Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib
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erhöhte Salzkonzentration sollte den Wascheffekt verstärken. Alle folgenden Schritte wurden mit möglichst wenig Lichteinfluss ausgeführt um die photosenitiven Sekundärantikörper nicht auszubleichen. Die Sekundärantikörper wurden 1:450 verdünnt eingesetzt und für 1 Stunde mit den Zellen inkubiert. Die DNA der Zellkerne wurde für 15 Sekunden mit DAPI (0,5 µg/ml in PBS) gefärbt. Abschließend wurden die Präparate mehrfach mit PBS gewaschen, die Deckgläschen mit den Zellen nach unten in einen Tropfen Glycerin auf einen Objektträger gelegt und zur mittelfristigen Konservierung mit Nagellack umrandet. 4.7.3 Methoden zur Verringerung der Eigenfluoreszenz von Pankreasgewebeproben Da Eigenfluoreszenz die Auswertung von fluoreszenzmarkierten Pankreasgewebeproben erschwert oder sogar unmöglich macht, wurden einige in Literatur beschriebene Verfahren zur Unterdrückung der Eigenfluoreszenz durchgeführt. Kupfersulfat-Behandlung Kupfer-II-sulfat in Konzentrationen von 10 bis 100 mM wurde in Anlehnung an Schnell (Schnell 1999) in Ammoniumazetat gelöst. Die Präparate wurden nach dem Demaskieren für 60-90 Minuten im Dunkeln mit der hergestellten Lösung inkubiert und anschließend mehrfach in BPS gewaschen. Jetzt wurde die Immunfluoreszenz-Markierung wie beschrieben durchgeführt. Toluidin Blau-Behandlung Die Präparate wurden nach dem Entparaffinieren für 8 Stunden in 0,1% Toluidin Blau 0 (m/v) in 70% Isopropylalkohol gefärbt, dann kurz in 70%igem Isopropylalkohol gewaschen und in PBS überführt. Anschließend wurden die Gewebeproben demaskiert und es fand wie beschrieben die Fluoreszenzmarkierung statt. Sudan Schwarz B-Behandlung In Anlehnung an Schnell (Schnell 1999) wurde Sudan Schwarz in Konzentrationen von 0,1% bis 10% (m/v) in 70% Ethanol für 5 Minuten im Anschluss an die Immunfluoreszenzmarkierung durchgeführt. Überschüssiges Sudan Schwarz wurde in 70%igem Ethanol abgewaschen. Weiterhin wurde ein Protokoll von Viegas (Viegas 2007) verwendet. Hier wurden die Präparate nach dem Demaskieren für 20 Minuten in 0,1% (m/v) Sudan Schwarz in 70% Ethanol inkubiert. Die spezifische Fluoreszenzmarkierung wurde in verschiedenen Versuchen vor und nach Sudan Schwarz Behandlung durchgeführt. UV-Bestrahlung Vor dem Entparaffinieren wurden die Gewebeproben für 2 Stunden mit einem 302 nm UV- Transilluminator im Abstand von 4 mm zur Lichtquelle bestrahlt, anschließend wie beschrieben entparaffiniert, demaskiert und fluoreszenzmarkiert. 48
4.7.4 Optimierung der Sudan Schwarz-Färbung zur Verringerung der Eigenfluoreszenz von Pankreasgewebeproben Ansetzen der Sudan Schwarz Lösung Um Präzipitate und Zersetzung der Sudan Schwarz Lösung zu vermeiden wurde die Lösung wöchentlich frisch angesetzt und im Dunkeln aufbewahrt. Zur Verbesserung der Löslichkeit wurde statt Ethanol Isopropanol verwendet. 0,25% Sudanschwarz (m/v) wurde in 70%iges Isopropanol gegeben und 12 Stunden im Dunkeln mit einem Magnetrührgerät bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Gefäß gerührt. Unlösliche Partikel wurden durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 20 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Whatman ® -Papierfilter Nr. 595½ gegossen und anschließend bis zur Verwendung unter Lichtund Luftabschluss maximal eine Woche aufbewahrt. Das intensive Filtern der Lösung sollte das Auftreten von bei der Mikroskopie störenden Sudan Schwarz-Präzipitaten auf den Präparaten verhindern, welche bei Durchführung anderer Protokolle auftreten. Färben der Gewebeproben Die Gewebeproben wurden vor der Immunfluoreszenz-Markierung mit Sudan-Schwarz gefärbt. Nach dem Demaskieren wurden die Objektträger in einer geschlossenen Glasküvette für 90 Minuten in die Sudan Schwarz Lösung gegeben. So wurde ein Verdampfen des Isopropanol und das damit verbundene Auftreten von Sudan Schwarz-Präzipitaten auf den Präparaten verhindert. Anschließend wurden die Objektträger