug Target. 11: 391-406.
DIXIT, S.G., D'SOUZA, V.M., BUCKLEY, D.J., BUCKLEY, A.R., PAULETTI, G.M., 2002. Rifampicinmediated
Induction of P-glycoprotein in Caco-2 cells. Role of the Pregnane X Receptor (PXR).
Abstract annual meeting of american association of pharmaceutical scientists.
DOMBROWSKI, S.M., DESAI, S.Y,. MARRONI, M., CUCULLO, L., GOODRICH, K., BINGAMAN, W.,
MAYBERG, M.R., BENGEZ, L., JANIGRO, D., 2001.Overexpression of multiple drug
resistance genes in endothelial cells from patients with refractory epilepsy. Epilepsia 42: 1501-
1506.
184

LITERATURVERZEICHNIS
DOHGU, S., TAKATA, F., YAMAUCHI, A., NAKAGAWA, S., EGAWA, T., NAITO, M., TSURUO, T.,
SAWADA, Y., NIWA, M., KATAOKA, Y., 2005. Brain pericytes contribute to the induction and
up-regulation of bloodbrain barrier functions through transforming growth factor-beta
production. Brain Res. 1038: 208-215.
DORAN, A., OBACH, R.S., SMITH, B.J., HOSEA, N.A., BECKER, S., CALLEGARI, E., CHEN, C.,
CHEN, X., CHOO, E., CIANFROGNA, J., COX, L.M., GIBBS, J.P., GIBBS, M.A., HATCH, H.,
HOP, C.E., KASMAN, I.N., LAPERLE, J., LIU, J., LIU, X., LOGMAN, M., MACLIN, D., NEDZA,
F.M., NELSON, F., OLSON, E., RAHEMATPURA, S., RAUNIG, D., ROGERS, S., SCHMIDT,
K., SPRACKLIN, D.K., SZEWC, M., TROUTMAN, M., TSENG, E., TU, M., VAN DEUSEN,
J.W., VENKATAKRISHNAN, K., WALENS, G., WANG, E.Q., WONG, D., YASGAR, A.S.,
ZHANG, C., 2005. The impact of Pgp on the disposition of drugs targeted for indications of the
central nervous system: Evaluation using the mdr1a/1b knockout mouse model. Drug Metabol
Disp. 33: 165-174.
DOYLE, L.A., ROSS, D.D., 2003. Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance
protein BCRP (ABCG2). Oncogene 22: 7340-7358.
DOYLE, L.A., YANG, W.D., ABRUZZO, L.V., KROGMANN, T., GAO, Y.M., RISHI, A.K., ROSS, D.D.,
1998. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Pro Natl
Acad Sci USA 95: 15665-15670.
DUNCAN, J.S., SANDER, J.W., SISODIYA, S.M., WALKER, M.C., 2006. Adult epilepsy. Lancet. 367:
1087-1100.
DURING, M.J., SPENCER, D.D., 1993. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure
in the conscious human brain. Lancet. 341: 1607-1610.
EFFERTH, T., LOHRKE, H., VOLM, M., 1989. Reciprocal correlation between expression of P-
glycoprotein and accumulation of rhodamine 123 in human tumors. Anticancer Res 9: 1633-
1637.
EHRLICH, P., 1885. Das Sauerstoff-Bedürfniss des Organismus: Eine farbenanalytische Studie.
August Hirschwald, Berlin (die Habilitationsschrift von Paul Ehrlich).
EKINS, S., ERICKSON, J.A., 2002. A pharmacophore for human pregnane X receptor ligands. Drug
Metab. Dispos. 30: 96-99.
ENGEL, J., Jr., 2001. Mesial Temporal Lobe Epilepsy: What Have We Learned? The Neuroscientist 7:
340-352.
ENGEL, J., 2006. ILAE classification of epilepsy syndromes. Epilepsy Res. 70, Suppl (0): 5-10.
ENGEL, J. Jr., 2011. Biomarkers in epilepsy: foreword. Biomark Med. 5: 529–530.
ENOKIZONO, J., KUSUHARA, H., OSE, A., SCHINKEL, A.H., SUGIYAMA, Y., 2008. Quantitative
investigation of the role of breast cancer resistance protein (Bcrp/Abcg2) in limiting brain and
testis penetration of xenobiotic compounds. Drug Metab Dispos. 36: 995-1002.
EVERS, R., ZAMAN, G.J., VAN DEEMTER, L., JANSEN, H., CALAFAT, J., OOMEN, L.C., OUDE
ELFERINK, R.P., BORST, P., SCHINKEL, A.H., 1996. Basolateral localization and export
activity of the human multidrug resistanceassociated protein in polarized pig kidney cells. J
Clin Invest. 97: 1211-1218.
185

LITERATURVERZEICHNIS
EYAL, S., CHUNG, F.S., MUZI, M., LINK, J.M., MANKOFF, D.A., KADDOUMI, A., O'SULLIVAN, F.,
HEBERT, M.F., UNADKAT, J.D., 2009. Simultaneous PET Imaging of P-Glycoprotein
Inhibition in Multiple Tissues in the Pregnant Nonhuman Primate. J Nucl Med. 50: 798-806.
FALKOW, S., 1988. Molecular Koch's postulates applied to microbial pathogenicity. Rev Infect Dis. 10
Suppl 2: 274-276.
FARDEL, O., LECUREUR, V., DAVAL, S., CORLU, A., GUILLOUZO, A., 1997. Up-regulation of P-
glycoprotein expression in rat liver cells by acute treatment. Eur. J. Biochem. 246: 186-192.
FASLER-KAN, E., SUENDERHAUF, C., BARTENEVA, N., POLLER, B., GYGAX, D., HUWYLER, J.,
2010. Cytokine signaling in the human brain capillary endothelial cell line hCMEC/D3. Brain
Res. 1354: 15-22.
FDA, 2006 Food and Drug Administration (FDA) and U.S. Department of Health and Human Services,
Guidance for industry. Drug interaction studies – study design, data analysis, and implications
for dosing and labeling., http://www.fda.gov/cder/Guidance/6695dft.pdf.
FEDROWITZ, M., LÖSCHER, W., GERNERT, M., 2002: Electrophysiological investigations of the
subthalamic nucleus in the rat kindling model of epilepsy. FENS Abstract 1: A187.112.
FENG, B., MILLS, J.B., DAVIDSON, R.E., MIRELES, R.J., JANISZEWSKI, J.S., TROUTMAN, M.D.,
DE MORAIS, S.M., 2008. In vitro Pgp assays to predict the in vivo interactions of Pgp with
drugs in the central nervous system. Drug Metabol Disp 36: 268-275.
FISCHER, D.E., 1994 Apoptosis in cancer therapy: Crossing the threshold. Cell 78: 539–542.
FISHER, R.S., HO, J., 2002. Potential new methods for antiepileptic drug delivery. CNS Drugs 16:
579-593.
FISHER, R., VAN EMDE BOAS, S., BLUME, W., ELGER, C., GENTON, P., LEE, P., ENGEL, J., JR.,
2005. Epileptic seizures and epilepsy: Definitions proposed by the International League
Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia 46: 470-
472.
FORSTER, S., THUMSER, A.E., HOOD, S.R., PLANT, N., 2012. Characterization of Rhodamine-123
as a Tracer Dye for Use In In vitro Drug Transport Assays. PLoS ONE 7: e33253.
FÖRSTER, C., BUREK, M., ROMERO, I.A., WEKSLER, B., COURAUD, P.O., DRENCKHAHN, D.,
2008. Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in
vitro model of the human blood-brain barrier. J Physiol. 586: 1937-1949.
FOLDVARY, N., BINGAMAN, W., E., WYLLIE, E., 2001. Surgical treatment of epilepsy. Neurol. Clin.
19: 491-515.
FORD, J.M., HAIT, W.N., 1993. Pharmacologic circumvention of multidrug resistance. Cytotechnology.
12: 171-212.
FRANKE, H., GALLA, H.J., BEUCKMANN. C.T., 1999. An improved low-permeability in vitro-model of
the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and
mannitol. Brain Res. 818: 65-71.
FRANKE, H., GALLA, H., BEUCKMANN, C.T., 2000. Primary cultures of brain microvessel endothelial
cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro.
Brain Res Brain Res Protoc. 5: 248-56.
186

LITERATURVERZEICHNIS
FRICKER, G., MILLER, D.S., 2004. Modulation of drug transporters at the blood-brain barrier.
Pharmacology 70: 169–176.
FROMM, M.F., 2004. Importance of P-glycoprotein at blood–tissue barriers. Trends Pharmacol. Sci.
25: 423–429.
FROMM, M.F., KAUFFMANN, H.M., FRITZ, P,. BURK, O., KROEMER, H.K., WARZOK, R.W.,
EICHELBAUM, M., SIEGMUND, W., SCHRENK, D., 2000. The effect of rifampin treatment on
intestinal expression of human MRP transporters. Am J Pathol 157: 1575–1580.
FU, D., ARIAS, I.M., 2012. Intracellular trafficking of P-glycoprotein. Int J Biochem Cell Biol. 44: 461-4.
FU, D., BEBAWY, M., KABLE, E., ROUFOGALIS, B.D., 2004. Subcellular localization of P-
glycoprotein-EGFP fusion protein: implication in multidrug resistance in cancer. Int. J Cancer.
109: 174–181.
FU, D., VAN DAM, E., BRYMORA, A., DUGGIN, I.G., ROBINSON, P.J., ROUFOGALIS, B.D., 2007.
The small GTPases Rab5 and RalA regulate intracellular traffic of P-glycoprotein. Biochim
Biophys Acta. 1773: 1062-72.
GAILLARD, P.J., DE BOER, A.G., 2000. Relationship between permeability status of the blood-brain
barrier and in vitro permeability coefficient of a drug. Eur J Pharm Sci. 12: 95-102.
GAILLARD, P.J., VAN DER SANDT I.C.J., VOORWINDEN, L.H., VU, D., NIELSEN, J.L., DE BOER,
A.G., BREIMER, D.D., 2000. Astrocytes increase the functional expression of Pgp in an in
vitro model of the blood-brain barrier. Pharm Res 17: 1198-1205.
GARBERG, P., BALL, M., BORG, N., CECCHELLI, R., FENART, L., HURST, R.D., LINDMARK, T.,
MABONDZO, A., NILSSON, J.E., RAUB, T.J., STANIMIROVIC, D., TERASAKI, T., OBERG,
J.O., OSTERBERG, T., 2005. In vitro models for the blood–brain barrier. Toxicol. In Vitro 19:
299–334.
GARCIA, C.M., DARLAND, D.C., MASSINGHAM, L.J., D’AMORE, P.A., 2004. Endothelial cellastrocyte
interactions and TGF beta are required for induction of blood-neural barrier
properties. Brain Res Dev Brain Res. 152: 25-38.
GARCÍA-MORALES, I., DE LA PEÑA MAYOR, P., KANNER, A.M., 2008. Psychiatric comorbidities in
epilepsy: identification and treatment. Neurologist 14 Suppl 1: 15-25.
GEDEON, C., BEHRAVAN, J., KOREN, G., PIQUETTE-MILLER, M., 2006. Transport of glyburide by
placental ABC transporters: implications in fetal drug exposure. Placenta 27: 1096–102.
GENNUSO, F., FERNETTI, C., TIROLO, C., TESTA, N., L’EPISCOPO, F., CANIGLIA, S., MORALE,
M.C., OSTROW, J.D., PASCOLO, L., TIRIBELLI, C., MARCHETTI, B., 2004. Bilirubin protects
astrocytes from ist own toxicity by inducing up-regulation and translocation of multidrug
resistance-associated protein 1 (Mrp1). Proc Natl Acad Sci USA 101: 2470 –2475.
GERNERT, M., FEDROWITZ, M., WLAZ, P., LÖSCHER, W., 2004. Subregional changes in discharge
rate, pattern, and drug sensitivity of putative GABAergic nigral neurons in the kindling model of
epilepsy. Eur. J. Neurosci. 20: 2377-2386.
GIESSMANN, T., MAY, K., MODESS, C., WEGNER, D., HECKER, U., ZSCHIESCHE, M., DAZERT,
P., GRUBE, M., SCHROEDER, E., WARZOK, R., CASCORBI, I., KROEMER, H.K.,
SIEGMUND, W., 2004. Carbamazepine regulates intestinal P-glycoprotein and multidrug
187

LITERATURVERZEICHNIS
resistance protein MRP2 and influences disposition of talinolol in humans. Clin. Pharmacol.
Ther. 76: 192–200.
GIRARDIN, F. 2006. Membrane transporter proteins: a challenge for CNS drug development.
Dialogues Clin Neurosci. 8: 311–321.
GLAVINAS, H., MÉHN, D., JANI, M., OOSTERHUIS, B., HERÉDI-SZABÓ, K., KRAJCSI, P., 2008.
Utilization of membrane vesicle preparations to study drug-ABC transporter interactions.
Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4: 721-32.
GOLDMANN, E.E., 1913. Vitalfärbung am Zentralnervensystem. Abh. Preuss. Akad. Wiss. Physik.
Math. Kl. I: 1–60.
GOODKIN, H.P., JOSHI, S., MTCHEDLISHVILI, Z., BRAR, J., KAPUR, J., 2008. Subunit-specific
trafficking of GABAA receptors during status epilepticus. J. Neurosci. 28: 2527-2538.
GRANT, G.A., ABBOTT, N.J., JANIGRO, D., 1998. Understanding the Physiology of the Blood-Brain
Barrier: In Vitro Models. News Physiol. Sci. 13: 287–293.
GREENWOOD, J., PRYCE, G., DEVINE, L., MALE, D.K., DOS SANTOS, W.L., CALDER, V.L.,
ADAMSON, P., 1996. SV40 large T immortalised cell lines of the rat blood-brain and bloodretinal
barriers retain their phenotypic and immunological characteristics. J. Neuroimmunol.
71: 51-63.
GROBSTEIN, C., 1953. Morphogenetic Interaction between Embryonic Mouse Tissues separated by a
Membrane Filter. Nature 172: 869-871.
GUTMANN, H., DREWE, J., 2002. P-Glykoprotein – Bedeutung für die Arzneimitteltherapie. Journal
Suisse de pharmacie 17: 576–78.
HAGENBUCH, B., MEIER, P.J., 2003. The Superfamily of Organic Anion Transporting Polypeptides.
Biochim Biophy Acta 1609: 1-18.
HAIT, W.N., AFTAB, D.T., 1992. Rational design and pre-clinical pharmacology of drugs for reversing
multidrug resistance. Biochem Pharmacol. 43: 103-107.
HAMER, H.M., DODEL, R., STRZELCZYK, A., BALZER-GELDSETZER, M., REESE, J.P.,
SCHÖFFSKI, O., GRAF, W., SCHWAB, S., KNAKE, S., OERTEL, W.H., ROSENOW, F.,
KOSTEV, K., 2012. Prevalence, utilization, and costs of antiepileptic drugs for epilepsy in
Germany-a nationwide population-based study in children and adults. J Neurol. 259: 2376-
2384.
HARTZ, A.M., BAUER, B., BLOCK, M.L., HONG, J.S., MILLER, D.S., 2008. Diesel exhaust particles
induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the
blood-brain barrier. Faseb J. 22: 2723-2733.
HASELOFF, R.F., BLASIG, I., BAUER, H.-C., BAUER, H., 2005. In search of the astrocytic factor(s)
modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol
Neurobiol. 25: 25-39.
HATHERELL, K., COURAUD, P.O., ROMERO, I.A., WEKSLER, B., PILKINGTON, G.J., 2011.
Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using
mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199: 223-229.
188

