Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib
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Bedingungen die Antikörperketten nicht aufgetrennt werden (Abb. 3 A). Es ist nur eine Antikörperbande am oberen Gelrand (180 kDa Gesamt-IgY) erkennbar. Eine Überlagerung der Banden der Antikörperketten mit den Banden von den S100A8/A9-Komplexen ist in diesem Versuch daher unwahrscheinlich. Unter reduzierenden Bedingungen ergeben die leichten Ketten des IgY im Western-Blot Banden zwischen 22 und 35 kDa, die schweren Ketten zwischen 67 und 70 kDa (Abb. 3 A‘). Antikörper und S100A9 Protein konnten mit 5 M Kaliumacetat-, 2 M Imidazol-, 4 und 11 M Harnstoff-Puffer eluiert und im Western-Blot nachgewiesen werden (Abb. 3 D, F). Antikörper ohne S100A9 Protein wurden mit 0,1 M Glycin-, 1 M Arginin-, 4 M MgCl-, und 0,2 M Ethanolamin- Puffer eluiert (Abb. 3 A/A‘, C, E, G). Abb. 3: Elution von S100A9 welches von P0301501-Antikörpern, die an Matrixkügelchen gebunden wurden, aus dem Blutplasma präzipitiert wurde. Die Eluate wurden auf 16% Schägger-Gele aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine im Western-Blot auf Zellulosemembranen übertragen. Zur Proteindetektion wurde der P0301501-Hühnerantikörper verwendet und die Protein- Antikörperbindung mit einem HRP-konjugierten anti-Huhn-IgY Sekundärantikörper sichtbar gemacht. A/A’ = Glycinpuffer; B/B’ = Matrixkügelchen; C = Ethanolaminpuffer, D = Harnstoffpuffer; E = Glycinpuffer; F = Imidazolpuffer; G = Argininpuffer; H = Filter aus Mobicol. Größenstandard: Fermentas Spectra Broad Range Marker. ß-Merc = ß-Mercarptoethanol. n = 2 unabhängigeVersuche. Der Versuch zeigt, dass natives S100A9 Protein sowie S100A8/A9 Proteinkomplex durch den P0301501 anti-S100A9-Antikörper erkannt werden. 64
5.2 Immunfluoreszenzmarkierung Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmarkierung wurden in dieser Arbeit in zahlreichen Ansätzen Informationen auf das Vorhandensein und die Lokalisation von S100A9 und Reg3A Proteinen gewonnen. Die Immunfluoreszenzmarkierung von Leukozyten wurde an den Anfang der Versuchsreihe gestellt. Dieser Vorversuch diente im Weiteren dazu, die S100A8/A9 Proteine in humanen, formalinfixierten, paraffineingebetteten Pankreasgeweben zu lokalisieren. Das Wissen über das Aussehen und Fluoreszenzmuster von S100A9 in Leukozyten war eine wertvolle Hilfe bei der Detektion im Gewebe. Bei der Etablierung der Fluoreszenzmarkierung von humanen Pankreatitis- und Pankreasneoplasien stellte die erhebliche Hintergrund- oder Autofluoreszenz der formalinfixierten Proben eine Herausforderung dar. Bevor mit der gezielten Markierung bestimmter Proteine begonnen werden konnte, wurde die Lokalisation der Autofluoreszenz auf zellulärer und subzellulärer Ebene analysiert und quantifiziert, um dann gezielt Methoden zur Reduktion dieser Hintergrundfluoreszenz zu entwickeln. Erst dann konnten die wertvollen humanen Präparate für weitere Versuche genutzt werden. Letztlich wurden 10 Zelllinien, ausgehend von verschiedenen Pankreasneoplasien, mittels Immunfluoreszenzmarkierung auf das Vorhandensein von S100A9 und Reg3A Proteinen untersucht und parallel Westen-Blot-Analysen von Zelllysaten und PCR-Tests 5 durchgeführt. Dieser Ansatz wurde durchgeführt, weil in der Literatur immer noch kontrovers diskutiert wird, ob diese Proteine überhaupt von Neoplasien exprimiert und sekretiert werden oder ob ein Anstieg der Proteinkonzentration im Blut eine Folge der Sekretionssteigerung von Zellen aus umliegenden unveränderten Pankreasarealen ist (Ehrchen 2009; Mukherjee 2009; Nacken 2003; Ossig 2009; Xie 2003). 