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Auf diese Weise wurde die Anreicherung der Zellen überprüft. Es wurden je Ausstrich 100
Leukozyten gezählt und differenziert. Die Zählung ergab, dass die Neutrophilenfraktion 70-
85% neutrophile Granulozyten enthielt und vor allem mit eosinophilen Granulozyten und
Lymphozyten „kontaminiert“ war. Die Lymphozyten-Monozytenfraktion beinhaltete zirka
55-60% Lymphozyten, 35% Monozyten und war mit basophilen Granulozyten und
neutrophilen Granulozyten kontaminiert (Abb. 4 A, E). Mittels Immunfluoreszenzmarkierung
wurden S100A9 in den Leukozyten mit P0301502 und Calgranulin B (MRP 1H9 SantaCruz)
Antikörper markiert. Grundsätzlich konnte S100A9 mit beiden Antikörpern an der
Plasmamembran und im Zytoplasma von neutrophilen Granulozyten des Menschen und der
Ratte nachgewiesen werden (Abb. 4 B, C, D, Ratte nicht gezeigt). Das fein granuläre
Fluoreszenzmuster lässt sich besonders gut in Ebenen des segmentierten Zellkerns darstellen
und an der Plasmamembran lokalisieren (Abb. 4 C, D). In Monozyten fiel die Fokussierung
des Fluoreszenzsignals in einer bestimmten Ebene schwer, S100A9 kommt hier vermutlich
diffus im Zytoplasma verteilt vor (Abb. 4 F, G, H). Abb. 4 F zeigt den mit DAPI markierten
Zellkern eines Lymphozyten (rechts) sowie den Kern eines Monozyten (links). Deutlich ist
das zytoplasmatische Fluoreszenzsignal des S100A9-markierten Monozyten zu erkennen,
während der Lymphozyt keinerlei S100A9-Markierung aufweist. Die Lokalisation des
Fluoreszenzsignals bei Verwendung des Calgranulin B Antikörper zeigte Übereinstimmung
mit denen des P0301501 Antikörpers.
Der P0301501- und der Calgranulin B-Antikörper erkennen humanes und murines natives
S100A9 Protein in neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Im weiteren Verlauf der
Arbeit können beide Antikörper zu Immunomarkierung von S100A9 Proteinen in humanen
Pankreatitis- und Pankreasneoplasiegewebeschnitten eingesetzt werden.
5.2.2 Ergebnis der Reduktion der Autofluoreszenz von formalinfixierten und
paraffineingebetteten Pankreasgewebeschnitten
Im ersten Schritt wurde ermittelt, welche Zellen und Strukturen des Pankreasgewebes hohe
Autofluoreszenz aufweisen. Dazu wurden 3-4 µm dicke Pankreasgewebeschnitte
entparaffiniert und mittels Fluoreszenzmikroskopie mit definierten Objektiven bei definierter
Belichtungszeit untersucht. Entweder wurde eine definierte Achse durch ein Bild mit
unterschiedlichen Strukturen wie zum Beispiel lockeres Bindegewebe, straffes Bindegewebe
und pankreatische Azini gelegt und dann ein Intensitätsprofil gemessen, so dass innerhalb
eines Bildes verschiedene Autofluoreszenz-Intensitäten verglichen werden konnten. Oder es
wurden ganze Bildbereiche, so genannte Bereiche von Interesse 6 , wie zum Beispiel
pankreatische Azinusareale definiert und die mittlere Intensität aller Pixel bestimmt. Auf
diese Weise konnten auch Bildausschnitte verschiedener Präparate miteinander verglichen
werden. Wurde ein Intensitätsprofil eines Bildes erstellt so wurde ein gewebefreier
6 engl.: Region of Interest (ROI)
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