Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib
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In Abb. 14 A wurde S100A9 in Gewebe mit histologischem Bild einer chronischen Pankreatitis markiert. Das Fluoreszenzsignal stammt von Leukozyten im Bindegewebsseptum. Da im lockeren um die Azini gelegenen Bindegewebe zahlreiche kleinere Blutgefäße und Kapillaren (Abb. 14 B‘) verlaufen, sind dort die eingewanderten Leukozyten besonders zahlreich darstellbar. Abb. 14 B, B‘ (Hellfeld) zeigt eine Vergrößerung von zwei neutrophilen Granulozyten im Lumen einer Kapillare, S100A9 ist im Zytoplasma (grün) markiert, die segmentierten Zellkerne sind mit DAPI blau gefärbt. Vermutlich durch Verformung, Degranulation und letztendlich Lyse dieser Zellen nach endothelialer Transmigration ist die Darstellung im Azinus- und Bindegewebe weniger eindeutig (Abb. 14 A, C). Abb. 14 C, C‘ zeigt die entzündliche Infiltration um einen mittleren Pankreasgang in einem gut differenzierten duktalen Adenokarzinom. Auch hier bleibt die Fluoreszenzmarkierung auf Entzündungszellen beschränkt, während das Lumen des Ganges sowie dessen Epithel und Sekrete nicht markiert werden (Abb. 14 C). Abb. 14 D zeigt die Fluoreszenzmarkierung von Zytoplasmaausstülpungen von Zellen eines entdifferenzierten duktalen Adenokarzinoms (c). Die Fluoreszenzintensität ist geringer als die von Entzündungszellen (a). D‘ zeigt das gleiche Präparat in der Hellfeldmikroskopie. In folgendem Ansatz wurde S100A9 in einem weiteren, nicht mit dem aus Abb. 14 identischen entdifferenzierten Adenokarzinom, markiert und gleichzeitig eine Hämatoxylin- Färbung durchgeführt. Eine Überlagerung von tumorzellreichen Arealen ergab eine Kolokalisation von eingewanderten neutrophilen Granulozyten und dem Fluoreszenssignal der S100A9 Proteine, wo hingegen neoplastische Zellen keine Fluoreszenz zeigten (Abb. 15). Abb. 15: Immunfluoreszenzmarkierung (A) von S100A9 in einem entdifferenzierten Adenokarzinom mit einem anti-S100A9 P0301501 Antikörper und einen AlexaFluor488 konjugierten anti-Hühner IgY Antikörper. Überlagerung mit einer Hämatoxylin-Färbung (A‘) zeigt, dass die Fluoreszenzmarkierung auf Leukozyten beschränkt ist, erkennbar an segmentierten Zellkernen der Neutrophilen Granulozyten . Olympus PlanN 40x/0.65 Objektiv. n = 1 Versuch. S100A9 Protein konnte also im Wesentlichen in Leukozyten nachgewiesen werden, die in entzündlich- oder neoplastisches Pankreasgewebe eingewandert waren. Nur in einem Fall 84
eines entdifferenzierten Adenokarzinoms konnte S100A9 in Zytoplasma-Ausstülpungen von neoplastischen Zellen nachgewiesen werden. Die Auswertung von fluoreszenzmarkierten Pankreasgewebeproben erbrachte vor allem in physiologischem Pankreas und bei chronischer Pankreatitis neue Ergebnisse. Bezüglich der Expression, Synthese und Sekretion von Reg3A und S100A9 durch neoplastische Zellen selbst kommt die Immunfluoreszenzmarkierung dieser Gewebeproben an die Grenzen der Auswertung. Ob die detektierten Proteine von anderen als den Tumorzellen selbst stammten und sich nur sekundär an Sekrete und Zelloberflächen angelagert hatten, konnte nicht geklärt werden. Aufgrund dessen war es naheliegend, Adenokarzinomzellen in der Zellkultur zu kultivieren und die Zellen selbst in der Immunfluoreszenz und deren Zelllysate mittels Western-Blot auf das Vorhandensein von Reg3A und S100A9 Proteinen zu untersuchen. 