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Abb. 1 zeigt, dass im Anfangsgemisch aus Ei-Homogenat und PBS zahlreiche Proteine
unterschiedlicher Größe vorhanden waren. Schon bei Auftrag dieses Gemischs (T-Spur)
ließen sich aber Banden zwischen 20 und 35 kDa, zwischen 60 und 70 kDa sowie, unter nicht
reduzierenden Bedingungen, um 180 kDa erkennen. Diese Banden wurden mit jedem
weiteren Zentrifugations- und Fällungsschritt deutlicher ausgeprägt und andere Proteinbanden
verschwanden zusehends. Die Banden korrelieren in etwa mit der Größe der leichten (22-35
kDa) und schweren (60-70 kDa) Ketten der insgesamt 180 kDa großen Hühner-IgY (Tizard
2010). Die Präparation des Reg3A/ P0841202 Antiserums erbrachte analoge Resultate (nicht
dargestellt). Die Proteinkonzentration dieses Antikörperserums wurde mittels Bradford-Test
bestimmt und betrug bei P0301501 16,92 mg/ml und bei P0841202 14,33 mg/ml IgY. Die
Menge an spezifischem gegen das Immunogen gerichtete IgY wird mit 1-10% der
Proteinkonzentration, abhängig vom Tag der Eiablage nach der 1. oder 2. Immunisierung,
geschätzt (Eurogentec).
5.1.2 Ergebnis der Spezifikation des P0841202-Hühnerantikörpers durch
Immunpräzipitation
Bei diesem Versuch sollte getestet werden, inwieweit der gegen rekombinantes Reg3A
hergestellte P0841202-Antikörper dieses Protein erkennt und bindet. Hierzu wurde eine
P0841202-Antikörperlösung mit einer Proteinlösung, die rekombinantes Reg3A beinhaltet,
drei Stunden inkubiert. Die Antikörper sollten mittels Vernetzung der Fab-Fragmente durch
Reg3A aus der Lösung präzipitieren. Der Überstand dieser Präzipitation (im folgenden
Präzipitationslösung) wurde anschließend wie ein primärer Antikörper im Western-Blot
eingesetzt.
Rekombinantes Protein wurde auf SDS-Gele aufgetragen und anschließend auf
Nitrozellulosemembran überführt. Diese Nitrozellulosemembran wurde dann mit der
Präzipitationslösung sowie anderen primären Antikörpern inkubiert. Es wurde erwartet, dass
bei Verwendung der Präzipitationslösung im Western-Blot Reg3A-Banden von deutlich
geringerer Intensität auftreten. Reg3A ist im wässrigen Milieu schwer in Lösung zuhalten.
Die Stammlösung enthält Citrat und ist stark sauer. Um eine Beeinflussung der
Antikörperbindung im sauren Citratpuffer auszuschließen, wurde eine Kontrolllösung mit
P0841202-Antikörper in Citratpuffer angesetzt und diese wie ein primärer Antikörper im
Western-Blot verwendet. Abb. 2 C/P084 zeigt, dass die Antikörperbindung im Western-Blot
durch den Citratpuffer nicht beeinflusst wird.
Der P0841202-Antikörper detektierte intensive Banden bei 16, 32 und 48 kDa (Abb. 2 P084).
Die Abb. 2 (IP) zeigt, dass bei Verwendung der Präzipitationlösung eine wesentliche
schwächere Reg3A Bande bei 16 kDa erscheint, während Banden bei 32 und 48 kDa
ausblieben. Der größte Teil der Antikörper ist demnach aus der Präzipitationslösung entfernt
worden und kann das auf der Membran gebundene Protein nicht mehr erkennen. Das Fehlen
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