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Zusammenfassend kann bei chronischer Pankreatitis in 8 von 10 untersuchten Proben Reg3A
an der Zymogengranulamembran, an Zell-Zell-Kontakten sowie am Endothel nachgewiesen
werden. 5 Proben zeigten eine starke Fluoreszenz des Sekrets in Pankreasgängen, während die
übrigen Präparate keine größeren Gangstrukturen beinhalteten. Eine Gewebeprobe wies keine
erkennbaren Azinusstrukturen mehr auf, im fibrotischen Gewebe verbliebene Gangstrukturen
zeigten keine Fluoreszenzmarkierung. Die Lokalisation von Reg3A an der Zymogengranula-
Membran konnte mit einem polyklonalen Kaninchen anti- RegIIIα/γ Antikörper (H-69,
SantaCruz) bestätigt werden.
Überprüfen der Spezifität der Fluoreszenzmarkierung von Reg3A in Muzin und Sekreten
des Pankreas
Bevor die Ergebnisse der Fluoreszenzmarkierung von Reg3A in Pankreasneoplasien
dargestellt werden, soll auf die Fluoreszenz von Muzin und Sekreten in
Pankreasgangstrukturen näher eingegangen werden. Fluoreszenzsignale von Sekreten 13 in
Drüsen, Sekretgängen, aber auch auf der Darmschleimhaut lassen immer die Frage nach der
Spezifität der Markierung aufkommen, da die Gefahr besteht, dass Proteine und Antikörper
unspezifisch an „klebrige“ Schleimoberflächen gebunden werden und anschließend von
speziesspezifischen Sekundärantikörper erkannt werden. Um unerwünschte Reaktionen des
Sekundärantikörpers auszuschließen, wurde in jedem Versuchsansatz eine Negativ-Kontrolle
ohne Primärantikörper angesetzt und ausgewertet, auch wenn die Ergebnisse nicht
standardmäßig dargestellt sind. Um unspezifische Bindungen der primären Antikörper an
Sekrete und Muzine des Pankreas auszuschließen, wurde auf Hühnerseren zurückgegriffen,
die aus Eiern vor der Immunisierung gewonnen wurden. Diese Präimmunisierungsseren (PI-
Seren) wurden von exakt den gleichen Hühner gewonnen, die später immunisiert wurden.
Jedem Antikörper konnte so das äquivalente Präimmunserum zugeordnet werden. Die
Präimmunseren wurden genauso präpariert und eingesetzt wie bei der Präparation der
Antikörper beschrieben. Getestet wurden der anti-Reg3A P0841202-Hühnerantikörper und
der anti-S100A9 P0301501-Hühnerantikörper und die entsprechenden Präimmunseren. Die
Ergebnisse sind in Abb. 12 dargestellt.
Abb. 12 A, A‘ zeigen das für eine Negativkontrolle, also Inkubation des Gewebes ohne
primären Antikörper, typische Bild. Azinusbereiche zeigen keinerlei Fluoreszenz. Die Sudan
Schwarz behandelten Präparate lassen deutlich die Zellkerne der Azinuszellen erkenne, da
diese von Sudan Schwarz nicht gefärbt werden und demnach noch autofluoreszieren. Wurden
die Präimmunseren in gleicher Verdünnung eingesetzt wie die primären Hühnerantikörper
(1:500), konnte nur eine äußerst geringe, kaum darstellbare unspezifische Fluoreszenz
beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).
13 insbesondere Muzin
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