LITERATURVERZEICHNIS
HAWKINS, R.A., PETERSON, D.R., VINA, J.R., 2002. The complementary membranes forming the
blood-brain barrier. IUBMB Life 54: 101-107.
HAYASHI, K., NAKAO, S., NAKAOKE, R., NAKAGAWA, S., KITAGAWA, N., NIWA, M., 2004. Effects
of hypoxia on endothelial/pericytic co-culture model of the blood-brain barrier. Regul Pept.
123: 77-83.
HELMS, H.C., WAAGEPETERSEN, H.S., NIELSEN, C.U., BRODIN, B., 2010. Paracellular tightness
and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by
increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12: 759-770.
HENDRIKSE, N.H., SCHINKEL, A.H., DE VRIES, E.G., FLUKS, E., VAN DER GRAAF, W.T.,
WILLEMSEN, A.T., VAALBURG, W., FRANSSEN, E.J., 1998. Complete in vivo reversal of P-
glycoprotein pump function in the blood-brain barrier visualized with positron emission
tomography. Br J Pharmacol. 124: 1413–1418.
HIGGINS, C.F., 1995. The ABC of channel regulation. Cell 82: 693-696.
HILL, B.A., BROWN, P.C., PREISEGGER, K.H., SILVERMAN, J.A., 1996. Regulation of mdr1b gene
expression in Fischer, Wistar and Sprague-Dawley rats in vivo and in vitro. Carcinogenesis.
17: 451-457.
HO, R.H., KIM, R.B., 2005. Review Transporters and drug therapy: implications for drug disposition
and disease. Clin Pharmacol Ther. 78: 260-277.
HOCHMAN, J.H., YAMAZAKI, M., OHE, T., LIN, J.H., 2002. Evaluation of drug interactions with P-
glycoprotein in drug discovery: in vitro assessment of the potential for drug-drug interactions
with P-glycoprotein. Curr Drug Metab. 3: 257-273.
HOFFMANN, K., LÖSCHER, W., 2007. Upregulation of brain expression of P-glycoprotein in MRP2-
deficient TR(-) rats resembles seizure-induced up-regulation of this drug efflux transporter in
normal rats. Epilepsia. 48: 631-645.
HOHEISEL, D., NITZ, T., FRANKE, H., WEGENER, J., HAKVOORT, A., TILLING, T., GALLA, H.J.,
1998. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.
Biochem Biophys Res Commun. 247: 312-315.
HOLLENSTEIN K., DAWSON R.J., LOCHER K.P., 2007. Structure and mechanism of ABC
transporter proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 17: 412–8.
HOLMES, M. D., SILBERGELD, D.L., DROUHARD, D., WILENSKY, A.J., OJEMANN, L.M., 2004.
Effect of vagus nerve stimulation on adults with pharmacoresistant generalized epilepsy
syndromes. Seizure 13: 340-345.
HSUCHOU, H., KASTIN, A.J., TU, H., ABBOTT, J.N., COURAUD, P.O., PAN, W., 2010. Role of
astrocytic leptin receptor subtypes on leptin permeation across hCMEC/D3 human brain
endothelial cells. J Neurochem. 115: 1288-1298.
HUGHES, A.M., CALVIN, M., 1979. Cytocidal effect of rifamycin derivatives on ascites tumor cells:
studies with [125I]iododeoxyuridine. Cancer Lett. 6: 15-19.
HUNG, C.C., CHEN, C.C., LIN, C.J., LIOU, H.H., 2008. Functional evaluation of polymorphisms in the
human ABCB1 gene and the impact on clinical responses of antiepileptic drugs.
Pharmacogenet. Genom. 18: 390–402.
189

LITERATURVERZEICHNIS
HURST, R.D., FRITZ, I.B., 1996. Properties of an immortalised vascular endothelial/glioma cell coculture
model of the blood-brain barrier. J Cell Physiol. 167: 81-88.
HUTAMEKALIN, P., FARKAS, A.E., ORBÓK, A., WILHELM, I., NAGYOSZI, P., VESZELKA, S., DELI,
M.A., BUZÁS, K., HUNYADI-GULYÁS, E., MEDZIHRADSZKY, K.F., MEKSURIYEN, D.,
KRIZBAI, I.A., 2008. Effect of nicotine and polyaromtic hydrocarbons on cerebral endothelial
cells. Cell Biol Int. 32: 198-209.
HUWYLER, J., CERLETTI, A., FRICKER, G., EBERLE, A.N., DREWE, J., 2002. By-passing of P-
glycoprotein using immunoliposomes. J Drug Target 10: 73–79.
ILLMER, T., SCHAICH, M., PLATZBECKER, U., FREIBERG-RICHTER, J., OELSCHLÄGEL, U., VON
BONIN, M., PURSCHE, S., BERGEMANN, T., EHNINGER, G., SCHLEYER, E., 2004. P-
glycoprotein-mediated drug efflux is a resistance mechanism of chronic myelogenous
leukemia cells to treatment with imatinib mesylate. Leukemia. 18: 401-408.
JABS, R., SEIFERT, G., STEINHAUSER, C., 2008. Astrocytic function and ist alteration in the
epileptic brain. Epilepsia 49 Suppl. 2: 3-12.
JANDOVA, K., PASLER, D., ANTONIO, L.L., RAUE, C., JI, S., NJUNTING, M., KANN, O., KOVÁCS,
R., MEENCKE, H. J., CAVALHEIRO, E. A., HEINEMANN, U., GABRIEL, S., LEHMANN, T.N.,
2006. Carbamazepine-resistance in the epileptic dentate gyrus of human hippocampal slices.
Brain 129: 3290-3306.
JANIGRO, D., LEAMAN, S.M., STANNESS, K.A., 1999. Dynamic modeling of the blood-brain barrier:
a novel tool for studies of drug delivery to the brain. Pharm. Sci. Technolo. Today 2: 7-12.
JEDLITSCHKY, G., HOFFMANN, U., KROEMER, H.K., 2006. Structure and function of the MRP2
(ABCC2) protein and ist role in drug disposition. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2: 351–366.
JELIAZKOVA-MECHEVA, V.V., BOBILYA, D.J., 2003. A porcine astrocyte/endothelial cell co-culture
model of the blood-brain barrier. Brain Res Brain Res Protoc. 12: 91-98.
JOICE, S.L., MYDEEN, F., COURAUD, P.O., WEKSLER, B.B., ROMERO, I.A., FRASER, P.A.,
EASTON, A.S., 2009. Modulation of blood-brain barrier permeability by neutrophils: in vitro
and in vivo studies. Brain Res. 1298: 13-23.
JULIANO, R.L., LING, V., 1976. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese
hamster ovary cell mutants. Biochim. Biophys. Acta 455: 152-156.
KACEW, S., FESTING, M.F., 1996. Role of rat strain in the differential sensitivity to pharmaceutical
agents and naturally occurring substances. J Toxicol Environ Health. 47: 1-30.
KANDEL, E.R., SCHWARTZ, J.H., JESSELL, T.M., 2000. Principles of Neural Science, 4th ed.
McGraw-Hill, New York.
KANNAN, P., TELU, S., SHUKLA, S., AMBUDKAR, S.V., PIKE, V.W., HALLDIN, C., GOTTESMAN,
M.M., INNIS, R.B., HALL, M.D., 2010. The "specific" Pglycoprotein inhibitor tariquidar is also a
substrate and an inhibitor for breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2). ACS Chem
Neurosci. 2: 82-89.
KANNER, A.M., SCHACHTER, S.C., BARRY, J.J., HERSDORFFER, D.C., MULA, M., TRIMBLE, M.,
HERMANN, B., ETTINGER, A.E., DUNN, D., CAPLAN, R., RYVLIN, P., GILLIAM, F. 2012.
190

LITERATURVERZEICHNIS
Depression and epilepsy, pain and psychogenic non-epileptic seizures: clinical and
therapeutic perspectives. Epilepsy Behav. 24: 169-181.
KAST, C., CANFIELD, V., LEVENSON, R., GROS, P., 1996. Transmembrane organization of mouse
P-glycoprotein determined by epitope insertion and immunofluorescence. J Biol Chem.271:
9240-9248.
KERB R., 2006. Review Implications of genetic polymorphisms in drug transporters for
pharmacotherapy. Cancer Lett. 234: 4-33.
KLIEWER, S.A., WILLSON, T.M., 2002. Regulation of xenobiotic and bile acid metabolism by the
nuclear pregnane X receptor. J Lipid Res. 43: 359-364.
KOCH, R., 1884. Die Aetiologie der Tuberkulose. Mitt Kaiser Gesundh 2: 1–88.
KOELLA, W.P., 1986. Tolerance: ist various forms and their nature. In: Frey, H.H., Fröscher, W.,
Koella, W.P. et al., eds. Tolerance to beneficial and adverse effects of antiepileptic drugs. New
York: Raven Press, 1–6.
KÖHLE, C., BOCK, K.W., 2009. Coordinate regulation of human drug-metabolizing enzymes, and
conjugate transporters by the Ah receptor, pregnane X receptor and constitutive androstane
receptor. Biochem. Pharmacol. 77: 689–699.
KÖHLING, R., 2008. Entstehungsmechanismen der Epilepsien - unkonventionelle Hypothesen. Z.
Epileptol. 21: 171-179.
KODAMA, S., NEGISHI, M., 2006. Phenobarbital confers ist diverse effects by activating the orphan
nuclear receptor car. Drug Metab. Rev. 38: 75–87.
KWAN, P., BRODIE, M.J., 2000. Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med. 342: 314-
319.
KWAN, P., BRODIE, M.J., 2010. Definition of refractory epilepsy: defining the indefinable? Lancet
Neurol. 9: 27-29.
KWAN, P., ARZIMANOGLOU, A., BERG, A.T., BRODIE, M.J., HAUSER, W.A., MATHERN, G.,
MOSHE. S.L., PERUCCA, E., WIEBE, S., FRENCH, J., 2010. Definition of drug resistant
epilepsy. Consensus proposal by the ad hoc Task Force of the ILAE Commission on
Therapeutic Strategies Epilepsia 51: 1069-1077.
KWAN, P., SCHACHTER, S.C., BRODIE, M.J., 2011. Drug-resistant epilepsy. N Engl J Med. 365:
919-926.
KUTEYKIN-TEPLYAKOV, K., LUNA-TORTÓS, C., AMBROZIAK, K., LÖSCHER, W., 2010.
Differences in the expression of endogenous efflux transporters in MDR1-transfected versus
wildtype cell lines affect P-glycoprotein mediated drug transport. Br J Pharmacol. 160: 1453-
1463.
LAGAS, J.S., VAN WATERSCHOOT, R.A., VAN TILBURG, V.A., HILLEBRAND, M.J., LANKHEET,
N., ROSING, H., BEIJNEN, J.H., SCHINKEL, A.H., 2009. Brain accumulation of dasatinib is
restricted by P-glycoprotein (ABCB1) and breast cancer resistance protein (ABCG2) and can
be enhanced by elacridar treatment. Clin Cancer Res. 15: 2344-2351.
191

LITERATURVERZEICHNIS
LANKAS, G.R., WISE, L.D., CARTWRIGHT, M.E., PIPPERT, T., UMBENHAUER, D.R., 1998.
Placental P-glycoprotein deficiency enhances susceptibility to chemically induced birth defects
in mice. Reprod Toxicol. 12: 457-463.
LATERRA, J., GOLDSTEIN, G.W., 2000. Ventricular organization of the cerebrospinal fluid: bloodbrain
barrier, brain edema, and hydrocephalus. In Kandel, E.R., Schwartz, J.H., Jessel, T.M.,
editors. Principle of neural science. London: MCGraw-Hill; 1288-1301.
LAZAROWSKI, A., CZORNYJ, L, LUBIENIEKI, F., GIRARDI, E., VAZQUEZ, S., D'GIANO, C., 2007.
ABC transporters during epilepsy and mechanisms underlying multidrug resistance in
refractory epilepsy. Epilepsia 48. Suppl 5: 140-149.
LECHARDEUR, D., SCHERMAN, D., 1995. Functional expression of the P-glycoprotein mdr in
primary cultures of bovine cerebral capillary endothelial cells. Cell Biol Toxicol. 11: 283-293.
LEE, H.S., NAMKOONG, K., KIM, D.H., KIM, K.J., CHEONG, Y.H., KIM, S.S., LEE, W.B., KIM, .KY.,
2004. Hydrogen peroxide-induced alterations of tight junction proteins in bovine brain
microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 68: 231-238.
LEE, J.S., PAULL, K., ALVAREZ, M., HOSE, C., MONKS, A., GREVER, M., FOJO, A.T., BATES,
S.E., 1994. Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates in the National
Cancer Institute drug screen. Mol Pharmacol. 46: 627-638.
LEE, Y.J., MAEDA, J., KUSUHARA, H., OKAUCHI, T., INAJI, M., NAGAI, Y., OBAYASHI, S., NAKAO,
R., SUZUKI, K., SUGIYAMA, Y., SUHARA, T., 2006. In vivo evaluation of P-glycoprotein
function at the blood-brain barrier in nonhuman primates using [11C]verapamil. J Pharmacol
Exp Ther. 316: 647–653.
LESLIE, E.M., DEELEY, R.G., COLE, S.P., 2005. Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein,
MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense. Toxicol Appl Pharmacol. 204: 216-237.
LIM, J.C., WOLPAW, A.J., CALDWELL, M.A., HLADKY, S.B., BARRAND, M.A., 2007. Neural
precursor cell influences on blood-brain barrier characteristics in rat brain endothelial cells.
Brain Res. 1159: 67-76.
LIN, G., GOLDMAN, J.E., 2009. An FGF-responsive astrocyte precursor isolated from the neonatal
forebrain. Glia 57: 592-603.
LIPPINCOTT-SCHWARTZ, J., 1998. The uses of green fluorescent protein in mammalian cells. In
Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols, ed. Chalfie, M., Kain, S.,
243-268. New York: Wiley-Liss.
LIPPINCOTT-SCHWARTZ, J., THERESA H ROBERTS, T.H., HIRSCHBERG, K., 2000. Secretory
Protein Trafficking and Organelle Dynamics in Living Cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 557-
589.
LIU, X.D., LIU, G.Q., 2001. P-glycoprotein regulated transport of glutamate at blood-brain barrier. Acta
Pharmacol Sin. 22: 111-116.
LIU, H., WANG, Y., LI, S., 2007. Advanced delivery of ciclosporin A: present state and perspective.
Expert Opin Drug Deliv. 4: 349-358.
192