kurz in 70%iges Isopropanol gegeben und überschüssiges Sudan Schwarz wurde mit einem fusselfreien Tuch von der Rückseite und den freien Flächen des Objektträgers entfernt. Die Schnitte wurden in PBS überführt und wie beschrieben fluoreszenzmarkiert. Sofern die Antikörper- und Blockpuffer als wässrige Lösungen ohne Zusatz von Detergenzien verwendet werden, wäscht sich die Sudan Schwarz Färbung nicht aus. Eindecken der Objektträger Als Eindeckmedium wurde Glycerin verwendet. Aufgrund der Fettlöslichkeit von Sudan Schwarz sollen möglichst fettunlösliche Eindeckmedien verwendet werden. Bei Verwendung von Glycerin kann nach einigen Tagen das Auftreten von Sudan Schwarz-Präzipitaten im Eindeckmedium beobachtet werden. 4.7.5 Immunfluoreszenzmarkierung von Pankreatitis- und Pankreastumorgewebeproben Mittels Immunfluoreszenzmarkierung der Reg3A und S100A8/A9 Proteine von formaldehydfixierten, paraffineingebetteten humanen Pankreasgeweben sollten Hinweise auf die Lokalisation und das Sekretionsmuster der Proteine bei Patienten mit chronischer Pankreatitis und Pankreastumoren gewonnen werden. Die Proben sind durch Pathologen in 49
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4.7.4 Optimierung der Sudan Schwarz-Färbung zur Verringerung der Eigenfluoreszenz<br />
von Pankreasgewebeproben<br />
Ansetzen der Sudan Schwarz Lösung<br />
Um Präzipitate und Zersetzung der Sudan Schwarz Lösung zu vermeiden wurde die Lösung<br />
wöchentlich frisch angesetzt und im Dunkeln aufbewahrt. Zur Verbesserung der Löslichkeit<br />
wurde statt Ethanol Isopropanol verwendet. 0,25% Sudanschwarz (m/v) wurde in 70%iges<br />
Isopropanol gegeben und 12 Stunden im Dunkeln mit einem Magnetrührgerät bei<br />
Raumtemperatur in einem geschlossenen Gefäß gerührt. Unlösliche Partikel wurden durch<br />
Zentrifugieren bei 3000 x g für 20 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen<br />
Whatman ® -Papierfilter Nr. 595½ gegossen und anschließend bis zur Verwendung unter Lichtund<br />
Luftabschluss maximal eine Woche aufbewahrt. Das intensive Filtern der Lösung sollte<br />
das Auftreten von bei der Mikroskopie störenden Sudan Schwarz-Präzipitaten auf den<br />
Präparaten verhindern, welche bei Durchführung anderer Protokolle auftreten.<br />
Färben der Gewebeproben<br />
Die Gewebeproben wurden vor der Immunfluoreszenz-Markierung mit Sudan-Schwarz<br />
gefärbt. Nach dem Demaskieren wurden die Objektträger in einer geschlossenen Glasküvette<br />
für 90 Minuten in die Sudan Schwarz Lösung gegeben. So wurde ein Verdampfen des<br />
Isopropanol und das damit verbundene Auftreten von Sudan Schwarz-Präzipitaten auf den<br />
Präparaten verhindert. Anschließend wurden die Objektträger kurz in 70%iges Isopropanol<br />
gegeben und überschüssiges Sudan Schwarz wurde mit einem fusselfreien Tuch von der<br />
Rückseite und den freien Flächen des Objektträgers entfernt. Die Schnitte wurden in PBS<br />
überführt und wie beschrieben fluoreszenzmarkiert. Sofern die Antikörper- und Blockpuffer<br />
als wässrige Lösungen ohne Zusatz von Detergenzien verwendet werden, wäscht sich die<br />
Sudan Schwarz Färbung nicht aus.<br />
Eindecken der Objektträger<br />
Als Eindeckmedium wurde Glycerin verwendet. Aufgrund der Fettlöslichkeit von Sudan<br />
Schwarz sollen möglichst fettunlösliche Eindeckmedien verwendet werden. Bei Verwendung<br />
von Glycerin kann nach einigen Tagen das Auftreten von Sudan Schwarz-Präzipitaten im<br />
Eindeckmedium beobachtet werden.<br />
4.7.5 Immunfluoreszenzmarkierung von Pankreatitis- und Pankreastumorgewebeproben<br />
Mittels Immunfluoreszenzmarkierung der Reg3A und S100A8/A9 Proteine von<br />
formaldehydfixierten, paraffineingebetteten humanen Pankreasgeweben sollten Hinweise auf<br />
die Lokalisation und das Sekretionsmuster der Proteine bei Patienten mit chronischer<br />
Pankreatitis und Pankreastumoren gewonnen werden. Die Proben sind durch Pathologen in<br />
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