5.2.1 Ergebnis der Immunfluoreszenzmarkierung der Leukozyten von Mensch und Ratte Um S100A8/A9 Proteine mit P0301501 Antikörpern in humanen neutrophilen Granulozyten und Monozyten zu lokalisieren, wurden die Leukozyten aus dem peripheren Blut gewonnen und mittels Dichtegradientenzentrifugation getrennt und angereichert. Die Zentrifugation erlaubte eine Anreicherung von neutrophilen Granulozyten, sowie Monozyten und Lymphozyten in zwei verschiedenen Fraktionen. Es wurde vermutet, dass sich S100A9 zytoplasmatisch sowie zytoskelett- und zellmembranassoziiert in neutrophilen Granulozyten und in geringerer Konzentration auch in Monozyten, nicht aber in Lymphozyten nachweisen lässt. Jeder Leukozytenfraktion der humanen Blutpräparationen wurde nach Zentrifugation eine kleine Probe entnommen, nach dem Blutausstrichprinzip auf einem Objektträger ausgestrichen und anschließend mit May-Grünewald-Giemsa Lösung gefärbt. 5 nicht Teil dieser Arbeit 65
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5.2 Immunfluoreszenzmarkierung<br />
Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmarkierung wurden in dieser Arbeit in zahlreichen Ansätzen<br />
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Proteinen gewonnen. Die Immunfluoreszenzmarkierung von Leukozyten wurde an den<br />
Anfang der Versuchsreihe gestellt. Dieser Vorversuch diente im Weiteren dazu, die<br />
S100A8/A9 Proteine in humanen, formalinfixierten, paraffineingebetteten Pankreasgeweben<br />
zu lokalisieren. Das Wissen über das Aussehen und Fluoreszenzmuster von S100A9 in<br />
Leukozyten war eine wertvolle Hilfe bei der Detektion im Gewebe.<br />
Bei der Etablierung der Fluoreszenzmarkierung von humanen Pankreatitis- und<br />
Pankreasneoplasien stellte die erhebliche Hintergrund- oder Autofluoreszenz der formalinfixierten<br />
Proben eine Herausforderung dar. Bevor mit der gezielten Markierung bestimmter<br />
Proteine begonnen werden konnte, wurde die Lokalisation der Autofluoreszenz auf zellulärer<br />
und subzellulärer Ebene analysiert und quantifiziert, um dann gezielt Methoden zur<br />
Reduktion dieser Hintergrundfluoreszenz zu entwickeln. Erst dann konnten die wertvollen<br />
humanen Präparate für weitere Versuche genutzt werden.<br />
Letztlich wurden 10 Zelllinien, ausgehend von verschiedenen Pankreasneoplasien, mittels<br />
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untersucht und parallel Westen-Blot-Analysen von Zelllysaten und PCR-Tests 5 durchgeführt.<br />
Dieser Ansatz wurde durchgeführt, weil in der Literatur immer noch kontrovers diskutiert<br />
wird, ob diese Proteine überhaupt von Neoplasien exprimiert und sekretiert werden oder ob<br />
ein Anstieg der Proteinkonzentration im Blut eine Folge der Sekretionssteigerung von Zellen<br />
aus umliegenden unveränderten Pankreasarealen ist (Ehrchen 2009; Mukherjee 2009; Nacken<br />
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5.2.1 Ergebnis der Immunfluoreszenzmarkierung der Leukozyten von Mensch und<br />
Ratte<br />
Um S100A8/A9 Proteine mit P0301501 Antikörpern in humanen neutrophilen Granulozyten<br />
und Monozyten zu lokalisieren, wurden die Leukozyten aus dem peripheren Blut gewonnen<br />
und mittels Dichtegradientenzentrifugation getrennt und angereichert. Die Zentrifugation<br />
erlaubte eine Anreicherung von neutrophilen Granulozyten, sowie Monozyten und<br />
Lymphozyten in zwei verschiedenen Fraktionen. Es wurde vermutet, dass sich S100A9<br />
zytoplasmatisch sowie zytoskelett- und zellmembranassoziiert in neutrophilen Granulozyten<br />
und in geringerer Konzentration auch in Monozyten, nicht aber in Lymphozyten nachweisen<br />
lässt. Jeder Leukozytenfraktion der humanen Blutpräparationen wurde nach Zentrifugation<br />
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5 nicht Teil dieser Arbeit<br />
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