Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Gewebeschnitte auf den Objektträgern wurden mit einem Fettstift umrandet, so dass sie mit
Antikörperlösung ohne ein Verlaufen der Lösung bedecken werden konnten.
Die Schnitte wurden für 30 Minuten in PBS 5% BSA geblockt, indem die Blocklösung in
kleinen Mengen in den Fettring auf das Gewebe gegeben wurde. Der primäre Antikörper
wurde in PBS 1% BSA verdünnt und wie beim Blocken auf die Gewebeschnitte gegeben.
Während der einstündigen Inkubation wurden die Präparate in einer kleinen, mit feuchtem
Papier ausgelegten, geschlossenen Plastikschale aufbewahrt, um ein Austrockenen der
Präparate zu verhindern. Die Block- und Antikörperpuffer wurden von den Geweben
abgesaugt, bevor der gesamte Objektträger in PBS gegeben und 6-mal für 5 Minuten
gewaschen wurde. Der sekundäre Antikörper wurde ebenfalls in PBS 1% BSA verdünnt und
wie beim primären Antikörper beschrieben inkubiert. Alle Arbeiten mit sekundären
Antikörpern fanden mit möglichst wenig Lichteinfluss statt.
Wenn eine DNA Färbung durchgeführt werden sollte wurden die Präparate jetzt für 15-30
Sekunden mit DAPI-Lösung (0,5µg/ml in PBS) inkubiert.
Jetzt folgten 3 Waschschritte mit PBS für 5 Minuten, zwei kurze Waschschritte im Aq. dest.
und dann wurden die Gewebe unter einem Tropfen Glycerin mit einem Deckgläschen
eingedeckelt und mit Nagellack umrandet.
Die Antikörper wurden in der Immunfluoreszenz in folgender Konzentration eingesetzt:
Verdünnung der Antikörper für die Immunfluoreszenz auf Gewebeschnitten
Antikörperbezeichnung
Verdünnung
Calgranulin A (MRP 8) 1:10 bis 1:100
Calgranulin B (MRP14) 1:10 bis 1:100
Calgranulin A/B (MRP 8/14) 1:10 bis 1:100
P0301501 (MRP8) 1:500
P0841202 (Reg3A) 1:500
RegIIIα 1:50 bis 1:100
RegIIIα/γ 1:50 bis 1:100
Reg3A 1:50 bis 1:100
Synaptobrevin 2 (VAMP-2) 1:100
Trypsinogen 1:200
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