LITERATURVERZEICHNIS
LIU, J.Y.W., THOM, M., CATARINO, C.B., MARTINIAN, L., FIGARELLABRANGER, D.,
BARTOLOMEI, F., KOEPP, M., SISODIYA, S.M., 2012. Neuropathology of the blood–brain
barrier and pharmaco-resistance in human epilepsy. Brain. 135: 3115-3133.
LIU, X., CHEN, C., SMITH, B., 2008. Progress in brain permeation evaluation in drug discovery and
development. J Pharmacol Exp Ther 325: 349-356.
LOMBARDO, L., PELLITTERI, R., BALAZY, M., CARDILE, V., 2008. Induction of nuclear receptors
and drug resistance in the brain microvascular endothelial cells treated with antiepileptic
drugs. Curr. Neurovasc. Res. 5: 82-92.
LOO, T.W., CLARKE, D.M., 1995. Membrane topology of a cysteine-less mutant of human P-
glycoprotein. J Biol Chem. 270: 843-848.
LOO, T.W., CLARKE, D.M., 1999. The transmembrane domains of the human multidrug resistance P-
glycoprotein are sufficient to mediate drug binding and trafficking to the cell surface. J Biol
Chem. 274: 24759-2465.
LOPEZ-RAMIREZ, M.A., FISCHER, R., TORRES-BADILLO, C.C., DAVIES, H.A., LOGAN, K.,
PFIZENMAIER, K., MALE, D.K., SHARRACK, B., ROMERO, I.A., 2012. Role of caspases in
cytokine-induced barrier breakdown in human brain endothelial cells. J Immunol. 189: 3130-
3139.
LÖSCHER, W., 1994. Neue Antiepileptika - ein Fortschritt für die Behandlung epileptischer Tiere?
Kleintierpraxis 39: 239-258.
LÖSCHER, W., 2005. Mechanisms of drug resistance. Epileptic Disord. 7 (Suppl. 1): S3-S9.
LÖSCHER, W., BRANDT, C., 2010. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults:
experimental approaches and translational research. Pharmacological Rev. 62: 668-700.
LÖSCHER, W., FREY, H.H., 1984. Kinetics of penetration of common antiepileptics drugs into
cerebrospinal fluid. Epilepsia 25: 346–352.
LÖSCHER, W., LANGER, O., 2010. Imaging of P-glycoprotein function and expression to elucidate
mechanisms of pharmacoresistance in epilepsy. Curr Top Med Chem. 10: 1785-1791.
LÖSCHER, W., POTSCHKA, H., 2002. Role of multidrug transporters in pharmacoresistance to
antiepileptic drugs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301: 7-14.
LÖSCHER W, POTSCHKA, H., 2005a. Role of drug efflux transporters in the brain for drug disposition
and treatment of brain diseases. Prog. Neurobiol. 76: 22-76.
LÖSCHER, W., POTSCHKA, H., 2005b. Drug resistance in brain diseases and the role of drug efflux
transporters. Nat. Rev. Neurosci. 6: 591-602.
LÖSCHER, W., POTSCHKA, H., 2005c. Blood-Brain Barrier Active Efflux Transporters: ATP-Binding
Cassette Gene Family. NeuroRx. 2: 86–98.
LÖSCHER, W., SCHMIDT, D., 2006a. New Horizons in the development of antiepileptic drugs.
Innovative strategies. Epilepsy Res. 69: 183-272.
LÖSCHER, W., SCHMIDT, D., 2006b. Experimental and clinical evidence for loss of effect (tolerance)
during prolonged treatment with antiepileptic drugs. Epilepsia 47: 1253-1284.
LÖSCHER, W., SCHMIDT, D., 2011 Modern antiepileptic drug development has failed to deliver: ways
out of the current dilemma. Epilepsia 52: 657– 678.
193

LITERATURVERZEICHNIS
LÖSCHER, W., SILLS, G.J., 2007. Drug resistance in epilepsy: why is a simple explanation not
enough? Epilepsia 48: 2370-2372.
LÖSCHER, W., LUNA-TORTOS, C., RÖMERMANN, K., FEDROWITZ, M., 2011. Do ATP-binding
cassette transporters cause pharmacoresistance in epilepsy? Problems and approaches in
determining which antiepileptic drugs are affected. Curr Pharm Des. 17: 2808-2828.
LUNA-TORTÓS, C., FEDROWITZ, M., LÖSCHER, W., 2008: Several major antiepileptic drugs are
substrates for human P-glycoprotein. Neuropharmacology 55: 1364-1375.
LUNA-TORTÓS, C., FEDROWITZ, M., LÖSCHER, W., 2010. Evaluation of transport of common
antiepileptic drugs by human multidrug resistance-associated proteins (MRP1, 2 and 5) that
are overexpressed in pharmacoresistant epilepsy. Neuropharmacology. 58: 1019-1032.
LUNA-TORTÓS, C., RAMBECK, B., JÜRGENS, U., LÖSCHER, W., 2009. The Antiepileptic Drug
Topiramate is a Substrate for Human P-glycoprotein but Not Multidrug Resistance Proteins.
Pharm. Res. 26: 2464-2470.
LUNDQUIST, S., RENFTEL, M., 2002. The use of in vitro cell culture models for mechanistic studies
and as permeability screens for the blood-brain barrier in the pharmaceutical industry--
background and current status in the drug discovery process. Vascul Pharmacol. 38: 355-64.
LUO, G., CUNNINGHAM, M., KIM, S., BURN, T., LIN, J., SINZ, M., HAMILTON, G., RIZZO, C.,
JOLLEY, S., GILBERT, D., DOWNEY, A., MUDRA, D., GRAHAM, R., CARROLL, K., XIE, J.,
MADAN, A., PARKINSON, A., CHRIST, D., SELLING, B., LECLUYSE, E., GAN, L.S., 2002.
CYP3A4 induction by drugs: correlation between a pregnane X receptor reporter gene assay
and CYP3A4 expression in human hepatocytes. Drug Metab. Dispos. 30: 795–804.
MAHAR DOAN, K.M., HUMPHREYS, J.E., WEBSTER, L.O., WRING, S.A., SHAMPINE, L.J.,
SERABJIT-SINGH, C.J., ADKISON, K.K., POLLI, J.W., 2002. Passive permeability and P-
glycoprotein-mediated efflux differentiate central nervous system (CNS) and non-CNS
marketed drugs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 303: 1029-1037.
MAINES, L.W., ANTONETTI, D.A., WOLPERT, E.B., SMITH, C.D., 2005. Evaluation of the role of P-
glycoprotein in the uptake of paroxetine, clozapine, phenytoin and carbamazapine by bovine
retinal endothelial cells. Neuropharmacology 49: 610-617.
MARCHI, N., GUISO, G, RIZZI, M., PIRKER, S., NOVAK, K., CZECH, T., BAUMGARTNER, C.,
JANIGRO, D., CACCIA, S., VEZZANI, A., 2005. A pilot study on brain-to-plasma partition of
10,11-dyhydro-10-hydroxy-5Hdibenzo(b,f)azepine-5-carboxamide and MDR1 brain expression
in epilepsy patients not responding to oxcarbazepine. Epilepsia 46: 1613-1619.
MARCHI, N., HALLENE, K.L., KIGHT, K.M., CUCULLO, L., MODDEL, G., BINGAMAN, W., DINI, G.,
VEZZANI, A., JANIGRO, D., 2004. Significance of MDR1 and multiple drug resistance in
refractory human epileptic brain. BMC Med. 2: 37.
MARTIN, P., RILEY, R., BACK, D.J., OWEN, A., 2008. Comparison of the induction profile for drug
disposition proteins by typical nuclear receptor activators in human hepatic and intestinal cells.
Br. J. Pharmacol. 153: 805-819.
194

LITERATURVERZEICHNIS
MARTIN-FACKLAM, M., BURHENNE, J., DING, R., FRICKER, R., MIKUS, G., WALTER-SACK, I.,
W.E., 2002. Dose-dependent increase of saquinavir bioavailability by the pharmaceutic aid
cremophor EL. Br J Clin Pharmacol. 53: 576–581.
MARZOLINI, C., PAUS, E., BUCLIN, T., KIM, R.B., 2004a. Polymorphisms in human MDR1 (Pglycoprotein):
recent advances and clinical relevance. Clin. Pharmacol. Ther. 75: 13-33.
MCCAFFREY, G., STAATZ, W.D., SANCHEZ-COVARRUBIAS, L., FINCH, J.D., DEMARCO, K.,
LARACUENTE, M.L., RONALDSON, P.T., DAVIS, T.P., 2012. P-glycoprotein trafficking at the
blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. J Neurochem. 122: 962-
975.
MCDONALD, R.J., WHITE, N.M., 1993. A triple dissociation of memory systems: hippocampus,
amygdala, and dorsal striatum. Behav Neurosci. 107: 3-22.
MERTSCH, K., MAAS, J., 2002. Blood–brain barrier penetration and drug development from an
industrial point of view. Curr. Med. Chem. Central Nerv. Syst. Agents 2: 187–201.
MIKKAICHI, T., SUZUKI, T., TANEMOTO, M., ITO, S., ABE, T., 2004. The organic anion transporter
(OATP) family. Drug Metab Pharmacokinet. 19: 171-179.
MILLER, D.S., 2010. Regulation of P-glycoprotein and other ABC drug transporters at the blood-brain
barrier. Trends Pharmacol.Sci. 31: 246-254.
MILLER, D.S., BAUER, B., HARTZ, A.M., 2008. Modulation of P-glycoprotein at the blood-brain
barrier: opportunities to improve CNS pharmacotherapy. Pharmacol.Rev. 60: 196-209.
MILLER, T. P., GROGAN, T.M., DALTON, W.S., SPIER, C.M., SCHEPER, R.J., SALMON, S.E.,
1991. P-glycoprotein expression in malignant lymphoma and reversal of clinical drug
resistance with chemotherapy plus high-dose verapamil. J Clin Oncol 9: 17-24.
NAKAGAWA, S., DELI, M.A., KAWAGUCHI, H., SHIMIZUDANI, T., SHIMONO, T., KITTEL, A.,
TANAKA, K., NIWA, M., 2009. A new blood–brain barrier model using primary rat brain
endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem. Int. 54: 253–263.
NAKAGAWA, S., DELI, M.A., NAKAO, S., HONDA, M., HAYASHI, K., NAKAOKE, R., KATAOKA, Y.,
NIWA, M., 2007. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary
cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27: 687-694.
NALLANI, S.C., GLAUSER, T.A., HARIPARSAD, N., SETCHELL, K., BUCKLEY, D.J., BUCKLEY,
A.R., DESAI, P.B., 2003. Dosedependent induction of Cytochrome P450 (CYP) 3A4 and
activation of pregnane X receptor by topiramate. Epilepsia 44: 1521-1528.
NARANG, V.S., FRAGA, C., KUMAR, N., SHEN, J., THROM, S., STEWART, C.F., WATERS, C.M.,
2008. Dexamethasone increases expression and activity of multidrug resistance transporters
at the rat blood-brain barrier. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295: C440-450.
NEUMANN, D., 2010. Modulation von Multidrug-Transportern durch Antiepileptika. Diplomarbeit,
Durchführung der Experimente an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
NERVI, P., LI-BLATTER, X., AANISMAA, P., SEELIG, A., 2010. P-glycoprotein substrate transport
assessed by comparing cellular and vesicular ATPase activity. Biochim Biophys Acta 1798:
515-525.
195

