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Abb. 4: Immunfluoreszenzmarkierung von S100A9 Protein in Leukozyten des Menschen. A+E Hellfeldmikroskopie, Ergebniskontrolle der Leukozytenanreicherung durch Färbung nach Pappenheim und visueller Differenzierung. A-D Fraktion der Neutrophilen Granulozyten . E-H Fraktion der Lymphozyten und Monozyten. Immunfluoreszenzmarkierung mit anti-S100A9 P0301501 Hühnerantikörper und sekundärem AlexaFluor488 konjugierten Ziege-anti-Hühner-IgY Antikörper. Färbung der DNS im Zellkern mit DAPI. B, D, F: Olympus PlanN 40x/0.65 Objektiv; A, C, E, G, H: Olympus U-Plan FI 100x/1.30 Öl Objektiv. Repräsentative Ergebnisse aus n = 4 unabhängigenVersuchen. 66
Auf diese Weise wurde die Anreicherung der Zellen überprüft. Es wurden je Ausstrich 100 Leukozyten gezählt und differenziert. Die Zählung ergab, dass die Neutrophilenfraktion 70- 85% neutrophile Granulozyten enthielt und vor allem mit eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten „kontaminiert“ war. Die Lymphozyten-Monozytenfraktion beinhaltete zirka 55-60% Lymphozyten, 35% Monozyten und war mit basophilen Granulozyten und neutrophilen Granulozyten kontaminiert (Abb. 4 A, E). Mittels Immunfluoreszenzmarkierung wurden S100A9 in den Leukozyten mit P0301502 und Calgranulin B (MRP 1H9 SantaCruz) Antikörper markiert. Grundsätzlich konnte S100A9 mit beiden Antikörpern an der Plasmamembran und im Zytoplasma von neutrophilen Granulozyten des Menschen und der Ratte nachgewiesen werden (Abb. 4 B, C, D, Ratte nicht gezeigt). Das fein granuläre Fluoreszenzmuster lässt sich besonders gut in Ebenen des segmentierten Zellkerns darstellen und an der Plasmamembran lokalisieren (Abb. 4 C, D). In Monozyten fiel die Fokussierung des Fluoreszenzsignals in einer bestimmten Ebene schwer, S100A9 kommt hier vermutlich diffus im Zytoplasma verteilt vor (Abb. 4 F, G, H). Abb. 4 F zeigt den mit DAPI markierten Zellkern eines Lymphozyten (rechts) sowie den Kern eines Monozyten (links). Deutlich ist das zytoplasmatische Fluoreszenzsignal des S100A9-markierten Monozyten zu erkennen, während der Lymphozyt keinerlei S100A9-Markierung aufweist. Die Lokalisation des Fluoreszenzsignals bei Verwendung des Calgranulin B Antikörper zeigte Übereinstimmung mit denen des P0301501 Antikörpers. Der P0301501- und der Calgranulin B-Antikörper erkennen humanes und murines natives S100A9 Protein in neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Im weiteren Verlauf der Arbeit können beide Antikörper zu Immunomarkierung von S100A9 Proteinen in humanen Pankreatitis- und Pankreasneoplasiegewebeschnitten eingesetzt werden. 5.2.2 Ergebnis der Reduktion der Autofluoreszenz von formalinfixierten und paraffineingebetteten Pankreasgewebeschnitten Im ersten Schritt wurde ermittelt, welche Zellen und Strukturen des Pankreasgewebes hohe Autofluoreszenz aufweisen. Dazu wurden 3-4 µm dicke Pankreasgewebeschnitte entparaffiniert und mittels Fluoreszenzmikroskopie mit definierten Objektiven bei definierter Belichtungszeit untersucht. Entweder wurde eine definierte Achse durch ein Bild mit unterschiedlichen Strukturen wie zum Beispiel lockeres Bindegewebe, straffes Bindegewebe und pankreatische Azini gelegt und dann ein Intensitätsprofil gemessen, so dass innerhalb eines Bildes verschiedene Autofluoreszenz-Intensitäten verglichen werden konnten. Oder es wurden ganze Bildbereiche, so genannte Bereiche von Interesse 6 , wie zum Beispiel pankreatische Azinusareale definiert und die mittlere Intensität aller Pixel bestimmt. Auf diese Weise konnten auch Bildausschnitte verschiedener Präparate miteinander verglichen werden. Wurde ein Intensitätsprofil eines Bildes erstellt so wurde ein gewebefreier 6 engl.: Region of Interest (ROI) 67
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6.3 Schlussfolgerung 110 7. Zusamme
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zwischen Cathepsin L und B sowie St
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1.2.3 Pankreaserkrankungen bei Tier
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1.3.1 Das C-reaktive Protein (CRP)
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1.3.3 Der S100A8/9-Proteinkomplex C
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Toluidine Blue has been described t
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References: Andersson, H., Baechi,
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Rosenow, F., Ossig, R., Thormeyer,
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