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Deutlich höhere Autofluoreszenzintensität als alle anderen Gewebe- und Zellbereiche wiesen
Erythrozyten vor allem im DAPI und TexasRed Filtersatz auf (Abb. 7 I-L).
Verschiedene Ansätze zu Reduktion der Autofluoreszenz wurden durchgeführt. In Tab. 2
sind die relativen Autofluoreszenzreduktionen der einzelnen Methoden dargestellt. Die Werte
entstanden, indem gleich große Bereiche von Interesse, in allen Fällen pankreatische
Azinusbereiche ohne große Blutgefäße, Bindegewebssepten und Fettvakuolen, ausgewählt
wurden und die mittlere Intensität aller Pixel dieser Regionen ermittelt wurde. Voraussetzung
war die Verwendung gleicher Belichtungszeiten und gleicher Objektive.
20-100mM Kupfersulfat, eine reduzierende Verbindung, zeigte eine deutliche Reduktion der
Autofluoreszenz (Tab. 2). Allerdings wurde auch die spezifische Fluoreszenzmarkierung von
Proteinen deutliche negativ beeinflusst und die Gewebeintegrität schien beeinträchtigt zu sein.
Konzentrationen von 10-20mM Kupfersulfat zeigten nur eine unwesentliche
Eigenfluoreszenzreduktion der pankreatischen Azinusbereiche. Die Intensität der noch
verbleibenden Autofluoreszenz ließ keine Rückschlüsse auf das spezifische Fluoreszenzsignal
zu.
Die Verwendung von Farbstoffen, welche sich abdeckend auf das fluoreszierende Gewebe
legen ohne die Epitope für Antikörpermarkierungen zu verschließen, ist eine weitere
Möglichkeit die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Toluidin Blau ist eine Standardfarbstoff,
der oft für die Übersichtsfärbung von Gewebeschnitten verwendet wird (Chelvanayagam,
Beazley 1997). Obwohl Toluidin Blau die Autofluoreszenz pankreatischer Azini im FITC
Filtersatz im Ganzen (%-Reduktion total) senkte (Tab. 2) wurde die Fluoreszenz im DAPI,
Cy3 und TexasRed Filtersatz teilweise verstärkt, was auf die intensive Fluoreszenz des
Azofarbstoffes selbst zurückzuführen sein dürfte. Auch im FITC Filtersatz schien selektiv die
Fluoreszenz der Zymogengranula unverändert oder sogar gesteigert zu sein (Daten nicht
gezeigt).
In der Literatur wird UV-Licht zur Bestrahlung der Gewebeschnitte eingesetzt (Neumann,
Gabel 2002). Wie aus Tab. 2 hervorgeht konnte eine zweistündige UV-Bestrahlung mit
einem 302nm Transilluminator keine zufriedenstellende Autofluoreszenzreduktion bewirken.
Vor allem die intensive Fluoreszenz von Erythrozyten wurde wenig beeinflusst. Allerdings
konnte weder die Dauer der UV-Exposition noch eine vergleichbare Laborausrüstung zur
Bestrahlung verwendet werden, wie es bei Neumann und Gabel, 2002 beschrieben wurde.
Der Farbstoff Sudan Schwarz B wurde in einigen Geweben bereits zur Autofluoreszenz-
Reduktion eingesetzt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass beschriebene Protokolle mit
1-10% Sudan Schwarz (G/V) in 70% Ethanol und einer Inkubationszeit von 5-30 Minuten
angewendet vor und nach der spezifischen Fluoreszenzmarkierung nicht ausreichen, um die
Eigenfluoreszenz im Pankreas wirkungsvoll zu unterdrücken. Sudan Schwarz-Färbung nach
Immunfluoreszenzmarkierung reduziert das spezifische Signal erheblich (Daten nicht
gezeigt). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Sudan Schwarz-Methode für
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