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Der 2C11-Reg3A-Antikörper erkennt das rekombinante Protein in den angegebenen
Konzentrationen nicht (Abb. 2). Der H-69-Antikörper erkennt Reg3A in Konzentrationen von
0,18 und 0,6 µg Protein. Eine prominente Bande ist vor allem bei 17 kDa und 0,6 µg Protein
zu erkennen. Schwache Banden sind bei 0,6 µg Protein auch zwischen 34 und 42 kDa
erkennbar sowie bei 0,18µg Protein und 17 kDa (Abb. 2). Bei 3 Minuten
Röntgenfilmentwicklung erkennt dieser Antikörper Reg3A in Konzentration von 0,06 µg
nicht, eine schwache Bande kann durch bedeutend längere Filmentwicklung (Stunden)
sichtbar gemacht werden (Daten nicht gezeigt). Der P0841202-Antikörper erkennt das Protein
in allen angegeben Konzentrationen bei 17 kDa und Dimere bei 34 bis 42 kDa. Bei
Proteinkonzentrationen von 0,18 und 0,6 µg detektiert der Antikörper Trimere bei 57 bis 72
kDa (Abb. 2). Die Bandenposition bei 17 kDa, bei 34 bis 42 sowie bei 52 bis 72 kDa belegen,
dass das rekombinante Reg3A im Vergleich zum prozessierten nativen Protein ein um wenige
kDa größeres Molekulargewicht aufweist (ca. 18 kDa, Multimere: 36, 54 kDa).
5.1.3 Ergebnis der Spezifikation des P0301501-Hühnerantikörpers durch Kopplungsund
Elutions-Versuche
Um zu testen, ob der gegen rekombinantes S100A9 Protein gerichtete P0301501-
Hühnerantikörper humanes natives S100A9 und den S100A8/A9-Proteinkomplex erkennt
und bindet, wurden die Antikörper an eine Matrix gebunden und anschließend mit humanem
EDTA-Blutplasma inkubiert. Ziel war es, durch freie Fab-Fragmente der an die Matrix
gekoppelten Antikörper native Proteine aus dem Plasma zu binden und anschließend unter
verschiedenen Elutionsbedingungen diese Proteine vom Matrix-Antikörperkomplex zu
trennen. Der Nachweis der eluierten Proteine sollte mittels Western-Blot erfolgen.
Nach ersten Elutionsversuchen mit Glycinpuffer konnten im Eluat keine S100A8/A9 Proteine
nachgewiesen werden, lediglich die IgY Antikörperketten konnten von der Matrix gelöst
werden (Abb. 3 A/A‘). Allerdings wurde bei Auftrag der antikörpergekoppelten
Matrixkügelchen auf 16%-Schäggergele nach Versuchsende sowohl der Antikörper als auch
S100A9 Protein in der Probe nachgewiesen (Abb. 3 B/B‘). Daraufhin wurden verschiedene
Elutionsbedingungen und Puffer getestet. Kein Puffer konnte selektiv S100A9 Protein von
den antikörpergekoppelten Matrixkügelchen trennen.
Unter bestimmten Elutionsbedingungen lässt sich zusätzlich zu den Banden der Antikörper
eine Bande zwischen 17 und 10 kDa erkennen, bei der es sich um das 13,2 kDa große
S100A9 Protein handelt (Abb. 3 B/B‘, D, F, H). Unter nicht reduzierenden Bedingungen
(Abb. 3 B) fällt bei Auftrag der beladenen Matrixkügelchen auf, dass schwächere Banden bei
circa 25, 34 und 48 kDa erkennbar sind. Es handelt sich um S100A8/A9 Heterodimere,
Heterotrimere (zwei S100A8 + ein S100A9) und um Tetramere (je zwei S100A8 + A9). Abb.
3 A zeigte einen Blotstreifen mit Glycineluat, der unter gleichen Bedingungen auf der
gleichen Filmfolie entwickelt wurde wie B. Im Glycineluat konnten unter nicht reduzierenden
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