5.2.4 Ergebnis der Immunfluoreszenzmarkierung von Reg3A und S100A8/A9 in Pankreaskarzinomzelllinien 9 Zelllinien von Pankreaskarzinomen, gewonnen aus Primärtumoren, Metastasen oder Aszites wurden in Kultur genommen und solange kultiviert bis ein einheitliches gleichmäßiges Kulturwachstum gewährleistet war. Dann wurden die Zellen auf Deckgläschen ausgesät, über Nacht kultiviert und anschließend formalinfixiert. Anschließend wurden Immunfluoreszenzmarkierungen durchgeführt. Dabei wurden anti-Reg3A P0841202 Hühnerantikörper und ein polyklonaler Kaninchenantikörper gegen humanes RegIIIα/γ (H- 69) eingesetzt. Für die Detektion von S100A9 wurden anti-S100A9 P0301501 Hühnerantikörper und ein monoklonaler Mausantikörper gegen humanes Calgranulin A/B (27E10) verwendet. In keiner der 9 Pankreaskarzinomzelllinien konnte Reg3A nachgewiesen werden. Weder mit dem anti-Reg3A P0841202 Hühnerantikörper noch mit dem anti- RegIIIα/γ (H-69) Antiköper konnten spezifische Fluoreszenzsignale detektiert werden. In zwei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs konnte mit dem Calgranulin A/B (27E10) Antikörper jeweils in einer Subpopulation der kultivierten Zellen zytoplasmatisch S100A8/A9 nachgewiesen werden. Bei beiden Zelllinien handelte es sich nicht um eine aus dem Primärtumor stammende Linie. S100A8/A9 konnte in CAPAN-1 nachgewiesen werden (Abb. 16 A, B), eine Zelllinie die aus einer Lebermetastase gewonnen wurde. Bei HUP-T4 handelt es sich um eine aus Aszites gewonnene Zelllinie (Abb. 16C, C‘). Die Abbildung zeigt, dass nur wenige Zellen einer Zelllinie S100A8/A9 Protein exprimieren. Das Ergebnis wurde jetzt mittels Western-Blot Analyse von Zelllysaten der Zelllinien überprüft. 85
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Pankreatitis markiert. Das Fluoreszenzsignal stammt von Leukozyten im<br />
Bindegewebsseptum. Da im lockeren um die Azini gelegenen Bindegewebe zahlreiche<br />
kleinere Blutgefäße und Kapillaren (Abb. 14 B‘) verlaufen, sind dort die eingewanderten<br />
Leukozyten besonders zahlreich darstellbar. Abb. 14 B, B‘ (Hellfeld) zeigt eine Vergrößerung<br />
von zwei neutrophilen Granulozyten im Lumen einer Kapillare, S100A9 ist im Zytoplasma<br />
(grün) markiert, die segmentierten Zellkerne sind mit DAPI blau gefärbt. Vermutlich durch<br />
Verformung, Degranulation und letztendlich Lyse dieser Zellen nach endothelialer<br />
Transmigration ist die Darstellung im Azinus- und Bindegewebe weniger eindeutig (Abb. 14<br />
A, C). Abb. 14 C, C‘ zeigt die entzündliche Infiltration um einen mittleren Pankreasgang in<br />
einem gut differenzierten duktalen Adenokarzinom. Auch hier bleibt die<br />
Fluoreszenzmarkierung auf Entzündungszellen beschränkt, während das Lumen des Ganges<br />
sowie dessen Epithel und Sekrete nicht markiert werden (Abb. 14 C).<br />
Abb. 14 D zeigt die Fluoreszenzmarkierung von Zytoplasmaausstülpungen von Zellen eines<br />
entdifferenzierten duktalen Adenokarzinoms (c). Die Fluoreszenzintensität ist geringer als die<br />
von Entzündungszellen (a). D‘ zeigt das gleiche Präparat in der Hellfeldmikroskopie.<br />
In folgendem Ansatz wurde S100A9 in einem weiteren, nicht mit dem aus Abb. 14<br />
identischen entdifferenzierten Adenokarzinom, markiert und gleichzeitig eine Hämatoxylin-<br />
Färbung durchgeführt. Eine Überlagerung von tumorzellreichen Arealen ergab eine<br />
Kolokalisation von eingewanderten neutrophilen Granulozyten und dem Fluoreszenssignal<br />
der S100A9 Proteine, wo hingegen neoplastische Zellen keine Fluoreszenz zeigten (Abb. 15).<br />
Abb. 15: Immunfluoreszenzmarkierung (A) von S100A9 in einem entdifferenzierten Adenokarzinom mit einem<br />
anti-S100A9 P0301501 Antikörper und einen AlexaFluor488 konjugierten anti-Hühner IgY Antikörper.<br />
Überlagerung mit einer Hämatoxylin-Färbung (A‘) zeigt, dass die Fluoreszenzmarkierung auf Leukozyten<br />
beschränkt ist, erkennbar an segmentierten Zellkernen der Neutrophilen Granulozyten . Olympus PlanN 40x/0.65<br />
Objektiv. n = 1 Versuch.<br />
S100A9 Protein konnte also im Wesentlichen in Leukozyten nachgewiesen werden, die in<br />
entzündlich- oder neoplastisches Pankreasgewebe eingewandert waren. Nur in einem Fall<br />
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