Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

derselben Firma durchgeführt. Dabei wird CRP durch monoklonale Antikörper an
Latexpartikel gekoppelt und agglutiniert. Die Präzipitation in der Lösung wird photometrisch
bestimmt. Die Ergebnisse von CA19-9, CRP und CEA dieser Testsysteme sind nicht mit
Messwerten anderer Systeme vergleichbar.
4.8.5 Quantitative Bestimmung von S100A8/A9 durch ELISA
Zur Bestimmung der S100A8/A9 Konzentration in Plasma wurde eine 96-Loch
Mikrotiterplatte der Firma Hycult ® Biotech (Human Calprotectin ELISA) und die
beiliegenden Testreagenzien verwendet. Die Mikrotiterplatte war mit monoklonalen
Antikörpern beschichtet, die den S100A8/A9 Komplex binden. Nach dem Sandwich-Prinzip
wurde das vom stationären Antikörper gebundene S100A8/A9 mit einem weiteren
biotinylierten Antikörper markiert welcher dann vom Avidin des Avidin-Peroxidase
Konjugats mit hoher Affinität gebunden wurde. Nach Zugabe von Substrat, das durch das
Peroxidaseenzym farbverändert wurde, Inkubation für eine definierte Zeit, Stoppen der
Enzymreaktion durch pH-Veränderung und photometrisches Messen der Farbreaktion wurde
die Menge an S100A8/A9 Protein semiquantitativ bestimmt. Um die Ergebnisse
quantifizieren zu können, wurde eine Proteinlösung mit bekannter Proteinkonzentration linear
verdünnt und parallel zu den Proben vermessen. Die Messwerte wurden zu einer
Standardkurve verbunden, die annähernde Funktion der Standardkurve ermittelt und dann
anhand dieser Funktion die S100A8/A9 Proteinkonzentration der Proben abgeleitet. Jede
Probe wurde in einem Versuchsansatz 2-mal vermessen und es wurde ein Mittelwert der
beiden Messungen für die Ergebnisauswertung verwendet. Gleiches galt für die
Standardverdünnungen.
Plasmaproben wurden insgesamt 1:60 verdünnt. Zur Probenverdünnung wurden 265 µl
Verdünnungspuffer mit 4,5 µl Probe in einer sterilen unbeschichteten 96-Loch-Platte
gemischt. Der Proteinstandard wurde in einer separaten 96-Well Platte angesetzt und in jeder
Verdünnungsstufe 1:2 verdünnt. Mit einer 12-fach Mikropipette wurden je Loch 100 µl Probe
sowie die Standardreihe auf die antikörperbeschichtetet Testplatte übertragen und 1 Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Testplatte wurde bei jedem Inkubationsschritt mit Folie
abgedeckt. Die S100A8/A9 Proteine wurden jetzt durch die stationären Antikörper aus dem
Plasma gefangen und an der Platte gebunden. Nach der Inkubation wurde die Probenlösung
durch Kopfüberklopfen der Platte entfernt und jedes Loch mit einer 12-fach Mikropipette 4-
mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde je Loch 100 µl einer anti-S100A8/A9-
Antikörperlösung für eine Stunde zugegeben. Diese Antikörper waren biotinyliert und sollten
das bereits gebundene S100A8/A9 Protein markieren. Die Lösung wurde wiederum wie
beschrieben entfernt, es wurde 4-mal mit PBS gewaschen.
Avidin bindet Biotin mit hoher Spezifität und kann an ein Peroxidaseenzym gekoppelt
werden. Die Testplatten wurden also mit einer Avidin-Peroxidasekonjugat enthaltenden
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