Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib
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Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen Kaninchen IgG Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen Hühner IgY Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen Mäuse IgG Alexa Fluor 555, Ziegenantikörper gegen Kaninchen IgG Alexa Fluor 549, Ziegenantikörper gegen Mäuse IgG 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 4.7.6 Immunfluoreszenzmarkierung von humanen Pankreastumorzellen Für die Immunfluoreszenz wurden Zellen von CAPAN-1, CAPAN-2, DAN-G, YAPC, HUP- T3, HUP-T4, HEP G2 vec. PaTu-8988 S, PaTu-8988 T und PaTu-8902 auf Deckgläschen in 12-Loch-Zellkulturschalen kultiviert. Mittels Immunfluoreszenzmarkierung der S100A8/A9 und Reg3A Proteine sollte getestet werden, ob diese Proteine von den Tumorzellen selbst synthetisiert und sezerniert werden. Zur Fixierung wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen mehrfach mit PBS gewaschen. Anschließend wurde je Loch 1 ml 4% Formaldehyd, 120 mM Dinatriumhydrogenphosphat pH 8 zugegeben und für 20 Minuten bei RT und 10 Minuten bei 4°C fixiert. Die Fixierlösung wurde abgesaugt, die fixierten Zellen auf den Deckgläschen 3- mal mit BPS gewaschen und dann 50 Minuten mit Blockpuffer (5% BSA in PBS) inkubiert. Die Inkubation mit Antikörpern fand in den 12-Loch-Zellkulturschalen statt. Je Loch wurde immer 750 µl Puffer mit darin verdünntem Antikörper verwendet. Bei Waschschritten wurde jeweils 1 ml Waschpuffer je Loch verwendet. Der primäre Antikörper wurde in PBS 1% BSA verdünnt und 3 Stunden mit den Zellen inkubiert. Vor Verwendung des Sekundärantikörper wurden die Präparate 6-mal mit PBS + 200 mM NaCl gewaschen und dann 20 Minuten in Blockpuffer geblockt. Alle folgenden Schritte wurden mit möglichst wenig Lichteinfluss ausgeführt um die photosenitiven Sekundärantikörper nicht auszubleichen. Die Sekundärantikörper wurden für 1 Stunde mit den Zellen inkubiert. Die DNA der Zellkerne wurde für 15 Sekunden mit DAPI (0,5µg/ml in PBS) gefärbt. Abschließend wurden die Präparate mehrfach mit PBS gewaschen, die Deckgläschen mit den Zellen nach unten in einen Tropfen Glycerin auf einen Objektträger gelegt und zur mittelfristigen Konservierung mit Nagellack umrandet. 52
Für jede der aufgeführten Zelllinien wurde je ein Ansatz mit folgenden Antikörpern in der angegeben Verdünnung durchgeführt: Antikörperbezeichnung Verdünnung Calgranulin A/B (S100A8/A9) 1:250 P0301501 (S100A9) 1:250 P0841202 (Reg3A) 1:250 RegIIIα/γ 1:250 Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen Hühner IgY Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen Mäuse IgG 1:250 1:250 Mit jeder Zelllinie wurde ein Ansatz ohne Primärantikörper, sondern nur mit dem Fluorophorkonjugierten Antikörper als Kontrolle durchgeführt. 4.8 Quantitative Proteinanalyse im Blutplasma durch ELISA 4.8.1 Probenauswahl und Ziel der Proteindetektion im Blutplasma Um Rückschlüsse von im Blutplasma gemessenen Proteinwerten auf eine bestimmte Erkrankung ziehen zu können, wurden folgende Mindestanforderungen gestellt. Die Proben mussten eindeutig einer der Gruppen Gesund, Chronische Pankreatitis oder Duktales Adenokarzinom zugeordnet werden können. Die Gruppen Chronische Pankreatitis und Duktales Adenokarzinom wurden anhand histologischer Untersuchungen von Pathologen gestellt. Wegen der Diversität der Tumornomenklatur wurden nur Proben verwendet, die nach „WHO-classification of tumors of the exocrine pancreas 2006“ typisiert wurden und der Diagnose „ductal adenocarcinoma“ 8500/3 entsprachen. Proben der Gesunden wurden nach Angaben der Probanden und nach in Augenscheinnahme durch das Fachpersonal bei der Blutspende sowie durch im Rahmen der Blutspende erfolgten Bluttests (Blutstatus, Infektionsdiagnostik) als gesund bezeichnet. Ziel war die Detektion sowohl bereits zur Diagnostik etablierter Proteine sowie der S100A8/A9 und Reg3A Proteine im Blutplasma. Es galt die Frage zu klären, ob eine Synthese- und Sekretionsänderung von Proteinen im Gewebe auch mit veränderten Proteinkonzentrationen im Blutplasma einhergeht. Zudem sollten 53
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Für jede der aufgeführten Zelllinien wurde je ein Ansatz mit folgenden Antikörpern in der<br />
angegeben Verdünnung durchgeführt:<br />
Antikörperbezeichnung<br />
Verdünnung<br />
Calgranulin A/B (S100A8/A9) 1:250<br />
P0301501 (S100A9) 1:250<br />
P0841202 (Reg3A) 1:250<br />
RegIIIα/γ 1:250<br />
Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen<br />
Hühner IgY<br />
Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen<br />
Mäuse IgG<br />
1:250<br />
1:250<br />
Mit jeder Zelllinie wurde ein Ansatz ohne Primärantikörper, sondern nur mit dem Fluorophorkonjugierten<br />
Antikörper als Kontrolle durchgeführt.<br />
4.8 Quantitative Proteinanalyse im Blutplasma durch ELISA<br />
4.8.1 Probenauswahl und Ziel der Proteindetektion im Blutplasma<br />
Um Rückschlüsse von im Blutplasma gemessenen Proteinwerten auf eine bestimmte<br />
Erkrankung ziehen zu können, wurden folgende Mindestanforderungen gestellt. Die Proben<br />
mussten eindeutig einer der Gruppen Gesund, Chronische Pankreatitis oder Duktales<br />
Adenokarzinom zugeordnet werden können. Die Gruppen Chronische Pankreatitis und<br />
Duktales Adenokarzinom wurden anhand histologischer Untersuchungen von Pathologen<br />
gestellt. Wegen der Diversität der Tumornomenklatur wurden nur Proben verwendet, die nach<br />
„WHO-classification of tumors of the exocrine pancreas 2006“ typisiert wurden und der<br />
Diagnose „ductal adenocarcinoma“ 8500/3 entsprachen. Proben der Gesunden wurden nach<br />
Angaben der Probanden und nach in Augenscheinnahme durch das Fachpersonal bei der<br />
Blutspende sowie durch im Rahmen der Blutspende erfolgten Bluttests (Blutstatus,<br />
Infektionsdiagnostik) als gesund bezeichnet. Ziel war die Detektion sowohl bereits zur<br />
Diagnostik etablierter Proteine sowie der S100A8/A9 und Reg3A Proteine im Blutplasma. Es<br />
galt die Frage zu klären, ob eine Synthese- und Sekretionsänderung von Proteinen im Gewebe<br />
auch mit veränderten Proteinkonzentrationen im Blutplasma einhergeht. Zudem sollten<br />
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