LITERATURVERZEICHNIS
NICOLAZZO, J.A., CHARMAN, S.A., CHARMAN, W.N., 2006. Methods to assess drug permeability
across the blood-brain barrier. J Pharm Pharmacol. 58:281-293.
NIES, A. T., JEDLITSCHKY, G., KONIG, J., HEROLD-MENDE, C., STEINER, H.H., SCHMITT, H.P.,
KEPPLER, D., 2004. Expression and immunolocalization of the multidrug resistance proteins,
MRP1-MRP6 (ABCC1-ABCC6), in human brain. Neuroscience 129: 349-360.
NITZ, T., EISENBLATTER, T., PSATHAKI, K., GALLA, H.J., 2003. Serumderived factors weaken the
barrier properties of cultured porcine brain capillary endothelial cells in vitro. Brain Res. 981:
30–40.
NOBILI, S., LANDINI, I., GIGLIONI, B., MINI, E., 2006. Pharmacological strategies for overcoming
multidrug resistance. Curr Drug Targets 7: 861-879.
NOLTE, M.W., LÖSCHER, W., GERNERT, M., 2006. Pedunculopontine neurons are involved in
network changes in the kindling model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol. Dis. 23: 206-218.
OTT, M., FRICKER, G., BAUER, B., 2009. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the
blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J. Pharmacol. Exp.
Ther. 329:141-149.
OWEN, A., GOLDRING, C., MORGAN, P., PARK, B.K., PIRMOHAMED, M., 2006. Induction of P-
glycoprotein in lymphocytes by carbamazepine and rifampicin: the role of nuclear hormone
response elements. Br J Clin Pharmacol. 62: 237-242.
OWEN, A., PIRMOHAMED, M., TETTEY, J.N., MORGAN, P., CHADWICK, D., PARK, B.K., 2001.
Carbamazepine is not a substrate for P-glycoprotein. Br. J. Clin. Pharmacol. 51: 345-349.
PALLIS, M., TURZANSKI, J., HIGASHI, Y., RUSSELL, N., 2002. P-glycoprotein in acute myeloid
leukaemia: therapeutic implications of ist association with both a multidrug-resistant and an
apoptosis-resistant phenotype. Leuk Lymphoma 43: 1221–1228.
PARDRIDGE, W.M., 2003. Blood-brain barrier drug targeting: The future of brain drug development.
Mol Interv. 3: 90-105.
PARK, K.W., HWANG, K.K., CHO, H.J., HUR, J., YANG, H.M., YOON, C.H., KANG, H.J., OH, B.H.,
PARK, Y.B., KIM, H.S., 2008. Simvastatin enhances endothelial differentiation of peripheral
blood mononuclear cells in hypercholesterolemic patients and induces pro-angiogenic
cytokine IL-8 secretion from monocytes. Clin Chim Acta. 388: 156-166.
PASCUSSI, J.M., DROCOURT, L., FABRE, J.M., MAUREL, P., VILAREM, M.J., 2000.
Dexamethasone induces pregnane X receptor and retinoid X receptor-alpha expression in
human hepatocytes: synergistic increase of CYP3A4 induction by pregnane X receptor
activators. Mol. Pharmacol. 58: 361-372.
PATI, S., ALEXOPOULOS, A.V., 2010. Pharmacoresistant epilepsy: From pathogenesis to current
and emerging therapies. Cleve Clin J Med. 77: 457-467.
PATSALOS, P.N., BERRY, D.J., BOURGEOIS, B.F., CLOYD, J.C., GLAUSER, T.A.,
JOHANNESSEN, S.I., LEPPIK, I.E., TOMSON, T., PERUCCA, E., 2008. Antiepileptic drugs--
best practice guidelines for therapeutic drug monitoring: a position paper by the
subcommission on therapeutic drug monitoring, ILAE Commission on Therapeutic Strategies.
Epilepsia 49: 1239-1276.
196

LITERATURVERZEICHNIS
PENG, K. C., CLUZEAUD, F., BENS, M., DUONG VAN HUYEN, J.P., WIOLAND, M.A., LACAVE, R.,
VANDEWALLE, A., 1999. Tissue and cell distribution of the multidrug resistance-associated
protein (MRP) in mouse intestine and kidney. J Histochem Cytochem. 47: 757- 768.
PEPPIATT, C.M., HOWARTH, C., MOBBS, P., ATTWELL, D., 2006. Bidirectional control of CNS
capillary diameter by pericytes. Nature 443: 700-704.
PERRIÉRE, N., DEMEUSE, P.H., GARCIA, E., RÉGINA, A., DEBRAY, M., ANDREUX, J.P.,
COUVREUR, P., SCHERRMANN, J.M., TEMSAMANI, J., COURAUD, P.O., DELI, M.A.,
ROUX, F., 2005. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures.
Effect on the expression of bloodbrain barrier-specific properties. J Neurochem. 93: 279-289.
PERRIÈRE, N., YOUSIF, S., CAZAUBON, S., CHAVEROT, N., BOURASSET, F., CISTERNINO, S.,
DECLÈVES, X., HORI, S., TERASAKI, T., DELI, M., SCHERRMANN, J.M., TEMSAMANI, J.,
ROUX, F., COURAUD, P.O., 2007. A functional in vitro model of rat blood–brain barrier for
molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150: 1–13.
PETERSON, D., 2012. Blood-Brain Barrier. Nature Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing
Group. Published Online: 15 AUG 2012. http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refIda0000023.html.
PITKÄNEN, A., LUKASIUK, K., 2011. Molecular biomarkers of epileptogenesis. Biomark Med. 5: 629–
633.
PIZZAGALLI, F., HAGENBUCH, B., STIEGER, B., KLENK, U., FOLKERS, G., MEIER, P.J., 2002.
Identification of a novel human organic anion transporting polypeptide as a high affinity
thyroxine transporter. Mol Endocrinol. 16: 2283-2296.
POLLER, B., DREWE, J., KRÄHENBÜHL, S., HUWYLER, J., GUTMANN, H., 2010. Regulation of
BCRP (ABCG2) and P-glycoprotein (ABCB1) by cytokines in a model of the human bloodbrain
barrier. Cell Mol Neurobiol. 30: 63-70.
POLLER, B., GUTMANN, H., KRAHENBUHL, S., WEKSLER, B., ROMERO, I.,COURAUD, P.O.,
TUFFIN, G., DREWE, J., HUWYLER, J., 2008. The human brain endothelial cell line
hCMEC/D3 as a human blood–brain barrier model for drug transport studies. J. Neurochem.
107: 1358–1368.
POLLI, J.W., WRING, S.A., HUMPHREYS, J.E., HUANG, L., MORGAN, J.B., WEBSTER, L.O.,
SERABJIT-SINGH, C.S., 2001. Rational use of in vitro P-glycoprotein assays in drug
discovery. J Pharmacol Exp Ther. 299: 620-628.
REES D.C., JOHNSON E., LEWINSON O., 2009. ABC transporters: the power to change. Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 10: 218–227.
REGESTA, G., TANGANELLI, P., 1999. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant
epilepsies. Epilepsy Res. 34: 109–122.
RÉGINA, A., KOMAN, A., PICIOTTI, M., EL HAFNY, B., CENTER, M.S., BERGMANN, R.,
COURAUD, P.O., ROUX, F., 1998. MRP1 multidrug-resistance associated protein and P-
Glycoprotein expression in rat brain microvessel endothelial cells. J. Neurochem. 71: 705-715.
197

LITERATURVERZEICHNIS
RÉGINA, A., ROMERO, I.A., GREENWOOD, J., ADAMSON, P., BOURRE, J.M., COURAUD, P.O.,
ROUX, F., 1999. Dexamethasone regulation of P-glycoprotein activity in an immortalized rat
brain endothelial cell line, GPNT. J. Neurochem. 73: 1954-63.
REINHARDT, C.A., GLOOR, S.M., 1997. Co-culture blood-brain barrier models and their use for
pharmatoxicological screening. Toxicol In Vitro. 11: 513-518.
REMY, S., BECK, H., 2006. Molecular and cellular mechanisms of pharmacoresistance in epilepsy.
Brain 129: 18-35.
REMY, S., GABRIEL, S., URBAN, B.W., DIETRICH, D., LEHMANN, T.N., ELGER, C.E.,
HEINEMANN, U., BECK, H., 2003. A novel mechanism underlying drug resistance in chronic
epilepsy. Ann. Neurol. 53: 469-479.
RENES, J., DE VRIES, E.G., NIENHUIS, E.F., JANSEN, P.L., MULLER, M., 1999. ATP- and
glutathione-dependent transport of chemotherapeutic drugs by the multidrug resistance
protein MRP1. Br J Pharmacol. 126: 681-688.
REUSS, B., DONO, R., UNSICKER K., 2003. Functions of fibroblast growth factor (FGF)-2 and FGF-5
in astroglial differentiation and blood-brain barrier permeability: Evidence from mouse mutants.
J Neurosci. 23: 6404-6412.
RIZZI, M., CACCIA, S., GUISO, G., RICHICHI, C., GORTER, J.A., ARONICA, E., ALIPRANDI, M.,
BAGNATI, R., FANELLI, R., D'INCALCI, M., SAMANIN, R., VEZZANI, A., 2002. Limbic
seizures induce P-glycoprotein in rodent brain: functional implications for pharmacoresistance.
J. Neurosci. 22: 5833-5839.
ROBEY, R.W., HONJO, Y., VAN DE, L.A., MIYAKE, K., REGIS, J.T., LITMAN, T., BATES, S.E., 2001.
A functional assay for detection of the mitoxantrone resistance protein, MXR (ABCG2).
Biochim.Biophys.Acta 1512: 171-182.
ROBEY, R.W., LAZAROWSKI, A., BATES, S.E., 2008b. Pgp- a clinical target in drug-refractory
epilepsy? Mol. Pharmacol. 73: 1343-1346.
ROBEY, R.W., SHUKLA, S., FINLEY, E.M., OLDHAM, R.K., BARNETT, D., AMBUDKAR, S.V., FOJO,
T., BATES, S.E., 2008a. Inhibition of P-glycoprotein (ABCB1)- and multidrug resistanceassociated
protein 1 (ABCC1)-mediated transport by the orally administered inhibitor, CBT-
1(IST). Biochem Pharmacol. 75: 1302-12.
ROBEY, R. W., STEADMAN, K. , POLGAR, O., MORISAKI, K., BLAYNEY, M., MISTRY, P., BATES,
S.E., 2004. Pheophorbide a is a specific probe for ABCG2 function and inhibition. Cancer Res.
64: 1242-1246.
ROBEY, R.W., TO, K.K.K, POLGAR, O., DOHSE, M., FETSCH, P., DEAN, M., BATES, S.E., 2009.
ABCG2: a perspective. Adv Drug Deliv Rev. 61: 3-13.
ROGAWSKI, M.A., LÖSCHER, W., 2004. The neurobiology of antiepileptic drugs for the treatment of
nonepileptic conditions. Nat. Med. 10: 685-692.
ROUX, F., COURAUD, P.O., 2005. Rat Brain Endothelial Cell Lines for the Study of Blood–Brain
Barrier Permeability and Transport Functions. Cell. Mol. Neurobiol. 25: 41-58.
ROUX, F., DURIEU-TRAUTMANN, O., CHAVEROT, N., CLAIRE, M., MAILLY, P., BOURRE, J.M.,
STROSBERG, A.D., COURAUD, P.O., 1994. Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase
198

LITERATURVERZEICHNIS
and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells. J.
Cell. Physiol. 159: 101-113.
RUBIN, L.L., HALL, D.E., PORTER, S., BARBU, K., CANNON, C., HORNER, H.C., JANATPOUR, M.,
LIAW, C.W., MANNING, K., MORALES, J., TANNER, L.I., TOMASELLI, K.J., BARD, F., 1991.
A cell culture model of the blood-brain barrier. J Cell Biol. 115: 1725-1735.
SAKAEDA, T., NAKAMURA, T., OKUMURA, K., 2003. Pharmacogenetics of MDR1 and ist impact on
the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs. Pharmacogenomics 4: 397–410.
SANDER, J.W., 2003. The epidemiology of epilepsy revisited. Curr Opin Neurol. 16: 165-170.
SAWCHUK, R.J., ELMQUIST, W.F., 2000. Microdialysis in the study of drug transporters in the CNS.
Adv Drug Deliv Rev. 45: 295–307.
SCHERRMANN, J.M., 2005. Expression and function of multidrug resistance transporters at the
blood-brain barriers. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1: 233-46.
SCHIERA, G., BONO, E., RAFFA, M.P., GALLO, A., PITARRESI, G.L., DI LIEGRO, I., SAVETTIERI,
G., 2003. Synergistic effects of neurons and astrocytes on the differentiation of brain capillary
endothelial cells in culture. J Cell Mol Med. 7: 165-170.
SCHINKEL, A.H., 1999. P-Glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev.
6: 179-194.
SCHINKEL, A.H., JONKER, J.W., 2003. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding
cassette (ABC) family: an overview. Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 3-29.
SCHINKEL, A.H., SMIT, J.J.M., VAN TELLINGEN, O., BEIJNEN, J.H., WAGENAAR, E., VAN
DEEMTER, L., MOL, C.A.A.M., VAN DER VALK, M.A., ROBANUS-MAANDAG, E.C., TE
RIELE, H.P.J., BERNS, A.J.M., BORST, P., 1994. Disruption of the mouse mdr1a P-
glycoprotein gene leads to a deficiency in the blood-brain barrier and to increased sensitivity to
drugs. Cell 77: 491-502.
SCHINKEL, A.H., WAGENAAR, E., VAN DEEMTER, L., MOL, C.A.A.M., BORST, P., 1995. Absence
of the mdrla P-Glycoprotein in Mice Affects Tissue Distribution and Pharmacokinetics of
Dexamethasone, Digoxin, and Cyclosporin A. J. Clin. Invest. 96: 1698-1705.
SCHINKEL, A.H., WAGENAAR, E., MOL, C.A.A.M., VAN DEEMTER, L., 1996. P-glycoprotein in the
blood-brain barrier of mice influences the brain penetration and pharmacological activity of
many drugs. J. Clin. Invest. 97: 2517-2524.
SCHMIDT, D., LÖSCHER, W., 2005. Drug resistance in epilepsy: putative neurobiologic and clinical
mechanisms. Epilepsia 46: 858-77.
SCHMIDT, D., LÖSCHER, W., 2009. New developments in antiepileptic drug resistance: an
integrative view. Epilepsy Curr. 9: 47-52.
SCHUETZ, E.G., BECK, W.T., SCHUETZ, J.D., 1996. Modulators and substrates of P-glycoprotein
and cytochrome P4503A coordinately up-regulate these proteins in human colon carcinoma
cells. Mol. Pharmacol. 49: 311-318.
SCHWAB, M., EICHELBAUM, M., FROMM, M.F., 2003a. Genetic polymorphisms of the human MDR1
drug transporter. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43: 285-307.
199

