Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

die Gruppen „chronische Pankreatitis“ und „Pankreastumor“ eingeteilt worden. Beide
Gruppen setzten sich aus Proben höchst unterschiedlicher histologischer Bilder und
Erkrankungsstadien zusammen. Obwohl die Gruppe der „Pankreastumoren“ histologisch
näher klassifiziert worden ist, war die Fallzahl der einzelnen Tumortypen zu klein, um sie in
Einzelgruppen zusammenzufassen. Bei den Gewebeproben mit histologisch unverändertem
Pankreasgewebe handelte es sich nicht um Pankreasbiopsien gesunder Probanden, sondern
um Probanden mit Pankreastumoren bei denen Gewebe in unveränderten Pankreasarealen
entnommen wurde.
Die Fixierung der Präparate in Formaldehyde fand direkt nach der Probenentnahme in den
entsprechenden Kliniken nach den jeweils hauseigenen Protokollen statt. Im allgemeinen
werden Bioptate abhängig von ihrer Größe für 12-24 Stunden in eine gepufferte 4-8%
Formaldehyd-Lösung gegeben und anschließend in eine PBS-Lösung überführt um
Überfixierung zu vermeiden. Der Formaldehyd reagiert bei der Fixierung mit den
Aminogruppen der Proteine und vernetzt diese. Die Gewebezersetzung durch zelleigene
Enzyme nach Aufhebung der Zellkompartimentierung wird somit gestoppt. Anschließend
werden die Präparate in kleinen Würfeln in heißes Paraffin eingelegt und können nach dem
Abkühlen bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden.
Für die Immunfluoreszenz wurden diese Paraffinblöcken mit Eis-Spray oder durch Abkühlen
bei -20°C für 30 Minuten verhärtet und dann mit einem feinen Schneidegerät (Microtom) 2-4
µm dünne Schnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden mit einem Pinsel auf die
Wasseroberfläche eines 40°C warmen Wasserbades gegeben. Das leicht verflüssigte Paraffin
mit dem darin enthaltenen Gewebe wurde auf einen Objektträger aufgebracht der im
Wasserbad unter das schwimmende Präparat gelegt wurde und für 12 Stunden bei 37°C
getrocknet.
Für anschließende Färbungen musste das Paraffin aus dem Gewebe entfernt werden. Für
dieses Entparaffinieren wurden die Objektträger 3 mal 10 Minuten in reinem Xylol inkubiert.
Dann wurden die Schnitte für die Rehydrierung in Ethanol-Lösungen mit absteigender
Ethanol Konzentration (100%; 96%; 70%) für je 5 Minuten inkubiert und in PBS überführt.
Viele Epitope der Proteine sind durch die Formalinfixierung und Paraffineinbettung für die
Antikörper ohne weitere Behandlung nicht erreichbar. Deshalb können die Präparate in einem
als Demaskierung bezeichneten Schritt weiterbehandelt werden. Die optimale Methode richtet
sich unter anderem nach der Art der Fixierung und ist abhängig vom jeweiligen primären
Antikörper. Es wurde im Standartversuch ein Tris/ EDTA-Demaskierungspuffer pH 9
verwendet (EnVision FLEX), in angegebenen Einzelfällen kam ein kupfersulfathaltiger
Citratpuffer pH 4,8 (BUF027C) zum Einsatz. Für die Demaskierung wurden die Schnitte in
heißen, aber nicht mehr kochenden Demaskierungspuffer gegeben. Dann wurden sie in einer
abgedeckten Küvette für 35 Minuten in einen kalten Dampfgarer verbracht und anschließend
bei Raumtemperatur langsam abgekühlt. Die Präparate wurden wieder in PBS überführt. Die
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