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Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen
Kaninchen IgG
Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen
Hühner IgY
Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper gegen
Mäuse IgG
Alexa Fluor 555, Ziegenantikörper gegen
Kaninchen IgG
Alexa Fluor 549, Ziegenantikörper gegen
Mäuse IgG
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4.7.6 Immunfluoreszenzmarkierung von humanen Pankreastumorzellen
Für die Immunfluoreszenz wurden Zellen von CAPAN-1, CAPAN-2, DAN-G, YAPC, HUP-
T3, HUP-T4, HEP G2 vec. PaTu-8988 S, PaTu-8988 T und PaTu-8902 auf Deckgläschen in
12-Loch-Zellkulturschalen kultiviert. Mittels Immunfluoreszenzmarkierung der S100A8/A9
und Reg3A Proteine sollte getestet werden, ob diese Proteine von den Tumorzellen selbst
synthetisiert und sezerniert werden.
Zur Fixierung wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen mehrfach mit PBS
gewaschen. Anschließend wurde je Loch 1 ml 4% Formaldehyd, 120 mM
Dinatriumhydrogenphosphat pH 8 zugegeben und für 20 Minuten bei RT und 10 Minuten bei
4°C fixiert. Die Fixierlösung wurde abgesaugt, die fixierten Zellen auf den Deckgläschen 3-
mal mit BPS gewaschen und dann 50 Minuten mit Blockpuffer (5% BSA in PBS) inkubiert.
Die Inkubation mit Antikörpern fand in den 12-Loch-Zellkulturschalen statt. Je Loch wurde
immer 750 µl Puffer mit darin verdünntem Antikörper verwendet. Bei Waschschritten wurde
jeweils 1 ml Waschpuffer je Loch verwendet. Der primäre Antikörper wurde in PBS 1% BSA
verdünnt und 3 Stunden mit den Zellen inkubiert. Vor Verwendung des Sekundärantikörper
wurden die Präparate 6-mal mit PBS + 200 mM NaCl gewaschen und dann 20 Minuten in
Blockpuffer geblockt. Alle folgenden Schritte wurden mit möglichst wenig Lichteinfluss
ausgeführt um die photosenitiven Sekundärantikörper nicht auszubleichen. Die
Sekundärantikörper wurden für 1 Stunde mit den Zellen inkubiert. Die DNA der Zellkerne
wurde für 15 Sekunden mit DAPI (0,5µg/ml in PBS) gefärbt. Abschließend wurden die
Präparate mehrfach mit PBS gewaschen, die Deckgläschen mit den Zellen nach unten in einen
Tropfen Glycerin auf einen Objektträger gelegt und zur mittelfristigen Konservierung mit
Nagellack umrandet.
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