LITERATURVERZEICHNIS
SCHWAB, D., FISCHER, H., TABATABAEI, A., POLI, S., HUWYLER, J., 2003b. Comparison of in
vitro P-glycoprotein screening assays: recommendations for their use in drug discovery. J Med
Chem. 46: 1716-25.
SCHWARTZ, A., TRIGGLE, D.J., 1984. Cellular action of calcium channel blocking drugs. Annu Rev
Med. 35: 325-39.
SEEGERS, U., POTSCHKA, H., LÖSCHER, W., 2002. Transient increase of Pglycoprotein expression
in endothelium and parenchyma of limbic brain regions in the kainate model of temporal lobe
epilepsy. Epilepsy Res. 51: 257-268.
SHAPIRO, A.B., LING, V., 1995. Using purified P-glycoprotein to understand multidrug resistance. J
Bioenerg Biomembr. 27: 7-13.
SHIRASAKA, Y., SAKANE, T., YAMASHITA, S., 2008. Effect of P-glycoprotein expression levels on
the concentration-dependent permeability of drugs to the cell membrane. J. Pharm. Sci. 97:
553–565.
SIDDIQUI, A., KERB, R., WEALE, M.E., BRINKMANN, U., SMITH, A., GOLDSTEIN, D.B.,WOOD,
N.W., SISODIYA, S.M., 2003. Association of multidrug resistance in epilepsy with a
polymorphism in the drug-transporter gene ABCB1. N. Engl. J. Med. 348: 1442–1448.
SIKIC, B.I., FISHER, G.A., LUM, B.L., HALSEY, J., BEKETIC-ORESKOVIC, L., CHEN, G., 1997.
Modulation and prevention of multidrug resistance by inhibitors of P-glycoprotein. Cancer
Chemother Pharmacol., 40 Suppl: S13-9.
SILVA, G.A., 2006. Neuroscience nanotechnology: progress, opportunities and challenges. Nat Rev
Neurosci. 7: 65-74.
SIMONATO, M., LÖSCHER, W., COLE, A.J., DUDEK, F.E., ENGEL, J. JR., KAMINSKI, R.M., LOEB,
J.A., SCHARFMAN, H., STALEY, K.J., VELÍŠEK, L., KLITGAARD, H., 2012. Finding a better
drug for epilepsy: Preclinical screening strategies and experimental trial design. Epilepsia. 53:
1860-1867.
SISODIYA, S. M., 2003. Mechanisms of antiepileptic drug resistance. Curr Opin Neurol. 16: 197-201.
SISODIYA, S.M., SANJAY, M., HEFFERNAN, J., SQUIER, M.V., 1999. Over-expression of P-
glycoprotein in malformations of cortical development. Neuroreport 10: 3437-3441.
SZAKÁCS, G., JAKAB, K., ANTAL, F., SARKADI, B., 1998. Diagnostics of multidrug resistance in
cancer. Pathol Oncol Res. 4: 251-257.
SLATER, L.M., SWEET, P., STUPECKY, M., WETZEL, M.W., GUPTA, S., 1986. Cyclosporin A
corrects daunorubicin resistance in Ehrlich ascites carcinoma. Br J Cancer 54: 235-238.
SMIT, J.W., HUISMAN ,M.T., VAN TELLINGEN, O., WILTSHIRE, H.R., SCHINKEL, A.H., 1999.
Absence or pharmacological blocking of placental P-glycoprotein profoundly increases fetal
drug exposure. J Clin Invest. 104: 1441-1447.
SPENCER, S.S., 2002. When should temporal-lobe epilepsy be treated surgically? Lancet Neurol. 1:
375–382.
SPERLING, M.R., 2004. The consequence of uncontrolled epilepsy. CNS Spectr. 9: 98-99.
STANNESS, K.A., GUATTEO, E., JANIGRO, D., 1996. A dynamic model of the blood-brain barrier “in
vitro.” Neurotoxicology 17: 481–496.
200

LITERATURVERZEICHNIS
STANNESS, K.A., NEUMAIER, J.F., SEXTON, T.J., GRANT, G.A., EMMI, A., MARIS, D.O.,
JANIGRO, D., 1999. A new model of the blood-brain barrier: co-culture of neuronal,
endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport 10: 3725-3731.
STANNESS, K.A., WESTRUM, L.E., FORNACIARI, E., MASCAGNI, P., NELSON, J.A., STENGLEIN,
S.G., MYERS, T., JANIGRO, D., 1997. Morphological and functional characterization of an in
vitro blood-brain barrier model. Brain Res. 771: 329–342.
STEFAN, H., 2009. Hirntumoren und Epilepsie. Z. Epileptol. 22: 65-71.
STRZELCZYK, A., REESE J.P., DODEL R., HAMER H.M., 2008. Kosten der Epilepsie: eine
systematische Überprüfung. Pharmacoeconomics. 26: 463-476.
STRZELCZYK, A., NICKOLAY, T., BAUER, S., HAAG, A., KNAKE, S., OERTEL, W.H., REIF, P.S.,
ROSENOW, F., REESE, J.P., DODEL, R., HAMER, H.M., 2012. Evaluation of health-care
utilization among adult patients with epilepsy in Germany. Epilepsy Behav. 23: 451-457.
SUGIYAMA, D., KUSUHARA, H., LEE, Y.J., SUGIYAMA, Y., 2003. Involvement of multidrug
resistance associated protein 1 (Mrp1) in the efflux transport of 17beta estradiol-D-17betaglucuronide
(E217betaG) across the blood-brain barrier. Pharm Res. 20: 1394-1400.
SYNOLD, T.W., DUSSAULT, I., FORMAN, B.M., 2001. The orphan nuclear receptor SXR coordinately
regulates drug metabolism and efflux. Nat Med. 7: 584-590.
TAI, L.M., P. REDDY, P.S., LOPEZ-RAMIREZ, M.A., DAVIES, H.A., MALE, A.D.K., A. LOUGHLIN,
A.J., ROMERO, I.A., 2009. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human
brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine
123. Brain Res. 1292: 14-24.
TAIPALENSUU, J., TAVELIN, S., LAZOROVA, L., SVENSSON, A.C., ARTURSSON, P., 2004.
Exploring the quantitative relationship between the level of MDR1 transcript, protein and
function using digoxin as a marker of MDR1-dependent drug efflux activity. Eur J Pharm Sci.
21: 69-75.
TAKAKURA, Y., AUDUS, K.L., BORCHARDT, R.T., 1991. Blood-brain barrier: transport studies in
isolated brain capillaries and in cultured brain endothelial cells. Adv. Pharmacol. 22: 137-165.
TANG, F., OUYANG, H., YANG, J.Z., BORCHARDT, R.T., 2004. Bidirektionalen Transport von
Rhodamin 123 und Hoechst 33342, Fluoreszenzsonden der Bindungsstellen auf P-
Glycoprotein, über MDCK-Zellmonolayer MDR1. J Pharm Sci. 93: 1185-94.
TANIGAWARA, Y., 2000. Role of P-glycoprotein in drug disposition. Ther Drug Monit. 22: 137–140.
TAVAKOLI, M., BAREKATAIN, M., DOUST, H.T., MOLAVI, H., NOURI, R.K., MORADI, A., MEHVARI,
J., ZARE, M., 2011. Cognitive impairments in patients with intractable temporal lobe epilepsy.
J Res Med Sci. 16: 1466-1472.
THANABALASUNDARAM, G., PIEPER, C., LISCHPER, M., GALLA, H.J., 2010. Regulation of the
blood-brain barrier integrity by pericytes via matrix metalloproteinases mediated activation of
vascular endothelial growth factor in vitro. Brain Res. 1347: 1-10.
THEODORE, W.H., EPSTEIN, L., GAILLARD, W.D., SHINNAR, S., WAINWRIGHT, M.S.,
JACOBSON, S., 2008. Human herpes virus 6B: a possible role in epilepsy? Epilepsia 49:
1828-1837.
201

LITERATURVERZEICHNIS
THIEBAUT, F., TSURUO, T., HAMADA, H., GOTTESMAN, M.M., PASTAN, I., WILLINGHAM, M.C.,
1987. Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal
human tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7735–7738.
THOMAS, W.E., 1999. Brain macrophages: on the role of pericytes and perivascular cells. Brain Res
Rev. 31: 42-57.
THOMAS, H., COLEY, H.M., 2003. Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the
clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein. Cancer Control 10: 159 –165.
TIMSIT, Y.E., NEGISHI, M., 2007. CAR and PXR: the xenobiotic-sensing receptors. Steroids 72: 231-
46.
TISHLER, D.M., WEINBERG, K.I., HINTON, D.R., BARBARO, N., ANNETT, G.M., RAFFEL, C., 1995.
MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia 36: 1-
6.
TROUTMAN, M.D., THAKKER, D.R., 2003. Rhodamine 123 requires carrier-mediated influx for its
activity as a P-glycoprotein substrate in Caco-2 cells. Pharm Res. 20: 1192-9.
TSUJI, A., TAMAI, I., 1999. Carrier-mediated or specialized transport of drugs across the bloodbrain
barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36: 277-290.
URICH, E., LAZIC, S.E., MOLNOS, J., WELLS, I., FRESKGÅRD, P.O., 2012. Transcriptional profiling
of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain
barrier models. PloS One. 7(5):e38149.
VAN DORPE, S., BRONSELAER, A., NIELANDT, J., STALMANS, S., WYNENDAELE, E.,
AUDENAERT, K., VAN DE WIELE, C., BURVENICH, C., PEREMANS, K., HSUCHOU, H., DE
TRÉ, G., DE SPIEGELEER, B., 2012. Brainpeps: the blood-brain barrier peptide database.
Brain Struct Funct. 217: 687-718.
VAN VLIET, E.A., VAN SCHAIK, R., EDELBROEK, P.M., REDEKER, S., ARONICA, E., WADMAN,
W.J., MARCHI, N, VEZZANI, A., GORTER, J.A., 2006. Inhibition of the multidrug transporter
P-glycoprotein improves seizure control in phenytoin-treated chronic epileptic rats. Epilepsia.
47: 672-80.
VAN VLIET, E.A., VAN SCHAIK, R., EDELBROEK, P.M., VOSKUYL, R.A., REDEKER, S., ARONICA,
E., WADMAN, W.J., GORTER, J.A., 2007. Region-specific overexpression of P-glycoprotein
at the blood-brain barrier affects brain uptake of phenytoin in epileptic rats. J Pharmacol Exp
Ther. 322: 141–147.
VANTELON, N., RIOUX-BILAN, A., INGRAND, S., PAIN, S., PAGE, G., GUILLARD, O., BARRIER, L.,
PIRIOU, A., FAUCONNEAU, B., 2007. Regulation of initiation factors controlling protein
synthesis on cultured astrocytes in lactic acid-induced stress. Eur J Neurosci. 26: 689-700.
VERGONI, A.V., TOSI, G., TACCHI, R., VANDELLI, M.A., BERTOLINI, A., COSTANTINO, L., 2009.
Nanoparticles as drug delivery agents specific for CNS: in vivo biodistribution. Nanomedicine
5: 369-377.
VOLK, H.A., BURKHARDT, K., POTSCHKA, H., CHEN, J., BECKER, A., LÖSCHER, W., 2004a.
Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after
limbic seizures. Neuroscience 123: 751–759.
202

LITERATURVERZEICHNIS
VOLK, H.A., LÖSCHER, W., 2005. Multidrug resistance in epilepsy: rats with drug-resistant seizures
exhibit enhanced brain expression of P-glycoprotein compared with rats with drug-responsive
seizures. Brain 128: 1358-1368.
VOLK, H., POTSCHKA, H., LÖSCHER, W., 2005. Immunohistochemial localization of P-glycoprotein
in rat brain and detection of its increased expression by seizures are sensitive to fixation and
staining variables. J. Histochem. Cytochem. 53: 517–531.
VONCK, K., HERDT, V.D., SPRENGERS, M., BEN-MENACHEM, E., 2012. Neurostimulation for
epilepsy. Handb Clin Neurol. 108: 955-70.
VU, K., WEKSLER, B., ROMERO, I., COURAUD, P.O., GELLI, A., 2009. Immortalized human brain
endothelial cell line HCMEC/D3 as a model of the blood-brain barrier facilitates in vitro studies
of central nervous system infection by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 8: 1803-
1807.
WANG, H., LECLUYSE, E.L., 2003. Role of orphan nuclear receptors in the regulation of drugmetabolising
enzymes. Clin. Pharmacokinet. 42: 1331-1357.
WEISS, J., KERPEN, C.J., LINDENMAIER, H., DORMANN, S.M., HAEFELI, W.E., 2003. Interaction
of antiepileptic drugs with human P-glycoprotein in vitro. J Pharmacol Exp Ther. 307: 262-7.
WEKSLER, B.B., SUBILEAU, E.A., PERRIERE, N., CHARNEAU, P., HOLLOWAY, K., LEVEQUE, M.,
TRICOIRE-LEIGNEL, H., NICOTRA, A., BOURDOULOUS, S., TUROWSKI, P., MALE, D.K.,
ROUX, F., GREENWOOD, J., ROMERO, I.A., COURAUD, P.O., 2005. Blood–brain barrierspecific
properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19: 1872–1874.
WEN, T., LIU, Y.C., YANG, H.W., LIU, H.Y., LIU, X.D., WANG, G.J., XIE, L., 2008. Effect of 21-day
exposure of phenobarbital, carbamazepine and phenytoin on P-glycoprotein expression and
activity in the rat brain. J. Neurol. Sci. 270: 99-106.
WHO, 2005. Atlas: Epilepsy care in the world. Geneva, Switzerland.
WILLIS, C.L., TAYLOR, G.L., RAY, D.E., 2007. Microvascular Pgp expression at the blood-brain
barrier following focal astrocyte loss and at the fenestrated vasculature of the area postrema.
Brain Res. 1173: 126-136.
WOLBURG, H., NEUHAUS, J., KNIESEL, U., KRAUß, B., SCHMID, E.M., ÖCALAN, M., FARRELL,
C., RISAU, W., 1994. Modulation of tight junction structure in blood-brain endothelial cells.
Effects of tissue culture, second messengers and cocultured astrocytes. J Cell Sci. 107: 1347-
1357.
WU, C., SHARAN, A.D., 2012. Neurostimulation for the Treatment of Epilepsy: A Review of Current
Surgical Interventions. Neuromodulation Sep 4. doi: 10.1111/j.1525-1403.2012.00501.x.
XU, C., LI, C.Y., KONG, A.N., 2005. Induction of phase I, II and III drug metabolism/transport by
xenobiotics. Arch. Pharm. Res. 28: 249-268.
YANG, H.W., LIU, H.Y., LIU, X., ZHANG, D.M., LIU, Y.C., LIU, X.D., WANG, G.J., XIE, L., 2008.
Increased P-glycoprotein function and level after long-term exposure of four antiepileptic drugs
to rat brain microvascular endothelial cells in vitro. Neurosci. Lett. 434: 299-303.
YARMOLINSKY, M.B., DE LA HABA,G.L., 1959 . Inhibition by puromycin of amino acid incorporation
into protein. Proc . Natl . Acad. Sci. U. S. A. 45: 1721.
203

LITERATURVERZEICHNIS
YU, D.K., 1999. The contribution of P-glycoprotein to pharmacokinetic drug-drug interactions. J Clin
Pharmacol. 39: 1203-1211.
YUMOTO, R., MURAKAMI, T., NAKAMOTO, Y., HASEGAWA, R., NAGAI, J., TAKANO, M., 1999.
Transport of rhodamine 123, a P-glycoprotein substrate, across rat intestine and Caco-2 cell
monolayers in the presence of cytochrome P-450 3A-related compounds. J Pharmacol Exp
Ther. 289: 149-55.
ZHANG, C., KWAN, P., ZUO, Z., BAUM, L., 2010. In vitro concentration dependent transport of
phenytoin and phenobarbital, but not ethosuximide, by human P-glycoprotein. Life Sci. 86:
899-905.
ZHANG, C., KWAN, P., ZUO, Z., BAUM, L., 2012. The transport of antiepileptic drugs by P-
glycoprotein. Adv.Drug Deliv.Rev. 64: 930-942.
ZHANG, X., ALAKHOVA, D.Y., BATRAKOVA, E.V., LI, S., YANG, Z., LI, Y., KABANOV, A.V., 2009a.
Effect of pluronic p85 on amino acid transport in bovine brain microvessel endothelial cells. J.
Neuroimmune Pharmacol. 4: 35–46.
ZHANG, Y., LI, C.S.W., YE, Y., JOHNSON, K., POE, J., JOHNSON, S., BOBROWSKI, W.,
GARRIDO, R., MADHU, C., 2006. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro
model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metabol Disp. 34: 1935-1943.
ZHANG, Y., SCHUETZ, J.D., ELMQUIST, W.F., MILLER, D.W., 2004. Plasma membrane localization
of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J
Pharmacol Exp Ther. 311: 449-455.
ZHONG, X.-L., YU, J.-T., ZHANG Q., WANG, N-D., TAN, L., 2011. Deep brain stimulation for epilepsy
in clinical practice and in animal models. Brain Res Bull. 85: 81-88.
ZHOU, J., LIU, M., ZHAI, Y., XIE, W., 2008. The antiapoptotic role of pregnane X receptor in human
colon cancer cells. Mol. Endocrinol. 22: 868-880.
ZHOU, C, VERMA, S., BLUMBERG, B., 2009. The steroid and xenobiotic receptor (SXR), beyond
xenobiotic metabolism. Nucl Recept Signal., 7: e001.
ZHU, H.J., LIU, G.Q., 2004. Glutamate up-regulates P-glycoprotein expression in rat brain microvessel
endothelial cells by an NMDA receptor-mediated mechanism. Life Sci. 75: 1313-1322.
204

205
ANHANG

ANHANG
8 ANHANG
8.1 Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte
Tabelle 8.1: Medien und Reagenzien, in alphabetischer Reihenfolge.
Substanz
Ammonium Persulfat (APS)
Aquasafe 30 plus Scintillationsflüssigkeit
Ascorbinsäure
Basic fibroblast growth factor (bFGF)
BCA Protein Assay Kit
Bovine Serum Albumin (BSA)
Bromphenolblau Natriumsalz
Butanol
Carbamazepin
Chemically defined lipid concentrate
Collagen Typ I
Collagen Typ IV
Collagenase II
Coomassie ® Brillantblau R-250
Cyclic Adenosinphosphat (cAMP)
Desoxycholsäure Natriumsalz (DOC)
Desoxyribonuclease (DNAse) I
Dexamethason
Digoxin
Dinatriumhydrogenphosphat Na 2 HPO 4
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dispase II
Dithiothreitol (DTT)
DMEM, Low Glucose
DMEM/F-12
Doxorubicin (Hydrochlorid)
EBM-2 Medium
Essigsäure 100 %
Ethanol (100 %)
Ethanol (vergällt)
Fetales Kälberserum FKS, (standardisiert und
nicht-standardisiert)
Fibronectin
Glycerol
Glycin
Ham’s F-10 + GlutaMAX-I
HBSS
HEPES
Humanes Serum
Hydrocortison
Kaliumchlorid
Bezugsquelle
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Zinsser Analytic, Frankfurt
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Thermo Scientific, Rockford, USA
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-
Bettingen
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Roche, Mannheim
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Biochrom AG, Berlin
AppliChem, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Roche, Mannheim
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Sigma-Aldrich, Steinheim
AppliChem, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Roche, Mannheim
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
ALEXIS ® Biochemicals, Lörrach
Lonza Ltd., Basel, Schweiz
AppliChem, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
CG Chemikalien, Laatzen
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich;
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-
Bettingen
Biochrom AG, Berlin
AppliChem, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Merck, Darmstadt
206

ANHANG
Substanz
Kaliumdihydrogenphosphat KH 2 PO 4
Levetiracetam
L-Glutamin (200 mM)
Magermilchpulver
MEM + GlutaMAX-I
Methanol
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin (TEMED)
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
Natriumpyruvat
Opti-MEM ®
Precision Plus Protein Standard (Dual color)
Penicillin/Streptomycin
(10.000 E/10.000 µg/ml)
Phenobarbital
Phenytoin
Primärantikörper anti-Pgp C219
(Maus, monoklonal)
Primärantikörper anti-ß-Aktin (Kaninchen,
monoklonal)
Protease Inhibitor Cocktail Tablets
Puromycin Dihydrochlorid
Rhodamin 123
Rifampicin
Ro-20-1724
Rotiphorese ® Gel 30
Röntgen-Entwickler
Röntgenfixierlösung
Salzsäure p. a. (37 %ig)
Sekundärantikörper Ziege-anti-Kaninchen-HRP
Sekundärantikörper Kaninchen-anti-Maus-HRP
Sodiumdodecylsulfat Pellets
SuperSignal ® West Femto Kit
Tariquidar
Bezugsquelle
Merck, Darmstadt
UCB Pharma, Brüssel, Belgien
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Fluka Biochemika, Deisenhofen
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Merck KgaA, Darmstadt
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
Gibco ® /Life Technologies GmbH, Darmstadt
BIO-RAD Labaratories GmbH, München
Biochrom AG, Berlin
Serva, Heidelberg
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Signet Covance, California, USA
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Roche, Mannheim
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sigma-Aldrich, Steinheim
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
TETENAL AG & CO. KG, Norderstedt
TETENAL AG & CO. KG, Norderstedt
Merck KgaA, Darmstadt
Dako Deutschland, Hamburg
Dako Deutschland, Hamburg
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Thermo Scientific, Rockford, USA
Xenova Ltd., Berkshire, UK
The R. W. Johnson Research Institute,
Topiramat
Pennsylvania, USA
Tris
AppliChem, Darmstadt
Tris-Glycin-Fertiggele (10 %, NOVEX ® )
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Triton X-100
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypan Blue Solution (0,4 %)
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Trypsin/EDTA-Lösung 10x (0,5/0,2 %)
Biochrom AG, Berlin
Tween 20
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Tween 80
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Valproat
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Valspodar (PSC833)
Novartis Pharma GmbH, Nürnberg
Verapamil
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
3 H-Digoxin Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim
3 H-Verapamil Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig
14 C-Mannitol Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig
207

ANHANG
Tabelle 8.2: Bezugsquellen Materialien und Geräte in alphabetischer Reihenfolge.
Materialien und Geräte
Hersteller
Akku-Schüttler KM-2
Edmund Bühler Labortechnik GmbH, Hechingen
Altromin 1324 Standarddiät (für Ratten)
Altromin GmbH, Lage
Blottingpapier (d=3 mm)
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
CO 2 -Inkubator Heraeus BBD 6220
Heraeus Instruments GmbH, Osterode
CO 2 -Inkubator NU-4500E
NuAire Inc., Plymouth, USA
Deckgläschen
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Einmalkanülen
TERUMO ® Europe N.V., Leuven, Belgien
Einmalspritzen
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Eismaschine
ZIEGRA Eismaschinen GmbH, Isernhagen
Elektronische Mikrowaagen CPA 225D
Sartorius AG, Göttingen
Elektrophoresekammer und Stromgerät
Biometra GmbH, Göttingen,
Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN ® Tetra BIO-RAD Labaratories GmbH, München
Cell + PowerPac Basic Power Supply
Vakuumfiltrationseinheit
Millipore, Billerica, MA, USA
Fluoreszenzmessgerät FLUOStar OPTIMA BMG Labtech GmbH, Ortenberg
Laborpumpe BVC 21
Vacuubrand GmbH + Co. KG, Wertheim
Leica Mikroskop DM LB und TCS SP5 AOBS Leica Mikroskopie & Systeme GmbH, Wetzlar
Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
Schwabach
Makrolonkäfige
Ebeco, Caustrop-Rauxel
Millicell ® Membran-Inserts
Millipore, Billerica, MA, USA
Mini-Laborpumpe LABOPORT ® neoLab ® Laborbedarf-Vertriebs GmbH,
Heidelberg
MRX Microplate Reader
Dynatech Deutschland GmbH, Denkendorf
Multiwell-Platten
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
NIKON Eclipse TS100
NIKON INSTRUMENTS INC., Melville, USA
Nylon-Gewebesieb (Porendurchmesser: 70 und BD Falcon, BD Biosciences, Heidelberg
40 µm)
Nylonmembran NITEX (Porendurchmesser = 80 SEFAR GmbH, Edlingen
µm)
Objektträger
Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig
Operationsbesteck
Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Pasteurpipetten
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
pH-Meter
Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co.,
Berlin
Pipettenspitzen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen;
Eppendorf AG, Hamburg
Pipettierhilfe accu-jet ® pro
BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim
PVDF Transfer Membran T830.1
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Röhrchen 15, 50 ml
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Röntgenfilm CL-Xposure Film
Fisher Scientific GmbH, Schwerte
Schüttler Mini-Rocker MR-1
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
Semi-Dry-Electroblotter PerfectBlue
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
Sicherheitsbrenner FIREBOY plus
INTEGRA Biosciences GmbH, Fernwald
Skalpellklingen, steril (OR-System)
Otto Rüttgers GmbH & Co. KG, Solingen
Sterilwerkbank NU-440-400E und NU-480-600E NuAire Inc., Plymouth, USA
Szintillationscounter Liquid Scintillator System Beckman Coulter Inc., Brea, USA
LS 5000 TA
208

ANHANG
Materialien und Geräte
Hersteller
ThinCerts ® Membran-Inserts
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Transwell ® Membran-Inserts
Corning Costar GmbH, Bodenheim
TEER-Messkammer (EndOhm-24SNAP) World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL,
USA
TEER-Messpinzette (Elektrodenset EVOM) World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL,
USA
Ultraschallbad Sonorex Super
BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin,
Vortex REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
Schwabach
Wasserbad
Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Wasserfeste Stifte
Edding International GmbH, Ahrensburg
Wattestäbchen
Dirk Rossmann GmbH, Burgwedel
Weichholzgranulat
Rettenmaier & Söhne GmbH & Co KG,
Rosenberg
Whatman ® -Blotting-Papiere
Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe
Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal
Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-
Königshofen
Zellkulturflaschen (A = 25 cm 2 )
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Zellkulturschalen Ø 60, 100 mm
Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht
Zellschaber
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Zentrifuge ( Multifuge 1S-R)
Thermo Electronic Corporation, Osterode
Zentrifuge Labofuge 400
Heraeus Instruments GmbH, Hanau
96Well-Platten (schwarz)
Corning Incorporated, USA
209

ANHANG
8.2 Gewinnung primärer Rattenhirnkapillarendothelien
Medien und Puffer
Phosphat-gepufferte Saline (PBS) pH 7,3
137 mM NaCl
2,7 mM KCl in A. dest. lösen
4,3 mM Na 2 HPO 4 pH-Wert einstellen
1,47 mM KH 2 PO 4
Für die Verwendung in der Zellkultur wurde der Puffer autoklaviert, ansonsten unsteril verwendet.
PBS (pH 7,3) + 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Lagerung bei 4 °C
Enzymlösung
Dispase II in DMEM/F-12 lösen (20 mg/ml)
DNAse I in A. dest. lösen (10 mg/ml)
19 ml DMEM/F-12
1 ml Dispase II Lösung alle Lösungen
10 µl DNAse I Lösung mischen und
200 µl Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml) sterilfiltrieren
Collagenase II (270 U/ml)
20 % (w/v) BSA-Lösung
4 g in 20 ml DMEM/F-12 auf einem Magnetrührer lösen und sterilfiltrieren
cAMP-Ro 20-1724-Lösung
cAMP – Stammlösung: 100 mg/8 ml oder 10 mg/0,8 ml A. bidest.
Ro 20-1724 – Stammlösung: 19,5 mg/2 ml DMSO
Herstellen einer 20:1 Mischung
Medium A (Grundmedium)
EBM-2 Medium
20 % (v/v) Serum
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)
1 mM HEPES
1 % (v/v) L-Glutamin (Stocklösung: 200 mM)
500 ng/ml Hydrocortison
Medium B
Medium C
Siehe Grundmedium
Siehe Grundmedium
+ 2 ng/ml bFGF + 1 ng/ml bFGF
Collagen IV-Lösung
Collagen IV in A. bidest. lösen (1 mg/ml)
1:10 Verdünnung der Stocklösung
pro cm 2 Wachstumsfläche 50 µl; 1 h bei 37 °C inkubieren, Collagen-Lösung abnehmen und
Zellkulturgefäße unter der Sterilbank trocknen lassen
210

ANHANG
Collagen IV-Fibronectin-Lösung
Collagen IV in A. bidest. lösen (1 mg/ml)
270 µl Collagen IV-Stocklösung
+ 135 µl Fibronectin-Stocklösung (1 mg/ml)
+ 2,295 ml A. bidest.
120 µl der Mischung pro Insert pipettieren, 2 h bei 37 °C inkubieren, Lösung abnehmen, Inserts
unter der Sterilbank trocknen lassen
Präparation
1) 5-6 Ratten (2-3 Wochen alt) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im
Becherglas auf Eis sammeln
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren in Petrischale mit eiskaltem PBS + 1 %
Penicillin/Streptomycin sammeln
3) Kleinhirn abtrennen, auf Filterpapier mit Wattestäbchen von Meningen befreien
4) Stammhirn, Plexus entfernen Cortices in neue Petrischale mit Puffer überführen, Lagerung auf
Eis!
5) Puffer absaugen und Cortices mit Skalpellen zu homogenen Brei zerkleinern
6) 15 ml Enzymlösung zugeben und mit 10 ml-Pipette homogenisieren, in ein 50 ml-Röhrchen
überführen
7) 1,5 h im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln
8) Verdau mit 20 ml 20 % BSA-Lösung mischen, Gemisch auf zwei 50 ml-Röhrchen verteilen
9) 15 min bei 1000xg und 4 °C zentrifugieren, Überstand (Myelin) dekantieren und verwerfen, Pellet
mit restlicher Enzym-Lösung resuspendieren
10) 1 h im Wasserbad bei 37 °C inkubieren, Verdau regelmäßig schütteln
11) Nylonmembran (Porendurchmesser: 80 µm) 3-mal mit 5 ml DMEM/F12 spülen
12) Verdau durch Nylongewebe filtrieren, zurückgehaltene Kapillaren 3-mal vorsichtig mit je 5 ml
DMEM/F-12 waschen, Filtrat verwerfen
13) Kapillaren mit 11 ml Medium A ohne Puromycin vom Filter waschen
14) Pro Petrischale (A = 28 cm 2 ) 5 ml Zellsuspension + 20 µl Puromycin-Lösung (Endkonzentration: 4
µg/ml) versetzen
Kultivierung
1) 3 Tage im Brutschrank kultivieren, mit Medium A waschen, Mediumswechsel auf Medium B
2) Für Aussaat auf Membran-Inserts Beschichtung mit Collagen IV und Fibronectin
3) Bei 70-80 % Konfluenz: Passage auf beschichtete Membran-Inserts (0,5 bzw. 1,5 ml
Zellsuspension pro 12Well bzw. 6Well-Insert), Medium C
4) Alle 2-3 Tage Mediumswechsel: Medium absaugen, sammeln, zentrifugieren, Überstand 1:1 mit
frischem Medium mischen
5) 1 Tag vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal
211

ANHANG
8.3 Gewinnung primärer Astrozyten der Ratte
Medien und Puffer
PBS (pH 7,3)
PBS (pH 7,3) + 2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Siehe Abschnitt 8.2 Lagerung bei 4 °C
Dissoziationslösung
9,2 ml DMEM
0,4 ml Trypsin/EDTA-Lösung (10x) alle Lösungen
0,2 ml HEPES (1 M) mischen und
0,1 ml DNAse I (Endkonzentration: 0,1 mg/ml) sterilfiltrieren
0,1 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)
Astrozyten-Medium
DMEM Low Glucose
10 % (v/v) fetales Kälberserum (nicht-standardisiert)
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
Präparation
1) 5-6 Ratten (0-3 Tage alt, P0-P3) mit CO 2 betäuben, Dekapitation, Köpfe in Ethanol tauchen, im
Becherglas mit PBS + 2% Penicillin/Streptomycin auf Eis sammeln
2) Schädel eröffnen, Gehirn herauspräparieren, Stammhirn und Kleinhirn entfernen, Cortices in
Petrischale mit eiskaltem PBS + 2 % Penicillin/Streptomycin sammeln
3) Cortices auf Filterpapier von Meningen befreien, Cortexhälften trennen, Hippocampus durch
Herausrollen entfernen Cortices in 15 ml-Röhrchen mit Puffer sammeln, Lagerung auf Eis!
4) Puffer absaugen, Dissoziationslösung zugeben, Cortices mit 10 ml-Pipette homogenisieren
5) Homogenat 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, regelmäßig schütteln
6) Verdau sorgfältig mit 10 ml-Pipette dissoziieren
7) 5 min bei 400xg zentrifugieren, Überstand absaugen (oder dekantieren)
8) Pellet in 10 ml Astrozytenmedium resuspendieren
9) 5 min bei 200xg zentrifugieren, Überstand absaugen
10) Pellet in 6 ml Astrozytenmedium (1 ml/Gehirn) aufnehmen
11) Zellsuspension durch ein Gewebesieb filtrieren (erst 70 µm, dann 40 µm)
12) Aussaat der Zellen in 25 cm 2 Flaschen (3-4 Gehirne/Flasche)
Kultivierung
1) mikroskopische Kontrolle am nächsten Tag, Medium absaugen, abgesetzte Zellen mit
Astrozytenmedium vorsichtig waschen, neues Medium hinzugeben
2) alle 2-3 Tage Mediumswechsel
3) Entfernung der Oligodendrozyten und Mikroglia: Flaschen bei 250 Umdrehungen/min (U/min)
schütteln für einige Stunden oder über Nacht
4) bei ca. 90 % Konfluenz: Passage oder Kryokonservierung
5) für Kokultur mit Hirnkapillarendothelzellen: bei 70-80 % Konfluenz Aussaat der Astrozyten 3 Tage
vor Endothelzellen
212

ANHANG
8.4 Durchführung eines Kumulations-Assays
Medien und Puffer
PBS (pH 7,3)
Versuchsmedium
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®
Collagen I-Lösung (für hCMEC-, GPNT-und RBE4-Zellen)
Collagen I in 0,2 % Essigsäure lösen (2 mg/ml)
1:50 Verdünnung der Stocklösung
1h bei 37 °C inkubieren, Collagen-Lösung abnehmen und Zellkulturgefäße unter der Sterilbank
trocknen lassen
Collagen IV-Lösung (für rBCEC-Zellen)
Siehe Abschnitt 8.2
Lysis-Puffer (pH 8,0)
25 mM Tris
50 mM NaCl
0,5 % (w/v) Natrium-deoxycholat
0,5 % (v/v) Triton X-100
Frisch zugesetzt: 1x Protease Inhibitor Cocktail Complete ®
Lagerung bei 4 °C
Aussaat und Kultivierung der Zellen
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6Well-Platten. Für die hCMEC/D3- und rBCEC-Zellen wurden
die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. Collagen IV beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage
bis zur Konfluenz kultiviert und i.d.R. ab dem dritten Tag der Konfluenz behandelt. Für alle Gruppen
wurde eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.
Kumulations-Assay
1) Vorbereiten des Assay-Mediums mit Inhibitor Tariquidar (TQD):
Stocklösung: 5 mM TQD in DMSO
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet
2) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop; Auswahl der Wells, die mit dem
Inhibitor inkubiert werden
3) Absaugen des Mediums, Opti-MEM ® +/- Inhibitor auf die Zellen geben (3 ml Medium pro Well)
4) Inkubation der Zellen für 1 h im Inkubator bei 50 U/min
5) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Opti-MEM ® + 10 µM Rhodamin 123
Digoxin
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
Stocklösung 2: Opti-MEM ® + Stocklösung 1 (100 µM)
Versuchsmedium: Opti-MEM ® + 1 µM Stocklösung 2 + 10 kBq/ml 3 H-Digoxin
Vom Versuchsmedium: Medium + TQD ansetzen (0,5 µM TQD)
6) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (3 ml/Well)
7) Inkubation für 2 h bei 37 °C und bei 50 U/min
213

ANHANG
8) Versuchsende: Entnahme von je 100 µl Mediumproben, restliches Medium absaugen, Platten auf
Eis halten
9) Zellen mit eiskaltem PBS waschen, Zellen mit Schaber lösen, in je 500 µl PBS aufnehmen und in
ein Eppendorfgefäß überführen
10) Zentrifugieren der Zellen bei 250xg für 8 min bei 4 °C
11) Überstand entfernen, Zugabe von je 150 µl Lysispuffer, Zellen resuspendieren
12) Entnahme von 100 µl Zelllysat und Transfer auf schwarze 96Well-Platten
13) Messung der Lysate, Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät
(FLUOStar OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid
Scintillator System LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)
Proteinbestimmung
1) Zentrifugation des verbleibenden Zelllysats bei 18550xg und 4 °C für 15 min
2) Überführen der Überstande in neue Eppendorfgefäße
3) Pro Probe 10 µl Volumen auf 96Well-Platte pipettieren (i.d.R. unverdünnt und 1:2 verdünnt),
zusätzlich 10 µl pro Konzentration der BSA-Standardreihe
4) Ansetzen der Reaktionslösung: Bicinchoninsäure und Kupfersulfatlösung im Verhältnis 50:1
mischen (BCA-Assay-Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA)
5) Zugabe von je 200 µl Reaktionslösung, 30 min bei 37 °C dunkel inkubieren
6) Messung der optischen Dichte, Ermittlung der Eichkurve
7) Berechnung der Proteinkonzentration (mg/ml) anhand der Eichkurve mit Excel ® (Microsoft,
Unterschleißheim)
Auswertung
1) Berechnung des Substratgehalts anhand der Proteinkonzentration
2) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)
Für alle Versuche erfolgte die Auswertung der Ergebnisse so, dass zweiseitig und stets gegen
die Kontrolle getestet wurde.
214

ANHANG
8.5 Durchführung eines Transport-Assays
Medien und Puffer
PBS (pH 7,3)
Versuchsmedium
Siehe Abschnitt 8.2 Opti-MEM ®
Versuchspuffer
HBSS-Puffer (Hank’s Balanced Salt Solution; 1x)
10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
1 mM Natriumpyruvat
Medien zur Kultivierung der hCMEC/D3-Zellen auf Transwell-Inserts
1. Normales Kulturmedium
EBM-2 Medium
5 % (v/v) FKS
1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
1 % (v/v) HEPES
0,01 % Hydrocortison
0,1 % bFGF
0,5 % (v/v) Ascorbinsäure
1 % Lipidkonzentrat
2. Medium mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren
EBM-2 Medium
2,5 % (v/v) FKS
1 % Penicillin/Streptomycin
0,05 % (v/v) Hydrocortison
0,1 % (v/v) bFGF
Je 0,025 % Ascorbinsäure, VEGF, IGF, EGF
3. Medium mit weniger Zusätzen
EBM-2 Medium
2,5 % FKS
1 % Penicillin/Streptomycin
1 % HEPES
0,00055 % Hydrocortison
0,1 % bFGF
24 h vor dem Transportversuch Zugabe von 1 nM Simvastatin:
Stocklösung 1: 60 mM; dazu Simvastatin in Ethanol lösen (50 mg/ml), Zugabe von 0,813 ml 1 N
Natriumhydroxid und Einstellen des pH-Werts auf 7,2.
Stocklösung 2: Stocklösung 1 in Medium verdünnen (1 µM)
1 Tag vor dem Versuch wird Simvastatin dem Zellkulturmedium so zugegeben, dass es in einer
Konzentration von 1 nM im Medium gelöst ist.
Medien zur Kultivierung der rBCEC-Zellen auf Transwell-Inserts
Medium C: Siehe Abschnitt 8.2
24 h vor dem Transportversuch Zugabe der cAMP-Ro 20-1724-Mischung (20:1):
12Well-Membranen: 15,7 µl basolateral und 5,3 µl apikal
6Well-Membranen: 26,2 µl basolateral und 5,3 µl apikal
215

ANHANG
Aussaat und Kultivierung der Zellen
Die Aussaat der Zellen erfolgte auf 6- und 12Well-Membraneinlagen, für Transportversuche nach
der bidirektionalen Methode wurden lediglich 6Well-Membraninserts verwendet. Für die hCMEC/D3-
und rBCEC-Zellen wurden die Platten vor der Aussaat mit Collagen I bzw. einem Gemisch aus
Collagen IV und Fibronectin beschichtet. Die Zellen wurden 2-3 Tage bis zur Konfluenz kultiviert und
i.d.R. ab dem 7. Tag nach Erreichen der Konfluenz für den Transportversuch verwendet. Für alle
Gruppen wurde fast ausschließlich eine Probenzahl von mindestens n=3 gewählt.
Für Transportversuche mit den hCMEC/D3-Zellen wurden diese in verschiedenen Medien
kultiviert und zwei verschiedene Versuchsmedien verwendet. Des Weiteren wurden die Zellen 1 Tag
vor dem Versuch mit und ohne 1 nM Simvastatin kultiviert.
Bidirektionaler Transport-Assay
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden
2) Inhibitor lösen: 5 mM Tariquidar in DMSO
3) Versuchsmedium +/-Inhibitor bzw. Versuchsmedium + Vehikel (= Lösungsmittel des Inhibitors:
DMSO) ansetzen
TQD wird in einer Endkonzentration von 0,5 µM verwendet.
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die
Inkubation mit Inhibitor
5) Medium in den Transwell-Inserts absaugen (erst basolateral, dann apikal)
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: 2,5 ml basolateral, 1,5 ml apikal
7) 1 h Vorinkubation (bei 50 U/min und bei 37 °C)
8) Medium für Permeabilitätskontrolle vorbereiten:
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol
9) Vorbereitung des Versuchsmediums mit Substrat: Rhodamin 123 oder Digoxin
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Vom
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123
Versuchsmedium
Digoxin
Medium + Inhibitor
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
bzw. Vehikel
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)
vorbereiten
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (2,7 ml basolateral, 2 ml apikal)
Das Medium mit Substrat wird nur in eine der beiden Kammern gegeben, entweder apikal oder
basolateral. Die Probenentnahme erfolgt kontralateral.
Mannitol nur in basolaterale Kammer geben, apikal erfolgt nur die Zugabe des
Versuchsmediums. Aus dieser Kammer werden auch die Proben entnommen.
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten: 100 µl Probenvolumen aus der kontralateralen
Kammer
Zusätzlich Entnahme von Ausgleichsvolumina: apikal: 130 µl, basolateral: 77 µl
14) Versuchsende: Entnahme der letzten Proben, erneute TEER-Messung, entsprechende
Entsorgung der verbleibenden Flüssigkeiten
15) Messung der Mediumproben und Initialkonzentration mit Fluoreszenzmessgerät (FLUOStar
OPTIMA, BMG Labtech GmbH, Ortenberg) bzw. Szintillationscounter (Liquid Scintillator System
LS 5000 TA, Beckman Coulter Inc., Brea, USA)
16) Berechnung des Substratgehalts mit Excel ® (Microsoft, Unterschleißheim)
17) Auswertung der Daten mit Prism5 ® (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA)
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.
216

ANHANG
Transport-Assay nach der Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)
1) Versuchspuffer ansetzen (siehe Medien und Puffer) bzw. Opti-MEM ® verwenden
2) Inhibitor lösen: 5 mM TQD in DMSO oder 8,23 mM PSC833 in Ethanol/Tween80 (9:1) und A.
bidest.
3) Versuchsmedium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten
TQD wird in einer Konzentration von 0,5 µM, PSC833 in einer Endkonzentration von 10 µM
verwendet.
4) Mikroskopische Kontrolle der Monolayer unter dem Mikroskop, Auswahl der Wells für die
Inkubation mit dem Inhibitor
5) Absaugen des Medium in den Transwell-Inserts (erst basolateral, dann apikal)
6) Versuchsmedium +/- Inhibitor zur Vorinkubation einfüllen: Volumen vom Format der Membran-
Inserts abhängig (12Well bzw. 6Well) basolateral: 1,5 bzw. 2,5 ml, apikal 0,7 bzw. 1,5 ml
7) 1 h Vorinkubation (bei 37 °C und 50 U/min)
8) Vorbereitung des Versuchsmediums mit jeweiligem Substrat: Rhodamin 123, Digoxin oder
Verapamil
Rhodamin 123
Stocklösung: 10 mg/ml in Ethanol
Versuchsmedium + 2 µM Rhodamin 123
Digoxin
Stocklösung 1: 5 mM in DMSO
Stocklösung 2: Stocklösung 1 + Versuchsmedium (100 µM)
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Digoxin
Verapamil
Stocklösung 1: 4,375 mM Verapamil in Ethanol
Stocklösung 2: Stocklösung 1 im Versuchsmedium verdünnen (43,75 µM)
Versuchsmedium + 10 nM Stocklösung 2 + 1,85 kBq/ml 3 H-Verapamil
Vom Versuchsmedium: Medium + Inhibitor bzw. Vehikel vorbereiten
9) Medium für Permeabilitätskontrolle ansetzen:
Versuchsmedium + 0,1 µCi/ml 14 C-Mannitol
10) Vorinkubation beenden, TEER-Messung mit Messkammer oder -pinzette
11) Medium der Vorinkubation entfernen und durch Versuchsmedium mit jeweiligem Substrat +/-
Inhibitor ersetzen (basolateral: 1,5 bzw. 2,7 ml, apikal: 0,7 bzw. 1,5 ml)
Das Medium mit Substrat wird in beide Kammern gegeben. Die Probenentnahme erfolgt
ebenfalls aus beiden Kammern.
Mannitol wird nur in die basolaterale Kammer geben, apikal erfolgen nur die Zugabe des
Versuchsmediums sowie auch die Probenentnahme.
12) Inkubation der Zellen bei 37 °C und 50 U/min
13) Probennahme zu vorher festgelegten Zeitpunkten aus beiden Kammern: 50 bzw. 100 µl
basolateral, 70 bzw. 130 µl apikal
14) Weiteres Vorgehen siehe Bidirektionaler Transport-Assay
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Analyse der AUC und Two-way ANOVA.
217

ANHANG
8.6 Durchführung eines Western Blots
Lösungen und Puffer
Sämtliche Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser angesetzt.
PBS (pH 7,3) Lysis-Puffer (pH 8,0)
Siehe Abschnitt 8.2 Siehe Abschnitt 8.4
5x Laemmli-Puffer
2 % (w/v) SDS
50 mM Tris, pH 6,8
0,2 mg/ml Bromphenol Blau
0,1 M DTT
10 % (v/v) Glycerol
Lagerung bei -20 °C
Transferpuffer
Elektrophoresepuffer
25 mM Tris 25 mM Tris
192 mM Glyzin 250 mM Glyzin
10 % Methanol 0,1 % (w/v) SDS
PBS mit Tween-20 (PBS-T)
Siehe Zusammensetzung PBS + 0,05 % Tween-20
Coomassie-Färbelösung
60-80 mg Coomassie Brillantblau R-250
35 mM HCl
A. bidest. ad 1000 ml
lichtgeschützte Lagerung bei 4 °C
Magermilchlösung
2 % bzw. 5 % Magermilchpulver (w/v) in PBS-T
Polyacrylamidgel
Sammelgel
Trenngel
4 % Acrylamid 10 % Acrylamid
0,5 M Tris (pH 6,8) 1,5 M Tris (pH 8,8)
0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS
0,1 % APS 0,1 % APS
0,1 % TEMED 0,1 % TEMED
Alle Schritte ab Herstellung der Proteinlysate fanden unsteril ohne die Verwendung der Sterilbank
statt.
218

ANHANG
Herstellung der Proteinlysate
Für die Herstellung der Lysate wurden die Zellen zunächst mit kaltem PBS gewaschen.
Anschließend wurden 300-800 µl mit Protease-Inhibitor versetztem Lysispuffer in Abhängigkeit von
der Größe der Kultivierungsgefäße auf die Zellen gegeben und für diese über 30 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen mit Hilfe eines Schabers von der Oberfläche der Kulturschalen/Wells
gelöst, das Volumen in Eppendorfgefäße überführt und darin eventuell noch intakte Zellen lysiert.
Nach einer 15-minütigen Zentrifugation bei 18550xg und 4 °C wurde der Überstand in ein neues
Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung bei – 20 °C gelagert.
Vorbereitung der Proben
Mittels des BCA Protein Assays wurde die Proteinkonzentration der Zellproben bestimmt, um
für alle Proben die gleiche Proteinmenge auftragen zu können (genauere Angaben siehe 4.3.1
Bestimmung der Proteinkonzentration). Pro Probe wurden i.d.R. 15-40 µg Protein eingesetzt. Die
Proben wurden mit dem nötigen Volumen an Proteinlysat vorbereitet und mit einem Viertel des
jeweiligen Volumens an 5x konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bei
37 °C inkubiert.
Elektrophorese: SDS-PAGE
Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelen und des Detergenz
Sodiumdodecylsulfat (SDS), welches die Proteine denaturiert und ihnen eine negative Ladung
verschafft. In den Gelen wurden die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, wobei kleinere
bzw. leichtere Proteine eine längere Laufstrecke im Gel zurücklegen.
Sofern keine Fertiggele (10 % Tris-Glycin, Life Technologies, Darmstadt) verwendet wurde, fanden für
die Gelelektrophorese zwei Gele Anwendung: das Sammelgel (4 % Acrylamid) und das Trenngel
(10 % Acrylamid). Ersteres sorgte für die Konzentration der Proben in den Geltaschen und damit für
einen gleichmäßigen Lauf der Proteine. Im Trenngel erfolgte dann die eigentliche Auftrennung des
Proteingemisches in einzelne Proteinbanden. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von max.
U = 125 V durchgeführt.
Elektroblotting
Nach der Auftrennung des Proteingemisches mittels SDS-PAGE erfolgte die Übertragung auf
eine Polyvinylidenmembran in einer Semi-Dry-Blottingapparatur. Dazu wurden 6 Whatman ® -Blotting-
Papiere (Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe) und die Membran auf die Größe des Gels
zurechtgeschnitten. Die PVDF-Membran (PVDF Transfer Membran T830.1, Carl Roth GmbH + CO.
KG, Karlsruhe) wurde mit Hilfe von 100 % Methanol für die folgenden wässrigen Lösungen zugänglich
gemacht.
Daran anschließend erfolgte der Aufbau des Western Blots. Die verwendete Stromstärke in
mA richtete sich nach der Fläche des Gels multipliziert mit 2. Die Blottingdauer betrug 2 h. Zur
Überprüfung, ob die Proteine vom Gel auf die Membran übertragen wurden, wurde das Gel mit einer
Coomassie-Lösung gefärbt.
Immunodetektion
Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C in 5 %iger Magermilchlösung geschwenkt, um
freie Bindungsstellen zu blocken. Anschließend wurden die Membranen an einer rot markierten Bande
bei 72 kDa geschnitten. Auf der oberen Hälfte erfolgte dann der Nachweis des Pgps mit einem
Molekulargewicht von 170 kDa, auf dem unteren Membranabschnitt wurde ß-Aktin (42 kDa)
nachgewiesen.
219

ANHANG
Tabelle 8.3: Verwendete Antikörper und Verdünnungen
Antikörper Bezug Lösungsmittel Verdünnung
Primärantikörper
Anti-Pgp C219
Signet 2 %ige Magermilch 1:200
(Maus, monoklonal)
Anti-β-Aktin
Sigma-Aldrich 2 %ige Magermilch 1:5000
(Kaninchen, monoklonal)
Sekundärantikörper
Kaninchen-anti-Maus-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000
Ziege-anti-Kaninchen-HRP Dako 2 %ige Magermilch 1:1000
Sowohl Primärantikörper als auch Sekundärantikörper wurden in 2 %iger Magermilchlösung
verdünnt. Die Inkubation mit dem jeweiligen Primärantikörper erfolgte für 1-2 h bei Raumtemperatur
auf einem Schüttler. Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte
entfernt. Die nun folgende einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde bei
Raumtemperatur durchgeführt.
Die Sekundärantikörper waren an das Enzym Meerrettichperoxidase (Horse Radish
Peroxidase, HRP) gekoppelt. Diese setzt Luminol bzw. dessen Derivate in die oxidierte Form um,
wobei eine detektierbare Lumineszenz frei wird. Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper
wurden die Membranen erneut gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem
chemilumineszenten Substrat des SuperSignal ® West Femto Kits. Dazu wurden pro Membranhälfte
etwa 300 µl des chemilumineszenten Substrats verwendet. Die Signale wurden entweder mit dem
Programm Chemidoc XRS System (inklusive Image Lab Software; Bio-Rad Laboratories,
München) aufgezeichnet oder aber durch eine Inkubation der Membranen auf Röntgenfilm für etwa 10
sec bis 30 min fixiert. Nach der Entwicklung und Fixierung des Films wurde dieser gescannt.
Unabhängig von der Aufzeichnung der Signale wurden die Banden anschließend mit der Quantity
One ® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories) quantifiziert. Die statistische Auswertung wurde
mit Prism5 ® (GraphPad, San Diego, CA, USA) vorgenommen. Dabei wurden die für die Pgp-Signale
ermittelten Daten auf die Werte für ß-Aktin normiert.
220

PUBLIKATIONEN
PUBLIKATIONEN
Originalarbeiten
Noack, A., Noack, S., Hoffmann, A., Maalouf, K., Couraud, P.-O., Romero, I.A.,
Weksler, B., Alms, D., Naim, H.Y., Löscher, W., 2012. Drug-induced trafficking of P-
glycoprotein in human brain capillary endothelial cells. PLOS ONE. Eingereicht
Alms, D., Fedrowitz, M., Löscher, W., 2013. Marked differences in the effect of
antiepileptic and cytostatic drugs on the functionality of P-glycoprotein in human and
rat brain capillary endothelial cell lines. Biochem. Pharmacol. Eingereicht
Zitierfähige Kongressbeiträge
D. Neumann, M. Fedrowitz, W. Löscher (2011): „Several antiepileptic drugs induce
the MDT P-glycoprotein in rat and human brain endothelial cell lines“. 65 th Annual
Meeting American Epilepsy Society 2011, Baltimore, Poster 1.243
Alms D., Fedrowitz M., Löscher W. (2012): „Induction of the Multidrug-Transporter P-
glycoprotein by several antiepileptic drugs in rat and human brain endothelial cell
lines“. 8 th FENS Forum of Neuroscience 2012, Barcelona, FENS Abstract, Volume 6,
Poster 034.01
221

DANKSAGUNG
DANKSAGUNG
Als erstes danke ich Herrn Prof. Dr. Löscher für die Möglichkeit der
Anfertigung der Doktorarbeit und die fachliche und stete Betreuung während der
Promotionszeit. Bei Frau Prof. Dr. Gerardy-Schahn und Herrn Prof. Dr. Wewetzer
bedanke ich mich für die hilfreichen Kommentare. Ihnen und Herrn Prof. Dr. Fricker
danke ich für die Begutachtung dieser Arbeit.
Frau PD Dr. Maren Fedrowitz danke ich für die stetige Diskussions- und
Hilfsbereitschaft, die methodischen Anleitungen und den persönlichen Einsatz. Frau
Kerstin Römermann, Ph.D., Frau Dr. Bianca Backofen-Wehrhahn und Herrn Dr.
Andreas Noack danke ich für die angenehme Zeit im Zellkultur- und Western-Blot-
Labor. Ich danke allen für die zahlreichen methodischen Tipps und die tatkräftige
Unterstützung, die zum reibungslosen Ablauf und dem Gelingen der Versuche
beitrugen.
Allen anderen Doktoranden der Abteilung danke ich für deren ständige
Hilfsbereitschaft und auch für die amüsante Zeit im und außerhalb des Instituts. Bei
Frau Sonja Bröer und Herrn Dr. Manuel Töpfer bedanke ich mich für die aufregenden
und auch entspannten Momente während der 65. Jahrestagung der Amerikanischen
Epilepsiegesellschaft in Baltimore 2011. Außerdem möchte ich allen Mitarbeitern der
Abteilung Pharmakologie für die angenehme Zeit im Institut danken.
Ich danke der FAZIT-Stiftung für das Promotionsstipendium und der
Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Abschlussfinanzierung der Doktorarbeit.
Meinen Freunden danke ich für alle aufmunternden Worte und der nötigen
Abwechslung vom Institutsalltag.
Ganz besonders danke ich aber meinen Eltern, meinen Geschwistern, meinen
Schwiegereltern und v.a. meinem Mann Markus für die seelische, moralische und
auch finanzielle Unterstützung und den Zuspruch während dieser Zeit. Sie haben
mich stets ermutigt und mir Rückhalt geboten.
Schließlich möchte ich auch allen hier nicht genannten Personen danken, die
zu dieser Arbeit beigetragen haben.
223